棉花SRAP遗传连锁图构建

应用SRAP标记构建棉花分子遗传连锁图, 作图群体为邯郸208与Pima90杂交产生的129个F₂单株. 筛选多态性较好的76个引物组合进行群体检测, 共得到285个多态性条带, 平均每个引物组合产生3.75个多态性条带, 最多的产生13条多态性条带. 对285个标记用MAPMAKER/EXP3.0构建连锁群, 237个标记进入39个连锁群(LOD ≥3.0) , 总长3030.7 cM, 覆盖整个棉花基因组的65.4%, 标记平均间距12.79 cM. 在整个连锁群中, 标记分布比较均匀, 没有聚集现象.     

棉属D基因组棉种着丝粒FISH标记的筛选初报

为了筛选着丝粒探针, 在棉花染色体荧光原位杂交中标记染色体着丝粒区域, 以便于构建棉花粗线期染色体细胞遗传学图谱. 在棉花遗传连锁图上选择尽可能接近着丝粒区的单拷贝的分子标记, 以海岛棉pima 90-53的BAC文库为素材, 采用两维筛库法从该文库中筛选BAC克隆, 然后用BAC-FISH技术进行染色体定位检测. 用10号染色体长臂末端的SSR引物BNL3563筛选到一个BAC克隆150D24, 该克隆在四倍体陆地棉和海岛棉部分染色体着丝粒区有杂交信号, 但信号强度不高. 以二倍体D基因组为靶DNA进行FISH时, 染色体着丝粒区有明显信号, 但是以二倍体A, C, E等基因组棉种染色体为靶DNA进行FISH时, 染色体着丝粒区未发现杂交信号. BAC克隆150D24可能含有D组特有卫星重复序列, 可用作棉属D基因组棉种(包括四倍体棉种D亚组)的着丝粒FISH探针.     

从大豆疫霉菌ESTs中发掘SSR标记

通过对5800条大豆疫霉菌EST进行电子查询, 在369条EST中发现415个SSR. 在筛选的EST序列中SSR平均密度为每 8.9 kb含有1个SSR. 在鉴定的SSR中, 三核苷酸重复基元的SSR类型最多, 占鉴定总数的50.1%, 四核苷酸重复基元的SSR类型最少, 为8.2%. 设计40个SSR引物对对5个大豆疫霉菌菌株基因组DNA进行PCR扩增, 有33个引物对扩增出SSR特征条带, 其中有28个引物对扩增出在预期片段大小范围之内的条带. 在33个功能性引物对中, 有15个引物对在5个大豆疫霉菌菌株间扩增出多态性, 多态性引物对占45.5%. 基于SSR标记进行聚类分析, 可将5个检测大豆疫霉菌菌株划分为不同的3个组. 本研究建立了大豆疫霉菌的SSR标记, 为大豆疫霉菌及相关属种的鉴定、遗传变异、分子作图等研究提供了一种更加有效的分子标记系统.     

海岛棉EST-SSRs分布特征及新标记的开发与利用

SSRs标记已成为目前应用最为广泛的一种分子标记. 相较之其他棉种, 海岛棉的ESTs及SSRs标记资源均相当匮乏. 本研究利用本实验室2个纤维cDNA文库随机测序获得的海岛棉ESTs序列, 进行海岛棉EST-SSRs分布特征分析及新SSRs标记开发与应用研究. 通过对9697条非冗余ESTs序列分析, 共发现SSRs位点638个, 分布于595条ESTs中, EST-SSRs序列的频率是6.13%, 平均相隔10.4 kb出现一个SSR. 在2~6 bp的重复基元中, 三核苷酸重复基元的SSRs出现频率最高(26.6%), 其次是六核苷酸重复(26.0%)和五核苷酸重复(25.9%). 在所有重复基元类型中所占比例最大的是(AAG)_n. 利用Primer3及virtual PCR程序开发SSRs引物, 并去除来源于海岛棉自身部分同源序列以及与CMD释放的不同棉种冗余SSRs引物后, 获得380对棉花新SSRs引物. 进一步对本实验室四倍体作图亲本陆地棉TM-1和海岛棉海7124进行多态性检测, 其多态率为25.8%. 利用BC1作图群体, 将来源于82对引物的95个多态位点定位在我室构建的海陆遗传图谱上, 其中42个定位在At亚组, 53个定位在Dt亚组. 研究结果为进一步饱和棉花遗传图谱以及开展基于图谱的比较基因组研究奠定了基础.     

利用RAPD技术检测水稻的基因组变化

辐射育种在作物改良中取得了很大的成就。但对射线处理及后代选育过程中基因组发生的变化却了解很少,只能凭后代表型加以判断,使选育工作带有一定的盲目性。DNA分子水平的遗传标记的出现为此开辟了一条新的途径。1990年Williams等创立了一种新的遗传标记——随机扩增多态性DNA(简称RAPD)。它是利用含10(或9)个碱基的随机引物(单引物),在低温复性条件下(36℃左右)进行聚合酶链式合成反应(简称PCR),对模板DNA进行随机扩增,通过扩增出的某一DNA片段有无来比较不同基因组DNA的差异。     

中国对虾遗传连锁图谱的构建

中国对虾是中国重要的水产资源之一, 其自然群体主要分布于中国黄渤海沿海海域和朝鲜半岛海域. 中国对虾遗传连锁图谱的构建, 可以加速分子标记辅助育种和控制重要经济性状基因鉴定的研究, 为中国对虾遗传改良和优良品种的培育提供基础信息. 利用中国对虾F₂群体家系和AFLP分子标记技术进行了中国对虾遗传连锁图谱的构建. 利用55对AFLP引物组合对F₂家系的110个个体进行了研究, 检测到532个符合作图策略的AFLP标记. 对于符合3∶1比例的分离位点利用F₂自交模型构建性别平均连锁图谱, 对于符合1∶1比例的分离位点利用拟测交理论分别构建中国对虾的雌性和雄性遗传连锁图谱. 雌性遗传图谱分别由103标记组成28个连锁群, 没有未连锁标记, 图谱长度分别为1090 cM. 雄性遗传图谱由144个标记构成35个连锁群, 有10个未连锁标记, 图谱长度分别为1617 cM. 中国对虾雄性遗传连锁图谱比雌性遗传连锁图谱长32.6%, 这可能说明中国对虾不同性别存在不同的重组率. 性别平均遗传图谱有44个连锁群, 由216个标记组成, 有2个未连锁标记, 图谱实际长度为1772.1 cM. 中国对虾遗传连锁图谱基因组估计长度为2420 cM, 符合与人类基因组相比的对虾类基因组长度. 通过皮尔逊相关系数检测认为AFLP标记在中国对虾图谱上分布均匀. 本研究利用AFLP标记构建的中国对虾遗传连锁图谱为中国对虾基因组研究和遗传改良提供一定的基础, 同时开发的微卫星标记也为遗传连锁图谱的整合提供条件.     

用SSR标记分析高州野生稻的遗传多样性

利用24对SSR引物比较了来自广东高州、江西、福建、云南等地区及东南亚不同国家共计240份普通野生稻材料的遗传多样性. 结果表明, 24对引物中平均有17个位点表现出了多态性, 平均多态位点比率为69%; 平均总等位基因数、平均每个位点的等位基因数和多态位点的平均等位基因数分别为51.1, 2.04和2.43; 平均基因多样性为0.8447. 高州野生稻5个居群间已经出现了较显著的分化. 上述遗传多样性参数均表明, 高州镇江镇朋山村(陂头洞)野生稻应该是高洲野生稻的一个遗传分化中心和遗传多样性中心. 高州野生稻很可能是广东普通野生稻、华南和中国普通野生稻最大的一个遗传分化中心和遗传多样性中心.     

千岛湖陆桥岛屿上黑腹狼蛛(Lycosa coelestris)遗传多样性及其受生境片段化的影响

人工湖泊型陆桥岛屿对于理解生境片段化后片段面积和地理隔离等因素对物种遗传多样性和遗传结构的影响提供了独特的机会.本文利用相关序列扩增多态性(SRAP)分子标记法,对具有50多年片段化历史的千岛湖人工湖泊型陆桥岛屿上的黑腹狼蛛(Lycosa coelestris)种群遗传结构和多样性进行研究.利用5对SRAP引物对42份材料的基因组进行扩增,共得到大小为50~900 bp的85个可重复位点,其中84个为多态性位点,多态性比率达98.82%.不同岛屿种群的多态位点比例(PPB)为15.29%~38.82%;观测等位基因数(Na)为1.1529~1.3882,其中有效等位基因数(Ne)为1.0952~1.3392;种群间Nei’s基因多样性指数(H)为0.0582~0.1784,均值为0.0992;Shannon信息指数(I)为0.0881~0.2524,均值为0.1480;岛屿的面积、形状指数分别与多态位点比率、Shannon信息指数以及Nei’s基因多样性指数存在正相关关系.种群间遗传分化系数较高(Gst=0.7293),基因流值低(Nm=0.1856).AMOVA分析表明,57.33%的遗传变异存在于种群间,42.67%的遗传变异来自种群内(P0.001).Mantel检验表明,黑腹狼蛛各种群间地理距离与遗传距离间存在显著相关性(r=0.6465,P0.001).采用Structure 2.3.3软件以及PCA分析对14个岛屿上黑腹狼蛛种群的群体结构进行研究,结果表明,所研究岛屿可以分为6个类群,地理距离较近且属同一个岛群的岛屿优先聚在一起.上述结果表明,生境片段化初期岛屿面积和形状是影响黑腹狼蛛种群遗传多样性的主要原因,地理隔离是黑腹狼蛛种群产生遗传分化的主要原因.     

中国和美国大豆疫霉群体遗传结构的RAPD比较分析

为探究中国和美国大豆疫霉的遗传关系, 采用随机扩增DNA多态性(RAPD)的方法, 对来自中国黑龙江省、福建省和美国的3个大豆疫霉地理群体的遗传多样性进行了分析. 通过使用21个RAPD引物对供试的111株大豆疫霉菌株进行扩增, 共得到223个RAPD标记, 其中多态性标记为199个, 占89.23%. 遗传变异分析表明, 美国群体具有更高的遗传变异度; Nei’s遗传相似性和主成分分析均显示, 中国福建群体与美国群体间的遗传相似性最高, 而福建群体与黑龙江群体间遗传相似性最低; 聚类分析显示, 供试菌株在88%的相似性水平上可被区分为7个聚类, 且美国群体分布于更多的聚类组中; Shannon-Wiener多样性指数也表明美国群体的遗传多样性最为丰富. 综合分析表明, 本研究的结果不支持关于美国的大豆疫霉可能来源于中国的推测.     

中国一年生野生大豆(Glycine soja)核心资源构建

对我国国家种质资源库中保存的6172份一年生野生大豆(Glycine soja)资源进行了系统的遗传多样性分析, 比较了核心种质构建中常用的随机取样、恒量取样、比例取样、对数取样和遗传多样性取样5种取样策略, 确认对于一年生野生大豆, 遗传多样性取样策略是最简单有效的取样策略. 根据起源和生态类型对一年生野生大豆资源进行分组, 应用遗传多样性策略和层次聚类, 构建一个野生大豆核心资源. 该核心资源包括652份材料, 取样比例为10.65%. 代表性验证表明, 质量性状指标代表性为100%, 平均指标代表性为98.4%; 13个指标群体结构相似系数为0.96; 遗传多样性代表性为81.38%; 20对SSR引物扩增299份材料, 分析结果代表性为83.64%.     

索马里棉异源单体附加系的形态及分子特征研究

通过细胞学和形态学观察, 从(陆地棉×索马里棉)异源六倍体的陆地棉回交后代中, 鉴定出2个异源单体附加系, 用RAPD方法对其附加的染色体来源进行分子鉴定和区分. 在160条引物中, 筛选出引物SBSG11能特异标记异源单体附加系Ⅰ所附加的索马里棉染色体, 特征带长约600 bp; 引物SBSC03能特异标记异源单体附加系Ⅱ所附加的索马里棉染色体, 特征带长约700 bp; 引物SBSE07和SBSE08分别扩增附加系Ⅰ和附加系Ⅱ产生共有的特征带. 高强纤维索马里棉异源附加系对棉花品种改良可能具有重要的价值.     

我国普通小麦核心种质的构建及遗传多样性分析

用分布于21个连锁群上的78个微卫星标记(SSR), 对我国5029份普通小麦初选核心种质进行基因型分析, 收集了40万条SSR数据. 以此为基础, 采用适当调整的分层分组代表性取样法(即分区取样时, 对材料遗传多样性高的地区略增加取样量, 反之略减少取样量; 著名品种、重要育种亲本和携带稀有等位变异的材料优先入选), 构建了由1160份材料组成的小麦核心种质(库), 其中地方品种762份、育成品种348份、国外引进品种50份. 核心种质占初选核心种质的23.1%, 占整体种质(23090份)的5%, 遗传代表性估计值为91.5%. 核心种质中地方品种的遗传多样性明显高于育成品种. 群体遗传结构及主坐标分析均显示我国地方品种和育成品种是两个相对独立的组群. 来源于不同生态区的地方品种遗传分化十分明显, 而育成品种分化相对较弱. 此外还构建了由231份材料组成的微核心种质, 其占整体种质的1%, 但遗传代表性估计值接近70%. 最后就核心种质构建的意义和取样策略进行了讨论.     

海岛棉Gl2e显性无腺体基因的精细定位

Gl₂^e基因是控制棉花植株和种子无腺体的一个基因, 是低酚棉育种中一个重要的基因资源. 本研究利用陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉无腺体突变品系海1构建的1599个F₂单株, 对无腺体突变基因Gl₂^e进行了精细定位. 遗传研究进一步证明, 该基因是一不完全显性单基因. 结合本实验室的棉花海陆种间遗传连锁图谱, 利用SSR标记将Gl₂^e基因定位在CIR362和NAU2251b, NAU3860b, STV033之间, 遗传距离分别为9.27和0.96 cM.     

玉米通用SSR核心引物筛选及高通量多重PCR复合扩增体系建立

利用国内15个代表性自交系及15个来自国家区域试验的玉米杂交种进行实验室复筛, 并对玉米数据库MaizeGDB上已公布的1900个玉米SSR (simple sequence repeats)引物进行文献初筛, 确定了500个高多态性引物, 建立了玉米高多态性引物遗传图谱; 并按照在玉米全基因组均匀分布的原则, 从每条染色体上选取10个引物, 累计100个, 作为一套通用的SSR核心引物, 推荐供今后一般研究优先选用. 对这套核心引物按照统一的标准进行重新设计并构建基于毛细管五色荧光检测系统的高通量多重PCR复合扩增体系, 已经建立了两套10重PCR组合, 每套组合均由每条染色体上选取1个引物, 累计10个构成.     

雷蒙德氏棉EST-SSRs分布特征及开发与利用

微卫星或简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)存在于表达序列标签(expressed sequence tags, ESTs)中. 为了在棉花中开发EST-SSR功能性标记, 利用生物信息学方法对NCBI网上公开的63485条雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii Ulbrich) ESTs序列进行EST-SSRs特征分析. 剔除冗余序列, 得到非冗余序列58906条. 在非冗余序列中发现含不同重复基元SSRs的EST序列有2620条, 共2818个EST-SSRs, EST-SSRs序列的频率是4.45%, 平均相隔14.8 kb出现一个SSR. 在1~6 bp的重复基元中, 三核苷酸重复基元的SSRs出现频率最高(38.31%), 其次是二核苷酸(24.09%)、单核苷酸(23.35%). 对所有的重复基元类型进行统计分析发现, 所占比例最大的是A/T(18.67%), 其次是AT/TA(14.83%). 在复合型(compound)中发现三核苷酸串联三核苷酸的重复基元出现频率最高, 为48.65%. 利用Prime 3 软件, 设计了1554对EST-SSRs引物, 随机选用300对对本室四倍体作图亲本陆地棉TM-1和海岛棉海7124进行多态性检测, 其中129对有多态性, 多态性频率为43%. 这些EST-SSRs将有效用于不同棉种间的分布特征比较及染色体定位等方面研究.     

水稻基因组DNA胞嘧啶甲基化在单倍体和对应二倍体间的差异

对SARII-628的双胚苗中的突变体进行倍性鉴定, 得到18对二倍体-单倍体的双胚苗水稻, 任意选取5对编号为A~E. SSR分析显示, 它们在310个位点没有差异, 表明其DNA一级结构的碱基没有变异. DNA甲基化在真核生物的生长发育过程中起着重要的调控作用. 用改良AFLP方法(MSAP)分析了5个单倍体及其对应二倍体总DNA 5′-CCGG位点胞嘧啶的甲基化水平和单倍体与对应二倍体的甲基化差异模式. 发现5个二倍体在482个位点上甲基化状态没有差异, 与二倍体比较, 单倍体虽然在甲基化总体水平上变化不大, 但共有43个位点甲基化类型在不同单株上发生了变异. 单倍体的甲基化敏感扩增多态性比率即扩增的总甲基化位点数占总扩增位点数的比率分别为18.79%, 19.35%, 18.49%, 18.45%和18.75%, 均高于对应的二倍体; 全甲基化(双链CmCGG)率分别为10.58%, 11.3%, 10.11%, 10.09%和10.34%, 多数略高于二倍体, 表明二倍体突变成单倍体后, 某些位点发生了超甲基化. 单倍体与其对应二倍体比较, 有5种类型的改变: (ⅰ) 单倍体与二倍体甲基化模式相同; (ⅱ) 去甲基化及二倍体甲基化, 但在单倍体该位点无甲基化; (ⅲ) 超甲基化, 单倍体甲基化程度高于二倍体; (ⅳ) 次甲基化, 单倍体甲基化程度低于二倍体; (ⅴ) 不定类型, 单倍体与二倍体的甲基化程度无法确定. 对18个位点测序检索显示, 这些甲基化变异涉及整个水稻基因组的12条染色体且具有位点特异性, 不同单株的变异位点各不相同. 单倍体的甲基化水平高于对应的二倍体, 是单倍体相对于二倍体甲基化模式经过重新调整, 在其基因组中甲基化水平发生了总体变化以适应生存的必然结果.     

陆地棉红株基因(R1)的精细定位

利用陆地棉遗传背景的海岛棉染色体16置换系材料Sub16和陆地棉多基因标记系T586创建了含1259个单株的F₂作图群体, 结合本实验室最新的栽培四倍体棉种种间分子遗传图谱上染色体16的标记信息, 利用分子标记技术, 对红株基因R₁进行精细定位. 在F₂分离群体中, 红株性状分离比符合孟德尔1:2:1的分离, 进一步证明该性状是由一不完全显性单基因控制. 利用JoinMap 3.0连锁分析软件, 使用含237个单株的F₂小群体完成红株基因R₁的初级定位, 进一步利用含1259个单株的F₂大群体将该基因精细定位在NAU4956和NAU6752之间, 与最近标记的遗传距离为0.49 cM. 研究结果为进一步克隆该基因及培育红色彩棉转基因品种提供了研究基础.     

黑龙江野生莲遗传多样性及其地理式样

用RAPD和ISSR两种分子标记方法对黑龙江省的47份野生莲、俄罗斯兴安斯克保护区的2份野生莲和中国其他省份的27份栽培莲进行遗传多样性研究. 20条RAPD引物共扩增出113个位点, 多态位点占71.68%, 期望杂合度0.1583. 野生莲的多态位点占50.44%, 期望杂合度0.1241; 栽培莲的多态位点占53.98%, 期望杂合度0.1651. 16条ISSR引物扩增出90个位点, 多态位点占41.11%, 期望杂合度0.0851. 野生莲的多态位点占28.89%, 期望杂合度0.0661; 栽培莲的多态位点占32.22%, 期望杂合度0.0963. 野生莲中, 乌苏里江流域、松花江流域和黑龙江流域之间的遗传分化很小, 流域之间的遗传方差仅占21.68% (RAPD, Gst = 0.1312)和15.11% (ISSR, Gst = 0.1352). 在所有的遗传变异中, 野生型和栽培型之内的遗传方差占73.25% (RAPD)和81.11% (ISSR), 野生型和栽培型之间的遗传方差占19.17% (RAPD)和13.17% (ISSR), 而3个野生流域群和1个栽培群之间的遗传方差仅占7.58% (RAPD)和5.72% (ISSR). NJ分析表明, 黑龙江省的野生莲与其他地方的栽培莲有明显的分化. 在野生莲中, 松花江中游地区的野生莲可能是黑龙江野生莲的残遗中心, 由松花江中游向下游地区和黑龙江与乌苏里江流域扩散. 从黑龙江野生莲比较低的遗传多样性判断, 野生莲经历了瓶颈效应、建立者效应和再生效应(rebirth effect). 鉴于莲的古老性、遗传变异的稀少及其在湿地生态系统中的重要地位, 建议全面保护非常宝贵的黑龙江野生莲资源, 尤其是有可能为起源地的松花江中游地区的野生莲栖息地.     

中国普通野生稻(O. rufipogon Griff.)的地理多样性与分化

利用36对SSR引物及889份中国普通野生稻, 分析了中国普通野生稻在地理上的遗传多样性和分化. 结果表明, 广东普通野生稻等位变异数最多, 占全部变异的84%, 其次是广西. 基因多样性从大到小的顺序为海南、广东、广西、福建、湖南、江西和云南. 遗传多样性在不同经纬区间及县市的分布表明, 中国普通野生稻有两个遗传多样性中心, 分别位于广东的博罗、紫金、陆丰、海丰、惠东、惠阳一带以及广西的邕宁、隆安、来宾、贵港一带. 通过主坐标、UPGMA聚类以及遗传距离分析发现, 云南、湖南、江西和福建的普通野生稻各自分化形成了相对独立的群体, 而海南、广东和广西的普通野生稻之间的遗传分化较小. 存在隔离的前提下, 自然选择是造成中国普通野生稻分化的直接动力之一.