病原体逃避宿主免疫反应的新机制

[本刊讯]上海交通大学医学院健康科学研究所与同济大学医学院的科研人员发现．肠致病性大肠杆菌EPEC通过其分泌蛋白Tir的免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）来抑制宿主的免疫反应,从而达到免疫逃避的目的。2012年9月23日．NatureImmunology在线发表了这项研究成果。     

应用最大似然法检测丙肝病毒包膜蛋白编码基因的适应性进化

非同义-同义置换速率比值(d_N/d_S)是藉蛋白质编码序列评价选择压力的一种重要测度, 而基于密码子置换模型的最大似然法业已成为检测承受正选择的氨基酸位点及适应性进化的统计分析工具. 本研究应用最大似然法分析了丙型肝炎病毒的包膜蛋白编码序列, 从全世界18个常见的基因型/亚型中, 发现了4个正选择/适应性位点. 由于这些氨基酸位点位于不同的免疫表位, 本研究结果具有潜在的生物医学价值, 同时表明最大似然法可以作为一种检测高分歧度病毒蛋白中适应性进化存在与否的有效手段.     

DIDS对红细胞膜上葡萄糖运输蛋白功能的影响

膜蛋白功能和其自身特殊结构间的紧密相关是不言而喻的,但在活细胞上,膜蛋白还和周围的脂质、其他膜蛋白及胞质组分存在联系,由此产生的相互作用往往对其正常生理功能的发挥及调控至关重要,本工作利用DIDS(4,4’-二异硫氰基-2,2’-二磺基芪)特异性地抑制红细胞膜上阴离子运输蛋白(Band 3),研究是否会影响膜上葡萄糖运输蛋白(GluT-l)对葡萄糖的运输特性,即确认膜上这二种蛋白质是否有相互作用调节功能.     

新型HLA-A2限制的B, C型HBV特异性CTL表位的筛选及鉴定

乙型肝炎病毒(HBV)特异性CD8+ T细胞(CTL)介导的细胞免疫应答在控制HBV感染和病毒清除中至关重要, 已鉴定的T细胞表位绝大多数都来自A, D基因型的乙肝病毒, 而在我国流行的B, C型病毒表位研究较少. 本研究合成重叠九肽肽库, 通过细胞结合试验和体外重折叠实验系统筛选和鉴定B型和C型HBV核心蛋白表位, 发现一个在60位氨基酸由L变异成V(L60V)而产生的新表位HBcAg60-68. 表位肽能在HLA-A2/K^b转基因小鼠体内激发特异性CTL细胞免疫反应. 检测HLA-A2阳性乙肝患者表位特异性CTL证明该九肽序列为体内自然加工的表位, 这为研究HBV感染中特异性CTL免疫应答提供新的依据.     

磷酸化修饰动态调控流感病毒复制

磷酸化是一种常见的蛋白质翻译后修饰形式,调控蛋白质的活性、稳定性、细胞内定位和蛋白质互作等功能.在真核细胞中,丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸是最常见的磷酸化位点.在流感病毒复制的生命周期中,病毒蛋白可被宿主激酶磷酸化修饰,并调节其核质穿梭、信号转导等功能,从而调控病毒的生长、复制和致病力.本文就近年来关于流感病毒内部核蛋白、基质蛋白1、非结构蛋白1的磷酸化修饰位点和其生物学功能进行综述,为深入了解流感病毒复制周期及抗病毒药物研发提供理论基础.     

HBx对HBV复制的调控

乙型肝炎病毒(HBV)是导致肝细胞肝癌(HCC)发生发展的重要诱因之一. HBV在感染细胞后进行病毒DNA的复制、病毒蛋白的合成以及新病毒颗粒的包装和释放等步骤,其中病毒感染细胞逃避宿主免疫后,就可能通过HBV复制产生子代病毒、形成持续感染、诱导肝癌的发生发展.机体中HBV的复制受到多种因素的影响,而乙型肝炎病毒的X蛋白(HBx)对于HBV复制的影响是其中一个重要因素.本文在对HBx蛋白的结构组成及其分布做简要阐述的基础上,重点综述HBx通过不同的修饰途径来调控HBV的复制,以及HBx通过mi RNA来调节HBV复制的进程.     

黄色黏细菌fruA mRNA 5′非翻译区正性调节其自身基因的表达

黏细菌是研究多细胞结构形态发生机制的良好模型. FruA是黏细菌发育所必需的一种转录因子, 其mRNA 5′端存在相当长的由235个核苷酸组成的非翻译区（5′-UTR）. 以lacZ为报告基因,构建保留或缺失5′-UTR的fruA-lacZ翻译融合载体并在染色体attB位点定点整合. 5′-UTR自+4至+220缺失后fruA-lacZ在发育阶段几乎不表达, 说明完整的5-′UTR为fruA表达所必需. 二级结构预测显示该区域可形成高度稳定的3螺旋接合结构, 可能是蛋白因子的结合位点或存在调节fruA表达的顺式元件. 因此fruA发育特异性表达受其5′-UTR的正性调控.     

用丝状噬菌体主要外壳蛋白展示外源多肽的研究

丝状噬菌体的基因组经过工程化的修饰,可以允许外源氨基酸序列在该病毒颗粒的主要外壳蛋白表面上展示。这一展示系统提供了一个研究蛋白南免疫识别的有效途径。许多研究结果已表明,这一系统具有以下几个特点：１）免疫反应具有较强的特异性;２）能够有效地征集辅助Ｔ细胞;３）不需要额外添加佐剂;４）具有模拟抗原决定簇表位结构的能力。这些优点表明这一技术将有希望发展成为一个既经济又简便的生产新型诊断试剂和生物疫苗的有     

PAS结构域介导Org35蛋白与NifA之间相互作用

在巴西固氮螺菌中, 氧和铵是调节固氮基因表达的主要环境因子, 即高浓度的氧和铵抑制固氮作用. NifA蛋白(nifA基因的产物)是所有固氮基因(nif基因)的转录激活蛋白. 目前, 在该菌中, 氧和铵对NifA蛋白的表达和活性的调节机制仍然不清楚. 本研究从巴西固氮螺菌中克隆到编码含有PAS结构域蛋白的org35全基因, 将根据org35的核苷酸序列推测的Org35蛋白氨基酸序列在NCBI网上进行同源性比较, 结果表明, Org35蛋白属于杂合双组分调节系统, 包括3个结构域, 即N-端PAS结构、中间组氨酸激酶结构域(HPK)和C-端响应调节蛋白结构域(RR). 并通过酵母双杂交系统证明了Org35蛋白与NifA蛋白之间的相互作用是由PAS结构域介导的.     

用酵母双杂交系统筛选与NifA相互作用的蛋白质

利用酵母双杂合系统从巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Sp中筛选与NifA有直接相互作用的蛋白质因子. 首先将nifA基因克隆到pGBD-C2载体上, 构建成诱饵质粒pGBD-nifA, 接着将巴西固氮螺菌的染色体DNA构建在pGAD-C1, pGAD-C2和pGAD-C3质粒载体上, 形成3个质粒文库YSPC1, YSPC2和YSPC3. 然后以pGBD-nifA为诱饵, 对YSPC1, YSPC2和YSPC3这3个文库进行了筛选, 得到11个阳性克隆. DNA序列分析表明, 这11个阳性克隆分为4类, 包含4个1~1.3 kb不同的基因片段. 对这4个基因片段进行同源性比较发现, 其中2个编码的蛋白质含有与信号传递有关的PAS结构域, 另外1个基因片段含有与吸收铁有关的fhuE基因, 另一个是未知蛋白. 将这4个基因片段从原来的pGAD载体转移到pGBD载体, 即互换换载体后, 它们仍然与NifA有相互作用; 对这4个基因片段进行移码突变则不再与NifA有相互作用, 说明了它们与NifA相互作用的特异性.     

逐步预测和统计学筛选人H_5N_1毒株神经氨酸酶蛋白B细胞表位

为了预测和筛选人禽流感H5N1毒株神经氨酸酶(NA)蛋白的B细胞表位,检测了人禽流感H5N1毒株NA基因核苷酸序列.采用Kyte-Doolittle的亲水性方案、Emini方案和Jameson-Wolf抗原指数方案,辅以对NA蛋白的二级结构中的柔性区域的分析,并用SPSS13.0进行聚类和相关分析,建立了一种统计学筛选程序,预测了H5N1病毒NA蛋白的B细胞表位,并对毒株GD-01-06的NA蛋白变异进行了分析.预测结果通过吴氏抗原指数和SWISS-MODEL软件进行评价.结果发现,预测并筛选最有可能的B细胞表位位于NA蛋白N端第120～137,81～84,408～415,273～282,429～432,356～368,46～55,146～155,341～350,198～209肽段,提示它们是B细胞表位的优势区段;含有糖基化位点NGT126～128的120～137肽段为首选的NA蛋白抗原表位;H5N1毒株NA蛋白第53位(Ⅰ)位点缺失,这有助于增加毒株GD-01-06的NA蛋白表面柔性,而且抗原表位扩大(VEP46～48→VEPISNTNFL46～55).采用SWISS-MODEL软件建立的N1蛋白模型有助于...     

cp基因的修饰引起转基因的沉默及其介导的PVX抗性

将马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)外壳蛋白(coat protein, CP)基因(cp)编码序列中植物偏爱密码子替换成稀有同义密码子, 并将此修饰的外壳蛋白基因(cpm)及未修饰外壳蛋白基因(cp)分别置于CaMV 35S启动子后, 构建植物表达载体, 并用农杆菌介导转化烟草. Northern杂交及Run on实验结果表明, 转cpm)基因烟草比转cp基因烟草发生转录后基因沉默(PTGS)的频率明显增高(从6.25%增至35%), 并且对人工接种的PVX病毒抗性显著提高. 以上结果表明, 基因中密码子的替换可以明显提高转基因植株的病毒抗性.     

Ras蛋白在组蛋白乙酰化修饰介导的多头绒泡菌(Physarum polycephalum)细胞周期调控中的作用

在天然同步化的多头绒泡菌(Physarum polycephalum)细胞中, 组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A (TSA) 阻断了细胞周期S/G2, G2/M以及走出有丝分裂期的转换, 同时影响了2种ras基因(Ppras1 和Pprap1)的转录以及Ras蛋白的表达水平. 抗Ras蛋白的抗体中和实验结果表明, Ras蛋白通过调节Cyclin B1的表达水平在细胞周期转换点的调控中起重要作用. 以上结果表明, 在多头绒泡菌细胞中Ras蛋白可能是参与组蛋白乙酰化修饰介导的细胞周期调控过程的一个关键因子.     

利用鳞翅目来源的转座子piggyBac建立高效稳定的转基因家蚕技术

piggyBac转座子元件被成功应用于家蚕转基因. EGFP荧光蛋白基因作为筛选标志, 受含有Pax-6结合位点的启动子控制, 并能在家蚕的眼部组织中特异性表达. 荧光筛选质粒和piggyBac转座子表达质粒被以混合物的形式显微注射到家蚕受精卵, 获得出生的G₀代蛾子700个, 互相交配后, 利用EGFP荧光筛选获得111个独立的转基因系. 大部分转基因系在基因组上携有2个或多个插入拷贝, 并且在整个项目过程中转基因的表型稳定遗传6代以上. 对插入位点的序列鉴定发现, 其插入位点两侧具有特异性TTAA序列, 证实转基因的插入受到piggyBac转座子的调控. 高效稳定的家蚕转基因技术的建立为家蚕后基因组的研究和蚕业工业的发展提供了基础.     

表达EIAV Gag蛋白的DNA载体与重组痘苗病毒联合免疫效果的观察

将中国马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗及其亲本株的gag基因通过同源重组插入到痘苗病毒天坛株的TK区, 经蓝白斑筛选获得重组痘苗病毒rvv-DLVgag和rvv-LNgag. Western blot检测可知重组痘苗病毒能够有效表达完整的EIAV Gag蛋白. 使用本实验室构建的表达EIAV DLV和LN Gag蛋白的DNA载体单独或与表达相应蛋白的重组痘苗病毒联合免疫小鼠, 结果表明各免疫组小鼠体内均产生了针对EIAV的特异性体液和细胞免疫应答. 统计学分析显示, 联合免疫组与单独免疫组相比, 诱导的特异性结合抗体滴度无显著性变化, 而淋巴细胞增殖应答和CTL水平则显著增强, CTL杀伤率最高可达31%, DLV Gag蛋白与LN Gag蛋白诱导的免疫应答强度无显著性差异. 研究结果有助于阐明我国按照传统路线研制成功的EIAV弱毒疫苗的免疫机制, 并为EIAV基因工程疫苗的开发研制奠定基础.     

蛋白质翻译后修饰研究进展

蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作用. 它使蛋白质的结构更为复杂, 功能更为完善, 调节更为精细, 作用更为专一. 常见的蛋白质翻译后修饰过程有泛素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙酰化等. 泛素化对于细胞分化与凋亡、DNA修复、免疫应答和应激反应等生理过程起着重要作用; 磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过程; 糖基化在许多生物过程中如免疫保护、病毒的复制、细胞生长、炎症的产生等起着重要的作用; 脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常关键的作用; 组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关. 在体内, 各种翻译后修饰过程不是孤立存在的. 本文对上述几种类型的蛋白质翻译后修饰的研究近况进行了综述, 讨论了各种翻译后修饰形式相互影响、相互协调的关系.     

荧光假单胞菌G2-EPSP合酶的拆分和intein介导的活性恢复

利用GPS-LS接点扫描系统, 在荧光假单胞菌G2的5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶编码基因aroA中随机插入15 bp (即编码5个氨基酸短肽)的外源片段, 建立含一系列不同插入位点的aroA突变体库. 利用内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER2799对突变体库进行功能互补筛选, 测序后确定了12个可以忍受5个氨基酸插入的位点, 其中位点F295/T296经Ssp DnaE内含肽(intein)介导的蛋白互补技术鉴定为可拆分和蛋白重建的位点. 从位点F295/T296将G2-EPSPS基因一分而二, N-端和C-端片段分别连接在携带Ssp DnaE 内含子元件的原核表达双质粒上, 获得共转化质粒pMEPSN295IN和pKEPSC296IC. 将质粒pMEPSN295IN和pKEPSC296IC分别或共转化内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER2799中, 携带共转化质粒的重组子能够在M9限制性培养基生长, 而携带单一质粒的不能生长, 表明从位点F295/T296拆分的aroA基因在内含肽介导下实现了蛋白重建, 在突变株ER2799中恢复了5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶活性, 酶活水平达到野生型的62.92%,为4.48 U/mg.     

AFM单分子力谱技术测量膜蛋白力学特性的研究进展

膜蛋白在细胞生理活动中起着关键性的作用,是大部分药物的作用靶点.对膜蛋白进行研究不仅对理解生命活动的本质有着重要的价值,还可为疾病治疗和医药研发带来帮助.原子力显微镜(AFM)的出现为研究膜蛋白的结构提供了一种新的技术手段.AFM不仅可以对单个天然态膜蛋白分子的形貌结构进行高分辨率成像,同时还可通过将配体分子修饰到AFM针尖,利用单分子力谱(SMFS)技术对膜蛋白生理功能与活动行为(如配体结合、解折叠)中的力学特性进行直接测量,使得人们可以从分子生物力学方面来认识膜蛋白的结构和功能,是对传统结构生物学方法得到的蛋白质静态三维结构的重要补充.SMFS技术在测量膜蛋白力学特性方面取得了巨大的成功,为生命科学和医药卫生领域相关问题的解决提供了新的思路.本文结合作者在AFM病理瘤细胞表面抗体-抗原相互作用力测量方面的研究工作,介绍了SMFS技术的原理与方法,总结了近年来应用SMFS技术研究膜蛋白力学特性的进展,讨论了SMFS技术面临的挑战.     

逐步预测和统计学筛选人H5N1毒株神经氨酸酶蛋白B细胞表位

为了预测和筛选人禽流感H₅N₁毒株神经氨酸酶(NA)蛋白的B细胞表位, 检测了人禽流感H₅N₁毒株NA基因核苷酸序列. 采用Kyte-Doolittle的亲水性方案、Emini方案和Jameson-Wolf抗原指数方案, 辅以对NA蛋白的二级结构中的柔性区域的分析, 并用SPSS 13.0进行聚类和相关分析, 建立了一种统计学筛选程序, 预测了H₅N₁病毒NA蛋白的B细胞表位, 并对毒株GD-01-06的NA蛋白变异进行了分析. 预测结果通过吴氏抗原指数和SWISS-MODEL软件进行评价. 结果发现, 预测并筛选最有可能的B细胞表位位于NA蛋白N端第120~137, 81~84, 408~415, 273~282, 429~432, 356~368, 46~55, 146~155, 341~350, 198~209肽段, 提示它们是B细胞表位的优势区段; 含有糖基化位点NGT_126~128的120~137肽段为首选的NA蛋白抗原表位; H₅N₁毒株NA蛋白第53位(Ⅰ)位点缺失, 这有助于增加毒株GD-01-06的NA蛋白表面柔性, 而且抗原表位扩大(VEP_46~48→VEPISNTNFL_46~55). 采用SWISS-MODEL软件建立的N₁蛋白模型有助于评价抗原表位预测. 结果表明, 用多参数预测以及用统计学筛选H₅N₁毒株NA蛋白的B细胞表位, 可以为分子免疫学研究和药物筛选提供依据; 广东GD-01-06毒株NA蛋白53位(Ⅰ)位点缺失可能增强该抗原表位的抗原性.     

利用SSR标记揭示我国夏大豆(Glycine max (L.) Merr)种质遗传多样性

利用67个SSR标记, 分析了来自我国栽培大豆初选核心种质中的158份夏大豆, 旨在阐明其遗传多样性特点, 为育种利用提供理论依据. 结果表明, 在所有供试夏大豆中共鉴定出等位变异460个, 平均每个位点有6.9个; 其中, 80份黄淮夏和78份南方夏大豆的等位变异数分别为414个和419个, 平均每个位点均接近6.2个. 所有供试夏大豆平均每个位点多样性(D)为0.735, 变化范围为0.414~0.905, 其中黄淮夏大豆D值平均为0.708, 变化范围为0.387~0.886; 南方夏大豆D值平均为0.687, 变化范围为0.189~0.884. 黄淮夏大豆和南方夏大豆在特异等位变异数、等位变异频率、遗传相似性系数均存在差异, UPGMA聚类分析也可将黄淮夏大豆和南方夏大豆基本分成2类. 这表明黄淮夏大豆和南方夏大豆可划为2个不同的基因池. 在夏大豆育种中, 两种夏大豆类型间可以通过种质资源相互利用来拓宽类型内育成品种的遗传基础.