生物信息学法筛选催化茶黄素合成的天然多酚氧化酶

利用生物信息学方法从天然植物中筛选天然PPO酶源. 用PPO保守序列从Uniport中检索到529条植物源PPO,除去重复的和不完整的序列后,得到178条PPO序列. 用同源建模法,以甘薯PPO晶体结构（1BUG）为模板,构建各PPO的三维结构模型,经Procheck和Verify3D评价后,获得163个优质的PPO三维结构. 用TM-score(空间拓扑)和RMSD（结构叠合）对163个PPO与茶PPO（A6N8J4）的三维结构进行了相似性比较. 用Autodock Vina将 163个PPO与茶中四种主要儿茶素进行分子对接,根据酶与底物结合的亲和力（binding affinity）预测各PPO的活性,发现酶与底物的亲和力与酶的一级结构序列同源性和酶的三维结构的重叠度之间无直接关系. 从潜在的10种高PPO活性的植物材料中提取PPO、测定其茶黄素转化活性. 10种植物材料中均有PPO活性,其中沙梨和甘薯的PPO活性最高,且高于茶叶PPO活性. 甘薯资源极其丰富,可用于茶黄素的工业合成. 本研究表明,利用生物信息学法可以从大量酶的序列信息中成功筛选出高活性的酶,与传统的酶活性筛选法比,可大大提高筛选范围和效率.     

计算机辅助的豆壳过氧化物酶分子序列分析

从生物信息学角度 ,利用生物大分子数据库 (GENEBANK、SWISS PROT和PDB)及软件技术 (DNASIS和PROSIS)对豆壳过氧化物酶分子进行了序列分析及结构预测 ;通过与其它植物及真菌来源的过氧化物酶的比较研究 ,分析了结构保守性与功能域的关系 ,从分子水平探讨了植物过氧化物酶超家族的活性位点局部保守序列、折叠模式及序列结构域特征 .     

菊芋多酚氧化酶的酶学性质

为了解菊芋提取物氧化变色的机理,用分光光度法分别研究了以邻苯二酚为底物的酶促褐变反应动力学和pH值、温度、底物浓度、酶浓度对该反应的影响,以及不同底物对多酚氧化酶活性的影响,揭示了菊芋多酚氧化酶(PPO)的基本酶学性质.结果表明:菊芋PPO催化邻苯二酚氧化反应的最适pH值为4.8,最适温度为35℃;菊芋PPO的热稳定性差,85℃以上加热处理5min就可使其大部分失活;菊芋PPO酶促褐变反应动力学符合米氏方程所描述的规律,相应的动力学参数Km=0.013 mol/L,Vmax=7.5 mmol/s.菊芋PPO的活性随酶浓度的增加而增大,酶的添加量超过0.8mL后,增速逐步减小;菊芋多酚氧化酶对邻位多酚的氧化具有专一性.     

橡椀单宁降解酶特性的研究

借助于没食子酸丙酯为模型化合物作为底物,对一株能抵抗橡椀单宁(鞣花类单宁)生物毒性并能有效降解这种单宁的菌株的降解特性进行了研究。结果表明这株菌不仅具有单宁酶的活性,而且具有多酚氧化酶（PPO）的活性。通过对不同底物对内胞霉PPO酶促反应速度的影响研究证实橡椀单宁的降解不仅与单宁酶有关还与多酚氧化酶有关。     

黄花梨多酚氧化酶特性及防褐变处理

从黄花梨中提取多酚氧化酶,并对其特性进行研究.以邻苯二酚为底物采用分光光度法测定了不同pH值、温度、底物浓度、酶浓度及抑制剂对PPO活性影响.结果表明:黄花梨PPO具有同工酶.黄花梨PPO的最适pH值为6.0,最适温度为25℃,并在此基础上考察了抗坏血酸、柠檬酸、亚硫酸氢钠和L-半胱氨酸对PPO的褐变抑制效果.     

计算机辅助物豆壳过氧化物酶分子序列分析

从生物信息学角度,利用生物大分子数据库（ＧＥＮＥＢＡＮＫ、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ和ＰＤＢ）及软件技术（ＤＮＡＳＩＳ和ＰＲＯＳＩＳ）对豆壳过氧化物酶分子进行了序列分析及结构预测;通过与其它植物及真菌来源的过氧化物酶的比较研究,分析了结构保守性与功能域的关系,从分子水平探讨了植物过氧化物酶超家族的活性位点局部保守序列、折叠模式及序列结构域特征。     

胱氨酸与烟草多酚氧化酶作用机理的探讨

通过酶活性测定和紫外-可见光谱研究了胱氨酸对烟草多酚氧化酶(简称PPO)活性的影响.结果表明,胱氨酸对烟草多酚氧化酶有抑制作用,其机制是胱氨酸中的硫醚与烟草多酚氧化酶活性中心的铜离子配位,但底物或产物抑制胱氨酸与多酚氧化酶的结合;胱氨酸还可以与酶促反应产物结合生成无色复合物.胱氨酸抑制烟草PPO的过程可分为两步:首先胱氨酸与烟草PPO结合生成中间产物,中间产物仍具有一定的酶活性;然后中间产物结构进一步发生变化,成为无活性的形式.     

明胶酶解物抗凝血活性的检定及其机理的探讨

明胶经胰蛋白酶水解 ,其酶解产物具有抗凝血活性 .采用生物信息学方法 ,从胶原蛋白的氨基酸序列入手 ,运用序列比对软件 ,比对胶原蛋白与已知的抗凝血因子之间的一级结构和二级结构 ,为其相似的功能寻找序列和结构上的共同点 ,探讨明胶酶解物的抗凝血机理 .     

甘薯膨胀素在毕赤酵母中的表达及在纤维素酶解中的协同作用

本研究构建了真核表达载体并表达具生物学活性的甘薯膨胀素.根据Genebank上甘薯膨胀素基因序列(No.DQ515800.1)设计引物,从甘薯cDNA中扩增出了IbEXP基因,并构建表达载体pGAP-IbEXP转化毕赤酵母.以酸处理后的玉米秸秆为纤维素底物,使用该菌株的发酵液,可以促进纤维素酶对纤维素的酶解,使葡萄糖的产量提高24%～54%.     

刺嫩芽中多酚氧化酶活性的影响因素研究

研究了pH、温度以及抑制剂与激活剂对从新鲜刺嫩芽中提取出的多酚氧化酶（PPO）活性的影响,及温度对其热稳定性的影响.结果表明：以邻苯二酚为底物,该酶的最适pH为4.4,在pH 4.0-4.8内有较高的稳定性;最适温度为12.5℃,在30℃以上失活;70℃热处理90 s可以钝化PPO的活性;抗坏血酸（Vc）,L-Cys对PPO有抑制作用,SDS对PPO有激活作用.     

甘蔗多酚氧化酶酶学特性及应用研究

对甘蔗多酚氧化酶(PPO)进行提取和部分纯化,研究了PPO的酶学特性.结果表明:以邻苯二酚为底物,甘蔗PPO酶促反应米氏常数Km为54.4 mmol/L,米氏方程:V=1250[S]/(54.4+[S]).蔗汁中邻位多酚类物质是甘蔗PPO的最适反应底物.最适反应条件为:pH值6.2,40℃;该酶在pH5.8和温度低于3℃0时较稳定.试验了6种甘蔗PPO抑制剂:单独使用柠檬酸、草酸、乙二胺四乙酸(EDTA)对PPO活力抑制效果不明显;70 mg/L亚硫酸氢钠、110 mg/L抗坏血酸、120 mg/L硫代硫酸钠可完全抑制PPO活力.现行甘蔗提汁的浸渗工艺较适合蔗汁酶促褐变反应,应作相应的调整.     

影响金针菇多酚氧化酶活性因素研究

目的 从金针菇中提取多酚氧化酶,并对其特性进行研究.方法 采用分光光度法研究温度、pH、抑制剂对金针菇多酚氧化酶活力的影响.结果 以邻苯二酚为底物,金针菇多酚氧化酶(Polyphenoloxidase fromFlammulina velutipes,FVPPO)的酶促褐变产物在可见光波长295 nm处有最大吸收峰;在pH为5.0～6.0范围内酶活力较大;在20～40℃的范围内随着温度升高,酶活性逐渐增强;在40℃时PPO活性最强;抗坏血酸、柠檬酸、EDTA-2Na对金针菇多酚氧化酶的活性都有抑制作用,在同浓度下,对金针菇PPO活性的抑制效果次序为抗坏血酸>柠檬酸>EDTA-2Na.结论 金针菇多酚氧化酶的最适pH为6.0,最适温度为40℃,抗坏血酸对金针菇PPO活性的抑制作用最强.     

滇西地区10种植物抗疟活性研究

目的:研究10种采自滇西地区植物的抗疟活性,为从天然产物中寻找新的抗疟成分或先导化合物奠定基础.方法:将植物样品粉碎,依次用75%乙醇、水回流提取,提取物经冷冻干燥后,采用β-羟高铁血红素形成抑制试验进行筛选,以IC50值评价其活性.结果:在供试的10种植物样品中,梁王茶地下部分、球花报春花、糙毛杜鹃、西域蜡瓣花等4种植物粗提物具有不同程度的β-羟高铁血红素形成抑制活性,相关提取物的IC50值均大于1 388.9μg/mL.结论:梁王茶、球花报春花、糙毛杜鹃、西域蜡瓣花4种植物具有一定的抗疟活性,值得深入研究.     

Trichoderma reesei纤维素水解酶的糖苷合成性质

通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(从(Trichoderma reesei天然纤维素水解酶中分离纯化得到了一种相对分子质量约为65 000的蛋白组分.分别以pNP-Glu、pNP-Gal、oNP-Gal和Avicel作为底物,均检出该组分的水解活性.此外该酶对CMC-Na有可被测出的弱活性.以pNP-Glu为底物,45℃时,其水解酶性质的米氏常数Km=3.04 mg/mL,Vmax=3.77 μmol/min.用DNS法和对硝基苯酚法(仅对含有对硝基酚结构的底物pNP-Glu、pNP-Gal和oNP-Gal)分别检测了在180 min反应时段内产物还原糖和对硝基苯酚的含量变化,结果显示在封闭的反应体系中有明显的可逆反应存在,并出现了周期性振荡的特征,有糖苷合成活性的表现,水解产生还原糖和对硝基苯酚的量,呈现出分别为25.43±8.34 min和36.25±2.50 min的含量增减振荡周期.与此同时,为了证实该酶糖苷合成活性的存在,以葡萄糖作为底物与酶反应,得到了7.00±4.83 min的葡萄糖含量周期性波状振荡结果.对底物为pNP-Glu反应15 min后的产物作乙酰化处理GC/MS分析,结果产物中有含二糖结构的产类型,揭示了这个水解酶的糖苷合成的特点.这是首次从Trichoderma reesei纤维素水解酶中分离得到了具有糖苷合成活性的酶.     

易错PCR法定向进化D-海因酶的初步研究

D-海因酶是生物转化D-型氨基酸的关键酶,在一定浓度M n2 存在下,经易错PCR法重复扩增,产物构建成pET-HDT重组子,并建立突变体文库.经筛选获得了内源DNA序列变异的变异株.进化酶催化底物海因水解的活性为亲本重组酶的1.3倍,催化底物对羟基苯海因水解的活性为亲本重组酶的2.4倍.     

水杨酸对黄芪愈伤组织代谢产物中几种E活性的影响

目的探讨水杨酸对黄芪愈伤组织代谢产物中几种E活性的影响.方法通过添加不同浓度的水杨酸(SA)处理黄芪愈伤组织,并从提取物中检测几种酶活性的变化.结果黄芪愈伤组织代谢产物中的过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨解氨酶(PAL)的活性均随水杨酸(SA)体积质量和培养时间的改变而改变,随着SA浓度的增加可提高PAL,POD及PPO的活性,但抑制CAT的活性.结论 SA体积质量在0.01 mg/L时抑制CAT活性最明显;SA体积质量在0.1 mg/L和1 mg/L时POD和PPO活性最高,并且均在36 h出现最高峰.     

微水相酶催化乙酸三甲基硅甲酯的氨解反应

从不同来源的脂肪酶中筛选出能催化非天然底物－－乙酸三甲基硅甲酯的氨解反应且具有较高活性的脂肪酶，并首次探讨了氨源，有机介质，反应初始水活度和温度对该酶促反应的影响。     

天然活性成分生物转化的微生物、特异酶及其应用

介绍了天然活性成分生物转化的微生物、特异酶以及其应用.中草药等植物中含有的主要天然活性成分,人体难吸收、活性低.为了得到易吸收、高活性的天然有效成分,筛选了一批新微生物,发现一批新型特异的天然成分转化酶;研究了生物转化制备高活性天然成分单体、异构体混合物组、活性中草药制备.     

不同染色剂对荔枝胚性愈伤组织酯酶同工酶显色的影响

以α-茶酯醋酸(α-NA)和β-茶醋醋酸(β-NA)为底物，以坚牢兰B盐和坚牢兰RR盐为偶联剂，用聚丙烯酰胺垂直凝胶电泳技术研究了荔枝离体培养物的电泳显色。结果为：少数酶带只能用α-NA显色；绝大多数酶带可用α-NA或β-NA显色；用混合底物同时显色，较一些单独用α-NA或β-NA能显色的酶带的相对染色强度降低；用坚牢兰B盐与坚牢兰RR盐为偶联剂相比，某些酶带的相对染色强度增加。表明，各电泳酶带染色强度的相对强弱不一定反应各酶本身活性的相对高低。     

重组抑肽酶的表达纯化和活性测定

抑肽酶是一种用途广泛的丝氨酸蛋白酶抑制剂.用基因重组技术将化学合成的抑肽酶基因插入表达载体pET28a,并转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导后,表达产物以包涵体形式存在于菌体内包涵体纯化后经复性及CM-阳离子交换层析后,从每升培养液可获得2.4 mg抑肽酶,纯度可达90%.活性测定结果显示,重组抑肽酶可竞争性抑制纤溶酶对小分子底物S2251的水解活性.抑制常数(Ki)为(0.6±0.3)nmol/L,与天然抑肽酶的抑制活性相似.