HIV-1跨膜蛋白gp41的生物学功能——潜在的gp41细胞受体的研究

几年来，ＨＩＶ－１跨膜蛋白ｇｐ４１的生物学功能研究又取得了重大进展，几个研究小组提供的实验证据证实ｇｐ４１有一个潜在的细胞受体，一个重组的ｇｐ４１胞外区多肽（ａａ５３９－６８４）以及ｇｐ４１的免疫抑制多肽（ａａ５８３－５９９）的能够连接人Ｂ淋巴细胞和单核细胞２，仅能较弱的连接Ｔ淋巴细胞，我们发现ｇｐ４１有２个细胞结合位点（ａａ５８３－５９９和ａａ６４１－６７５）。     

鉴定HIV-1包膜蛋白gp41的近膜端外部区与其 N端三聚体结构域之间的相互作用: 病毒融合相关的潜在机制

人类Ⅰ型免疫缺陷病毒(human immunodeficiency class I, HIV-1)包膜蛋白gp41的近膜端外部区(membrane proximal external region, MPER)在HIV-1的各个分化株之间相当保守, 这暗示MPER区对于病毒的生存和侵染均具有十分重要的作用. 目前研究表明, 两个靶向HIV-1且具有最广泛中和活性的单抗2F5和4E10, 都特异地识别该区域, 进而有效地抑制包膜蛋白介导的病毒膜融合过程. 我们先前的研究表明, 4E10抗体表位的抗原性和免疫原性会随着gp41融合核心区域的结构调整而发生显著的改变, 提示在gp41蛋白的MPER区与融合核心区之间很有可能存在某种联系, 并与gp41介导的膜融合过程相关. 本研究利用各种不同的gp41融合核心区衍生多肽, 检测了4E10表位多肽(D4E10P)与它们之间的反应性. 其中, 具有gp41蛋白核心区N-trimer结构的多肽(N-trimer-6HB)显示出很强的结合活性. 进一步对N-trimer-6HB多肽进行噬菌体文库筛选, 发现 4E10表位上一个短的模体序列(WF)很有可能对gp41的N-trimer和MPER区之间的相互作用发挥了至关重要的作用, 导致MPER区以潜在的方式参与病毒包膜和靶细胞膜间的融合过程.     

不同构象状态HIV-1 gp120分子运动特征及构象转换能力研究

人类免疫缺陷病毒HIV-1包被蛋白gp120通过与宿主细胞表面受体CD4和辅助受体CCR5/CXCR4发生相互作用而侵染细胞. CD4结合状态的HIV-1 gp120核心与CD4结合前状态的SIV gp120核心结构已经被X射线晶体衍射技术所测定. 但是, 静态的晶体结构不足以阐明gp120动态结构特征及其构象转化能力. 用同源模建技术构建不同功能状态的gp120结构模型并用CONCOORD模拟方法生成它们的结构装配体, 最后利用本质动力学算法提取、分析前4个本征向量所描述的分子运动特征. 结果表明, gp120的主要运动模式表现为内部结构域、外部结构域、桥片层以及V3环之间的旋转/扭曲、绕曲/关闭、延长/压缩运动或这些运动方式的组合, 这些运动模式与受体结合以及HIV-1病毒免疫耐受性有关. 进一步利用本质亚空间重叠算法评估gp120不同构象间的相互转换能力, 结果表明, CD4结合前状态(unliganded) gp120向复合物状态(CD4-complexed)转化的能力强于向移除CD4复合物状态(CD4-free)转化的能力, 而CD4-free gp120比CD4-complexed gp120具有更强的向结合前状态转化的能力. 本研究揭示了gp120动态结构与功能的关系, 并为抗HIV药物设计提供了参考和帮助.     

一种新型多肽类HIV-1进入抑制剂

近年来，阻止HIV-1进入宿主细胞已经成为研究和开发新型抗HIV-1药物的热点。我们根据HIV-1表面膜蛋白gp120与受体CD4以及中和抗体17b的共结晶结构，设计了一系列17b的多肽类似物。采用固相多肽合成技术合成多肽P20，并检测了P20对于HIV-1进入人外周血单核细胞的影响。实验证明P20能够有效抑制以CCR5为辅助受体的HIV-1进入人外周血单核细胞，对以CXCR4为辅助受体的HIV-1并没有明显抑制作用。由此可以推断，P20可以特异性的与HIV-1表面膜蛋白结合，阻断HIV-1与辅助受体CCR5的结合，从而抑制HIV-1的进入。该分子为开发新型抗HIV-1药物提供了有效的先导物。     

EIAV gp90与HIV gp120一个结构基序的相似性

马传染性贫血病病毒(EIAV)与艾滋病病毒(HIV)同属于逆转录病毒科慢病毒属. EIAV和HIV在基因的结构与组成上有很大的相似性. Hotzel提出EIAV gp90的2个可变区及附近氨基酸可能与HIV gp120的V1, V2和连接片层(bridging sheet)采取了相同的结构. 这个区域对应于EIAV gp90的V3和V4区及附近区域. 本文在Hotzel推测的基础之上, 进一步分析比较了这个区域在N-糖基化位点与抗原表位的分布两方面与HIV gp120的相似性. 结果显示, EIAV gp90的V3和V4区及附近区域与HIV gp120的对应区域无论在N-糖基化位点的位置与数目, 还是抗原表位的分布方面都显示了高度的相似性. EIAV gp90的V1,V2及附近区域很有可能采取了与HIV gp120的V1,V2及连接片层相同的结构.     

同源于hMIP-1a 的vMIPa 对人趋化因子受体的作用

HIV感染靶细胞须以人CD4+白细胞膜上的趋化因子受体为共受体, 与此共受体结合的趋化因子类似物可阻止HIV进入靶细胞. 实验目的是了解与人趋化因子单核细胞炎性蛋白-1a (MIP-1a)同源的人疱疹病毒8 K6基因编码产物vMIPa 是否具有结合人趋化因子受体的功能. 首先用蛋白质同源分析及蛋白空间结构模拟等对比vMIPa与人趋化因子的结构异同, 用PCR扩增出K6片段, 克隆于哺乳类细胞表达载体, 转染于NIH3T3细胞, 得到条件培养液. 然后将K6基因在大肠杆菌中表达, 得表达产物vMIPa. 结果显示转染K6的NIH3T3细胞含有vMIPa单一分子量的mRNA, 此转染细胞的条件培养液及大肠杆菌表达纯化的vMIPa可与人趋化因子125I-hMIP-1a竞争结合外周血单核细胞的CCR5受体, 而且此条件培养液及vMIPa不引起外周血单核细胞对ICAM-1的黏附反应. 研究证实K6编码产物vMIPa与CCR5结合但不引起细胞黏附反应, 即封闭HIV的CCR5共受体, 提示有用于防治HIV/艾滋病的可能性.     

同源于hMIP-1α的vMIPα对人趋化因子受体的作用

HIV感染靶细胞须以人CD4+白细胞膜上的趋化因子受体为共受体, 与此共受体结合的趋化因子类似物可阻止HIV进入靶细胞. 实验目的是了解与人趋化因子单核细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)同源的人疱疹病毒8 K6基因编码产物vMIPα是否具有结合人趋化因子受体的功能. 首先用蛋白质同源分析及蛋白空间结构模拟等对比vMIPα与人趋化因子的结构异同, 用PCR扩增出K6片段, 克隆于哺乳类细胞表达载体, 转染于NIH3T3细胞, 得到条件培养液. 然后将K6基因在大肠杆菌中表达, 得表达产物vMIPα. 结果显示转染K6的NIH3T3细胞含有vMIPα单一分子量的mRNA, 此转染细胞的条件培养液及大肠杆菌表达纯化的vMIPα可与人趋化因子125I-hMIP-1α竞争结合外周血单核细胞的CCR5受体, 而且此条件培养液及vMIPα不引起外周血单核细胞对ICAM-1的黏附反应. 研究证实K6编码产物vMIPα与CCR5结合但不引起细胞黏附反应, 即封闭HIV的CCR5共受体, 提示有用于防治HIV/艾滋病的可能性.     

同源于hMIP-1α的vMIPα对人趋化因子受体的作用

HIV感染靶细胞须以人CD4^ 白细胞膜上的趋化因子受体为共受体,与此共受体结合的趋化因子类似物可阻HIV进入靶细胞。实验目的是了解与人趋化因子单核细胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）同源的人疱疹病毒8K6基因编码产物vMIPα是否具有结合人趋化因子受体的功能。首先用蛋白质同源分析及蛋白空间结构模拟等对比vMIPα与人趋化因子的结构异同,用PCR扩增出K6片段,克隆于哺乳类细胞表达载体,转染于NIH3T3细胞,得到条件培养液。然后将K6基因在大肠杆菌中表达,得表达产vMIPα。结果显示转染K6的NIH3T3细胞含有vMIPα单一分子量的mRNA,此转染细胞的条件培养液及大肠杆菌表达纯化的vMIPα可与人趋化因子^125I-hMIP-1α竞争结合外周血单核细胞的CCR5受体,而且此条件培养液及vMIPα不引起外周血单核细胞对ICAM-1的黏附反应。研究证实K6编码产物vMIPα与CCR5培养液及vMIPα不引起外周血单核细胞对ICAM-1的黏附反应。研究证实K6编码产物vMIPα与CCR5结合但不引起细胞黏附反应,即封闭HIV的CCR5共受体,提示有用于防治HIV/艾滋病的可能性。     

艾滋病疫苗的科学挑战和应对策略

在经历30年两代疫苗的失败后,一、二代联合人免疫缺陷病毒(HIV)疫苗(痘病毒ALVAC和gp120)终于在泰国RV144试验中显示了31%保护效果,尚无法用于预防工作.HIV疫苗的科学挑战为,病毒在自然感染中难以产生有效的免疫保护,只有另辟蹊径才能攻克这一进化的瓶颈.近年HIV疫苗不乏新的研究进展,从HIV感染精英控制者发现了超强广谱中和抗体,设计了一批稳定膜蛋白三聚体结构的新免疫原,探索了一些激活广谱中和抗体胚系B细胞的新方法,使用复制型病毒载体增强疫苗的免疫原性和持久性等.HIV临床试验也明显得到加快,与前30年仅开展了4个Ⅱb/Ⅲ期试验不同,未来5年将开展一批Ⅱb/Ⅲ期临床试验,包括南非重复RV144疫苗的试验已于2016年开始,强森公司与哈佛大学研制的Ad26/gp140疫苗的试验计划于2017~2018年启动,中国疾病预防控制中心和美国国立卫生研究院(NIH)联合开展前者的DNA复制型痘病毒(rTV)和后者的gp145疫苗的联合临床试验(比较复制型(rTV)与非复制型(ALVAC)痘苗疫苗的保护性),NIH的两个CHAVI-ID项目和疫苗研究中心正全力推进新型膜蛋白疫苗大规模临床试验等.这些HIV疫苗的研究有望对2030年终结艾滋病的事业做出应有的贡献.     

多表位-表位疫苗诱导多中和表位特异性的抗HIV-1抗体

针对HIV-1包膜蛋白的中和抗体在体外高度有效地抑制不同病毒株的侵染,但在体内只以很低水平存在,提出多中和表位-表位疫苗作为提高体内中和抗体水平及机体抗病毒变异能力的新战略,两种候选从中和表位-表位疫苗在猴体内能同时诱导出预先确定的多中和表位特异性的抗体,这些抗体能识别表位多肽、gp41多肽、V3loop多肽、rsgp41和gp120上相应的中和表位,此外,3个实验型表位疫苗的组合（另一种形式的多中和表位-表位疫苗）在兔体内也诱导出类似的免疫应答。上述实验结果表明：多中和表位-表位疫苗可能是一种能同时诱导多重抗病毒活性、抗HIV-1感染以及对付病毒变异的新战略。     

原生动物棘尾虫神经肽Y受体的研究

用大型原生动物棘尾虫为材料 ,以放射标记的神经肽Y(NPY)为配基 ,进行了受体放射配基结合分析 .实验结果表明 ,在Pringsheim无机培养液中 ,密度为 2× 10 3～ 3× 10 3/mL的棘尾虫细胞对3H NPY有显著的特异结合 ,并且这种结合具有饱和性特征 .这提示 ,棘尾虫具有NPY的特异结合位点 .饱和实验Scatchard作图分析表明 ,在 2 5℃条件下 ,棘尾虫对3H NPY的结合容量为 4 2 .4 7fmol/ 10 3细胞 ,平衡结合常数为 0 .113nmol/L .用12 5I NPY对棘尾虫细胞膜蛋白提取液作平衡结合 ,实验显示 ,膜蛋白对12 5I NPY的总结合与非特异吸附有明显差异 ,提示棘尾虫的NPY受体可能主要定位于细胞膜上 .     

大鼠腹腔巨噬细胞β-内啡肽结合位点的放射自显影观察

目前资料表明,阿片肽受体广泛存在于免疫细胞[如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞及自然杀伤(NK)细胞]上。其中对巨噬细胞(macrophage;Mφ)的受体已有专门报道,所发现的受体多达20余种,但至今尚未见到有关β-内啡肽(β-endorphin,β-End)受体在Mφ上形态学分布的报道。在以往的实验中,我们曾发现β-End具有明显抑制大鼠腹     

(2′,5′)寡聚腺苷酸(2-5A)合成酶及其生理功能的研究——人白细胞2-5A合成酶的特性

2-5A合成酶是干扰素抗病毒、抗细胞增生过程中的关键酶。由它催化合成的2-5A能激活细胞中的RNase L降解病毒mRNA及细胞rRNA,从而起到抑制病毒增殖与细胞增生的作用。病毒感染、注射干扰素或poly(I)·poly(C)能诱导人体内白细胞产生2-5A合     

光系统Ⅱ反应中心的LB膜的形成及其圆二色性光谱的研究

<正>由D1、D2及细胞色素b-559(cyt-559)3个多肽及其内部镶嵌的大约定4～6个che a,2个pheo a和1～2个β胡罗卜素组成的高等植物光系统Ⅱ(PSⅡ)反应中心属于膜蛋白,因其难于结晶,人们至今还无法利用X射线技术获得该蛋白的精确解.近年来,利用膜蛋白二维晶体通过电子显微镜与象重构技术获得三维结构信息的方法有很大的进展,而有序二维晶体的获得是关键的一步.本工作的目的是试图利用单分子膜技术形成保持与自然状态光谱性质类似的PSⅡ反应中心动的Langmuir-Blodgett(LB)膜,为进一步利用该技术形成二维晶体并研究其结构打下基础.并采用圆二色性对其构象进行了研究.     

细胞色素酶2D6的分子对接以及分子动力学研究

细胞色素酶P450是人体内重要的药物代谢酶. 通常, 这类酶在其结构中都含有一个亚铁血红色分子, 并且负责代谢超过90%的已知药物分子. 细胞色素酶2D6是这类酶中的重要一员, 它负责代谢大约20%~30%的已知药物分子. 利用分子对接和分子动力学模拟的方法, 研究了细胞色素酶2D6的结构特征以及其与药物分子之间的相互作用. 并且发现, 细胞色素酶2D6活性位点中的Glu216, Asp301, Ser304和Ala305在其与药物分子的相互作用中有着重要的作用. 它们可以形成一个或者多个氢键来固定药物分子. 同时其活性位点中的Phe120可以通过形成一定的Π-Π相互作用来识别和固定药物分子. 这些发现有助于进一步了解细胞色素酶2D6的结构特征, 特别是其活性位点附近的结构特征, 理解细胞色素酶2D6代谢药物的机理. 同时, 由于细胞色素酶2D6存在着单核苷酸多肽性, 所得到的结果可以为个性化医疗提供一定的理论基础.     

v-fos转化效应因子是CD2胞内区新的结合蛋白

在以前的研究中, 本实验室采用酵母双杂交技术, 从人KT3 T淋巴细胞cDNA文库中筛选到一个与CD2胞内区结合的新的蛋白分子, 称为v-fos转化效因子(v-fos transformation effector, Fte-1). 本研究进一步分析鉴定了Fte-1与CD2相互作用的分子机制和Fte-1的生物学功能. 应用研究生物大分子相互作用的生物传感器分析了CD2胞内区与Fte-1结合特性和亲和力, 表明二者确为特异性结合, 其解离常数K_D值为10^-7 mol/L; 分子缺失突变和体外磷酸化实验结果表明, Fte-1可被蛋白激酶C(PKC)磷酸化, 其磷酸化位点为Ser238; 基因表达研究显示, 在Jurkat T淋巴细胞白血病细胞中Fte-1呈簇集性分布; CD2单克隆抗体T11刺激Jurkat T淋巴细胞后, Fte-1这种簇集性分布特征消失, 而趋向细胞膜, 并与 CD2共定位于细胞膜区域; Fte-1的PKC磷酸化位点Ser238突变为Gly238后, 其与CD2分子的共定位能力丧失, 表明Fte-1的Ser238的PKC磷酸化对Fte-1和CD2在T淋巴细胞内的结合起关键作用; 使用Fte-1干扰RNA技术抑制Fte-1在Jurkat T淋巴细胞中的表达, 可抑制佛波酯(PMA)和离子霉素(ionomycin)引起的Jurkat T淋巴细胞激活后凋亡, 提示Fte-1参与了CD2对T淋巴细胞凋亡的调节. 上述结果进一步确证Fte-1是CD2胞内区的特异结合蛋白, 并可能参与了CD2介导的细胞凋亡信号传递.     

AFM单分子力谱技术测量膜蛋白力学特性的研究进展

膜蛋白在细胞生理活动中起着关键性的作用,是大部分药物的作用靶点.对膜蛋白进行研究不仅对理解生命活动的本质有着重要的价值,还可为疾病治疗和医药研发带来帮助.原子力显微镜(AFM)的出现为研究膜蛋白的结构提供了一种新的技术手段.AFM不仅可以对单个天然态膜蛋白分子的形貌结构进行高分辨率成像,同时还可通过将配体分子修饰到AFM针尖,利用单分子力谱(SMFS)技术对膜蛋白生理功能与活动行为(如配体结合、解折叠)中的力学特性进行直接测量,使得人们可以从分子生物力学方面来认识膜蛋白的结构和功能,是对传统结构生物学方法得到的蛋白质静态三维结构的重要补充.SMFS技术在测量膜蛋白力学特性方面取得了巨大的成功,为生命科学和医药卫生领域相关问题的解决提供了新的思路.本文结合作者在AFM病理瘤细胞表面抗体-抗原相互作用力测量方面的研究工作,介绍了SMFS技术的原理与方法,总结了近年来应用SMFS技术研究膜蛋白力学特性的进展,讨论了SMFS技术面临的挑战.     

人类AIDS的研究替身--非人灵长类动物模型

非人灵长类动物模型在艾滋病发病机理、传播途径、免疫反应以及疫苗开发药物治疗等方面的研究具有重要作用.根据不同的免疫缺陷病毒感染不同的灵长类动物,可将这一模型分为不同的种类,其中HIV/黑猩猩模型、SIV/猕猴模型和SHIV/猕猴模型是目前应用最为广泛的模型.这几种模型都各有其优缺点,本文将简单介绍这几种艾滋病非人灵长类动物模型的研究概况.     

蜂毒新多肽部位BVⅠ-2H的分离纯化及其生物学活性

利用蜂毒治疗类风湿性关节炎（ＲＡ）已有悠久的历史，并取得了良好的治疗效果．为研究其抗炎机制及确定有效的抗炎成分，利用凝胶过滤层析、肝素亲和柱层析、高效液相色谱等方法分离蜂毒多肽，并观察蜂毒多肽对小鼠脾淋巴细胞细胞周期、细胞因子合成及ＩκＢα（蛋白磷酸化的影响．高效液相色谱检测分离得到的蜂毒多肽ＢＶⅠ－２Ｈ为单一对称峰，电喷雾质谱检测结果表明ＢＶⅠ－２Ｈ是蜂毒多肽混合物，其主要成分的分子量为６４４．８　ｕ．ＢＶⅠ－２Ｈ可抑制ＣｏｎＡ诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖和ＩＬ－１合成，可使ＣｏｎＡ诱导的脾淋巴细胞呈现明显的Ｇ２／Ｍ期阻滞．此外，ＢＶⅠ－２Ｈ可抑制ＰＭＡ诱导ＴＨＰ－１细胞合成ＴＮＦα，抑制ＴＮＦα　ｍＲＮＡ的表达及ＩκＢα蛋白磷酸化．实验结果提示，蜂毒多肽ＢＶⅠ－２Ｈ是蜂毒发挥抗炎作用的重要组成成分．     

预测和分析血吸虫含有EF-hand结构域的表膜蛋白的功能

血吸虫病仍然是严重危害人类健康的重要寄生虫疾病之一. 在血吸虫中发现一类特殊的表膜蛋白, 它们含有EF-hand结构域, 但是对它们功能的了解除了可以作为抗原之外几乎一无所知. 蛋白-蛋白相互作用、位点特异性变异和糖基化位点修饰等in silico分析的结果表明, 这类表膜蛋白不仅可以与具有免疫调节功能的宿主蛋白进行相互作用来帮助血吸虫主动调节宿主的免疫反应, 还可以通过位点特异性变异、糖基化修饰自身那些可以被宿主免疫攻击所识别的位点, 以帮助血吸虫被动调节宿主免疫攻击. 此外, 对表膜蛋白C端区域的分析表明, 这些蛋白还可以协助血吸虫抑制宿主多核细胞的细胞趋化和宿主的IgG4免疫反应来调节和逃避宿主的免疫攻击. 总之, 分析结果暗示, 这些表膜蛋白可以协助血吸虫在宿主-寄生虫相互作用过程中调节和逃避宿主的免疫攻击, 起到自我保护的作用.