组织型纤溶酶原激活因子及其抑制因子的信使核糖核酸在大鼠睾丸中的定位

纤溶酶原激活因子(tPA)及其抑制因子(PAl-1)在大鼠及恒河猴排卵中的生理功能巳得到证实.为研究tPA/PAl-1系统在精子发生过程中的作用,我们用原位杂交方法观察了二者的信使核糖核酸(mRNA)在成年及幼年大鼠睾丸曲细精管中的定位.结果证实:(1)在幼年大鼠睾丸中tPA只在某些曲细精管中表达,表达部位在支持细胞和初级精母细胞,PAl-1在间质及大部分曲细精管的初级精母细胞中都有表达;(2)在成年大鼠睾丸中tPA只在支持细胞中表达,表达水平随生精周期波动;PAl-1在间质细胞,管用细胞及各分化阶段的生精细胞中都有表达.tPA/PAl-1系统在曲细精管中的表达表明,该系统可能在精子发生过程中起生要作用.     

用精原干细胞移植技术制作转基因动物的研究前景

在生物科学、生物医学、畜牧业科学和生物反应器的研究中, 转基因动物是非常有用的工具. 然而, 最常用的制作转基因动物的方法, 如原核显微注射和核移植效率都非常低. 在最近10年中, 研究人员利用精原干细胞移植技术发明了一系列新方法. 其中的一些方法一旦与遗传修饰方法相结合, 就会形成一套制备转基因动物的新方法. 本文综述了与转基因动物制作相关的精原干细胞移植研究成果, 如精原干细胞移植技术、精原干细胞的冷冻保存方法、精原干细胞移植受体的准备、精原干细胞的长期增殖和传代培养、精原干细胞的遗传修饰及外源基因的遗传特性等, 描述了用精原干细胞移植技术制作转基因动物的一整套方法. 根据所用供体和受体的不同, 将这种新的转基因动物制作方法分为两类: 同种移植法和同体移植法. 这一研究领域的进展虽然迅速, 但是每一种方法仍然有潜在的困难有待于克服. 本文对这些新方法的优点和目前存在的问题进行了探讨.2     

重组腺病毒AdCTLA4-FasL联合供者骨髓细胞输注促进混合嵌合体形成和小鼠皮肤移植耐受

在不对受体去髓处理的情况下, 用重组腺病毒AdCTLA4-FasL结合供者骨髓移植诱导混合嵌合体和同种皮肤移植耐受, 结果显示, 获得了持久宏嵌合体(macrochimerism)(140 d时, 供体细胞>20%). 同时, 这种嵌合体促进了稳定的供体特异性耐受, BALB/c小鼠的皮肤移植物在B6受体小鼠中长期存活(平均存活时间(the mean survival time, MST)大于200 d), 而来源于ICR小鼠的第三者皮肤移植物被该嵌合体小鼠正常排斥. 用该方法处理的B6小鼠在接受皮肤移植14 d后, 辅助性T淋巴细胞前体(HTLp)和细胞毒T淋巴细胞前体(CTLp)的频数降低到很低的水平, 表明AdCTLA4-FasL能够迅速促进全面的外周耐受, 从而有利于供体骨髓细胞植入. 接受皮肤移植140 d后, 供体皮肤仅在形成长期嵌合体的受体小鼠中继续存活, 这些小鼠体内供体特异性的HTLp和CTLp的频数减少, 提示长期的皮肤移植物耐受与稳定的混合嵌合体有关, 中枢性T细胞删除可能是耐受维持的主要机制.     

孤儿受体TR2 mRNA在恒河猴睾丸中表达的研究

以孤儿受体ＴＲ２ ｃＤＮＡ５＇－端的一段片段为模板体外转录的地高辛标记的ｃＤＮＡ及α－＾３２Ｐ－ｄＣＴＰ标记的该片段ｃＤＮＡ为探针,用原位杂交和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交的方法研究孤儿受体ＴＲ２ｍＲＮＡ在恒河猴睾丸中的细胞定位和特异表达。结果表明ＴＲ２ｍＲＮＡ在恒河猴睾丸中特异定位于生精细胞,主要在处于减数分裂期的分化程度较高的生精细胞,其表达在不同的曲细精管有明显的差异,主要在处于减数分裂期的分化程度     

新技术有望恢复男性生育力

据发表在最近出版的《自然医学》杂志上的一份研究报告显示，运用能够把小鼠体内的未成熟精子细胞转变成功能性精子的新技术，将有可能恢复男性的生育力。 费城宾夕法尼亚兽医学院的研究人员从不生育的小鼠身上收集了未成熟精子细胞──生殖干细胞，然后把它移植入不同种的不生育小鼠的睾丸内，８０％的受体小鼠开始生产正常的精子。同正常雌鼠交配的雄鼠中，有九分之四的雄鼠具有了生育能力。 苏格兰爱丁堡西区总医院的霍华德·库克（Ｈｏｗａｒｄ　Ｃｏｏｋｅ）博士指出，这一新技术将对治疗儿童癌症患者具有帮助，这些儿童由于接受癌症治…     

睾丸免疫调节与睾丸炎:Tyro3/Axl/Mer受体酪氨酸激酶与模式识别受体的功能

哺乳动物睾丸具有特殊的免疫环境来维持睾丸功能.睾丸细胞分泌多种免疫调节因子,参与调节睾丸免疫环境,免疫豁免与睾丸固有免疫应答可防止自身免疫反应及抵御微生物感染.当睾丸免疫平衡被破坏时,会引起睾丸炎,干扰精子发生,并可导致不育.多种免疫调控机制共同维持睾丸免疫平衡.近年来发现,Tyro3/Axl/Mer(TAM)受体酪氨酸激酶与模式识别受体在调节睾丸免疫环境中发挥重要作用,本文将综述相关的研究进展,提出有待深入研究的方向.     

体细胞核移植生产绿色荧光蛋白转基因猪

体细胞核移植转基因动物制作路线是目前生产转基因家畜的最佳方法. 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)转基因猪研究可以为转基因家猪育种、人类疾病模型和人类异种器官移植研究奠定良好的基础. 本研究对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选, 以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体, 以体外成熟卵母细胞为核受体, 构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎, 并对重构胚在体外和体内发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究. 结果显示, 采用4.0 μL/mL脂质体转染试剂, 1.6 μg/mL质粒DNA, 转染6 h可以获得最佳的转染效果, 转染效率达3.61%; GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为10%, GFP阳性胚胎率为48%; 重构胚移植于10头受体后, 有5头妊娠, 3头受体发育到期, 共出生克隆猪6头, 其中4头为GFP阳性, 经DNA检测确认为GFP转基因猪; 转基因克隆胚胎移植出生率为1.0%, 阳性个体出生率为0.7%. 结果表明, 脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞, 获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能. 本研究对我国体细胞克隆转基因猪的研究具有重要的参考价值.     

孤儿受体TR2 mRNA在大鼠和恒河猴隐睾内生精细胞凋亡过程中的表达

采用原位杂交方法,研究了弧儿受体ＴＲ２ｍＲＮＡ在大鼠睾丸内的表达和细胞定位及其在大鼠和恒河猴隐睾中的表达变化;并利用原位３’末端标记法,了ＴＲ２基因在精子发生及生精细胞凋亡中的作用。结果表明,在大鼠睾丸中,ＴＲ２ｍＲＮＡ特异定位于生精细胞,主要在减数分裂期的精母细胞和减数分裂后的圆形和长型精子细胞表达。     

hblf广泛表达转基因小鼠品系的建立及其组织形态学分析

人核受体hB1F是核受体超家族Ftz-F1亚家族的新成员,对其同源基因的研究提示它可能在生物体的胆固醇代谢平衡调节中有重要作用.在通过显微注射法获得携有hblf转基因的Founder小鼠后,各Founder小鼠分别与正常C57小鼠杂交,同一Founder小鼠经PCR鉴定阳性的F1代间再相互杂交建系.经F1,F2以及测交子代的分子鉴定,已成功完成了hblf广泛表达转基因小鼠品系的建立,同时也对建系小鼠做了初步的组织形态学分析.     

hb1f广泛表达转基因小鼠品系的建立及其组织形态学分析

人核受体hB1F是核受体超家族Ftz-F1亚家族的新成员, 对其同源基因的研究提示它可能在生物体的胆固醇代谢平衡调节中有重要作用. 在通过显微注射法获得携有hb1f转基因的Founder小鼠后, 各Founder小鼠分别与正常C57小鼠杂交, 同一Founder小鼠经PCR鉴定阳性的F1代间再相互杂交建系. 经F1, F2以及测交子代的分子鉴定, 已成功完成了hb1f广泛表达转基因小鼠品系的建立, 同时也对建系小鼠做了初步的组织形态学分析.     

hb1f广泛表达转基因小鼠品系的建立及其组织形态学分析

人核受体hB1F是核受体超家族Ftz-F1亚家族的新成员, 对其同源基因的研究提示它可能在生物体的胆固醇代谢平衡调节中有重要作用. 在通过显微注射法获得携有hb1f转基因的Founder小鼠后, 各Founder小鼠分别与正常C57小鼠杂交, 同一Founder小鼠经PCR鉴定阳性的F1代间再相互杂交建系. 经F1, F2以及测交子代的分子鉴定, 已成功完成了hb1f广泛表达转基因小鼠品系的建立, 同时也对建系小鼠做了初步的组织形态学分析.     

Kit基因错义突变导致KitW-2Bao小鼠生殖腺的异常发育

Kit^W-2Bao是本实验室培育的B6背景、呈单基因显性遗传的突变系小鼠, 杂合子腹部、肢端及尾端白化, 纯合子全身白化、黑眼、不育. 突变纯合子小鼠生殖腺变小、结构异常、缺乏生殖细胞, 杂合子雄鼠部分精曲小管内无生精细胞. 通过连锁分析将突变基因定位于第5号染色距着丝粒42.8 cM处, 确定Kit为候选基因. RT-PCR扩增Kit全长的mRNA, 经测序发现其ORF的第1228位碱基由G转换成T, 这一变化导致第410位的氨基酸由V变成F, 预测会引起局部二级结构发生显著变化; 随后将杂合子突变小鼠互交, 在基因型鉴定的基础上, 通过碱性磷酸酶染色等方法追踪生殖细胞异常发育过程, 发现在胚胎11.5 d, 突变纯合子小鼠的原始生殖细胞未出现在尿生殖嵴区, 突变杂合子小鼠的原始生殖细胞显著减少; 在胚胎15.5 d, 纯合子小鼠睾丸内精曲小管结构分化不清, 无精原细胞, 卵巢内无原始卵泡; 杂合子小鼠精原细胞及原始卵泡数量显著减少. W^-2Bao为KIT胞外区第4个Ig结构域内唯一的等位突变, 是研究其功能及生殖系统发育机制的新材料.     

利用精原干细胞建立人凝血因子Ⅸ转基因小鼠

用玻璃针将Effectene^TM包裹的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)表达载体注入小鼠的曲精细管. 通过PCR和Southern印迹法对子代41只小鼠进行鉴定, 有2只小鼠的基因组中整合有hFⅨ基因表达框架, 整合率为4%(2/41). 通过ELISA方法在其中1只小鼠的血浆中检测到hFⅨ的表达, 表达量为4.6 ng/mL. 实验证明, 精原干细胞法是建立转基因动物的有效途径, 为乳腺反应器的研究提供了另一个技术手段. 同时也为通过生殖细胞途径治疗血友病B提供了新的选择.     

小鼠囊胚内细胞团置换

运用显微操作和免疫手术法, 对昆明鼠和C₅₇BL/6鼠的囊胚进行内细胞团置换. 以切除内细胞团的昆明鼠胚胎滋养层为受体, 注射免疫手术得到的昆明鼠或C₅₇BL/6鼠的内细胞团, 获得两种重构胚. 一种是由不同昆明鼠个体的滋养层和内细胞团构建的同品系异体重构胚, 共构建192枚. 移植入17只昆明鼠受体后, 生下2只昆明小鼠. 另一种重构胚是由切除内细胞团的昆明鼠胚胎滋养层与C₅₇BL/6鼠胚胎内细胞团构建的异品系重构胚. 对此重构胚的成活率、细胞骨架和细胞数目进行了分析, 说明至少从这3个方面来说, 这种重构胚具有一定的发育潜能. 但将115枚异品系重构胚移植入昆明鼠受体后, 目前还没有后代出生. 说明来自不同个体胚胎的同品系滋养层和内细胞团重组后能够建立细胞连接, 进行信息传递并发育为正常个体, 而异品系重构胚发育能力较低. 这项研究有可能为解决动物克隆中着床率低和胎盘异常等问题提供参考方法.     

胰腺干细胞移植技术研究进展

糖尿病是影响人类健康的主要疾病之一.胰腺内分泌β细胞功能下降所导致的胰岛素分泌不足、糖代谢紊乱是糖尿病的重要原因;细胞替代疗法是糖尿病治疗的重要方法.传统的细胞替代疗法--胰岛移植存在供体数量不足和免疫排斥的问题,而胰腺干细胞移植有望克服上述缺陷.本文就胰腺干细胞的发育过程与培养技术、不同发育阶段的表面标志物,如何促进胰腺内分泌前体细胞增殖及胰腺干细胞移植尚存的问题、发展方向作一阐述.     

体细胞克隆牛: 供体细胞和受体的影响

利用体外培养的成年母牛(GN)和公牛(GLV)的外耳成纤维细胞作为核供体, 进行了规模较大的克隆牛研究, 并成功地获得了一批成年体细胞克隆牛犊. 经核移植构建的重构胚的囊胚发育率分别为23.98%(GN, 123/513)和29.55%(GLV, 138/467). 然而, 雌性重构胚(GN)发育满期的比例却明显高于雄性重构胚(GLV), 分别为8.02%和1.82%. 比较了鲁西黄牛、青年Holstein奶牛及经产Holstein奶牛3种不同受体牛的移植效果. 在移植GN重构胚时, 3种受体牛的妊娠率无显著差异, 但黄牛的流产率高达85.71%, 显著高于青年奶牛及经产奶牛的流产率(分别为14.29%和0%, P < 0.05). 黄牛受体生产的克隆牛犊占移植胚胎总数的1.54%, 显著低于青年Holstein奶牛及经产Holstein奶牛(分别是10.39%及20.0%, P < 0.05). 而移植GLV重构胚时, 3种受体牛的妊娠率、流产率及产犊比率均无显著差异.     

乳腺表达人凝血因子Ⅸ的转基因小鼠的研究

通过正压手动显微操作技术,将能在离体细胞和活体细胞表达的人凝血因子Ⅸ的表达载体ｐＭＣⅨｍＤＮＡ导入５８６枚昆明白种小鼠受精卵,随后将显微注射后存活的４９９枚受精精卵移植于假孕受体母鼠,获得２１６只Ｆ０代仔鼠。ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂产分析证实有６只仔鼠的基因组中有外源基因阳性整合,整合率为３％;ＥＬＩＳＡ测定２只Ｆ０代转基因雌鼠的乳汁中人凝血因子Ⅸ蛋白的含是均已达１００ｎｇ／ｍｌ一期法测定其     

以胚胎干细胞为核供体能促进异种重构胚的体外发育

体细胞在异种成熟的去核卵母细胞中能够去分化和重编程,并能发育到囊胚,甚至能全程发育正常出生。为了评价胚胎干细胞作为供核细胞在异种动物克隆中的意义,以小鼠胚胎干细胞（ES）为核供体,兔成熟的去核卵母细胞为受体构建异种重构胚,分析其在体外的发育能力,并以小鼠胚胎成纤维细胞和成年小鼠外耳皮肤的成纤维细胞为对照。通过核移植的方法分别把3种细胞移入成熟的兔去核卵母细胞透明带下,经电融合和激活后,在体外培养,胚胎干细胞作为供核细胞所构建的异种重构胚在体外发育到囊胚的比例为16.1％,明显高于用成年小鼠外耳皮肤成纤维细胞（0％～3.1％,P<0.05）和小鼠胚胎成纤维细胞（2.1％～3.7％,P<0.05）所构建的异种重构胚的体外囊胚发育率.重构囊胚细胞经染色体分析,证实其染色体来源于小鼠胚胎干细胞。以上结果显示,用胚胎干细胞作为供核细胞,比体细胞作为供核细胞所构建的异种重构胚更容易进行重编程,并且胚胎干细胞指导异种克隆胚胎正常发育的能力强于体细胞。     

不同类型核受体对小鼠体细胞重构胚胎发育能力的影响

为探讨昆明白小鼠不同类型的卵胞质对小鼠体细胞核移植胚胎发育的影响, 采用C57BL/6小鼠耳成纤维细胞为核供体, 昆明白小鼠卵母细胞为核受体进行单次核移植, 同时采用将重构胚类合子核移入去核合子、重构胚2-细胞卵裂球细胞核移入去核MⅡ期卵的方法进行连续核移植, 通过将重构胚2-细胞卵裂球与正常昆明白小鼠2-细胞胚胎卵裂球交换融合得到四倍体胚胎. 对所得胚胎进行体外培养, 结果发现, 以去核的昆明白小鼠MⅡ期卵母细胞为核受体进行单次核移植所得到的重构胚胎发育率很低, 且只能发育到8-细胞阶段. 两种连续核移植重构胚发育率均有所提高, 但仅重构胚类合子核移入去核合子时有囊胚出现, 囊胚发育率为1.9%. 重构四倍体胚胎囊胚发育率却很高(62.3%), 染色体分析表明其中51.5%为真正的四倍体. 结果表明, 昆明白小鼠不同类型核受体对重构胚胎的发育能力有显著影响, 其去核卵母细胞胞质对体细胞核重编程的能力较弱, 而当其与正常受精卵胞质共同作用时可较好地对体细胞核重编程.     

骨髓来源干细胞在肝移植中的应用及其相关机制

肝脏移植已经日益成为治疗终末期肝病最为有效的方法, 而供肝严重短缺、急慢性排斥反应以及长期应用免疫抑制剂所带来的毒副作用一直是肝移植面临的三大难题. 骨髓来源的干细胞具有向肝系细胞分化的潜能, 参与损伤后肝再生. 肝移植术后, 急性排斥反应、缺血再灌注、部分肝移植肝量损失、术后肝炎复发及“小肝综合征”等对移植肝造成的损伤环境可对骨髓来源不同干细胞亚群产生趋化作用, 动员其进入外周循环并迁移至肝脏, 促进移植肝功能修复. 此外, 骨髓来源干细胞还可参与活体肝移植供者的功能性肝再生. 骨髓源干细胞参与肝再生的过程可能是通过SDF-1及其受体CXCR4的相互作用以及HGF, IL-8, MMP9, VEGF/VEGFR-2等因子的参与而实现的. 肝移植联合供者来源的骨髓源干细胞移植可以诱导供者特异性免疫耐受, 使异体移植肝得以长期高质量存活. 总之, 无论是从参与再生的角度还是从诱导免疫耐受的角度, 无论从受者的角度还是从活体供者的角度, 骨髓来源的干细胞移植都显示了辅助肝移植治疗肝衰竭, 进而拓宽肝移植发展空间的强大优势, 为广大肝病患者带来新的希望.