桃抗病基因同源序列的克隆与分析

根据已克隆的STK类抗病基因的保守区设计简并引物对4个不同桃的基因组DNA进行PCR扩增,将获得的扩增片段的回收产物,应用pGEM-T easy裁体试剂盒进行了目的基因片段的克隆.随机挑取若干单克隆经PCR鉴定确认后,进行测序,共获得11个各不相同的片段序列.氨基酸序列分析中,有6个片段能推导出完整的氨基酸序列.除了两侧都基本具有STK类抗病基因产物的保守结构域.     

荔枝R基因同源序列的克隆与分析

根据已知植物抗病基因（R基因）编码的蛋白质NBS保守区设计特异简并引物，对荔枝的基因组DNA进行体外扩增，获得了一条大小约500bp的扩增谱带；回收该特异扩增带并进行克隆，筛选若干阳性克隆进行测序，共获得5个片段的序列。同源性比较发现，该5个片段均属于NBS－LRR类抗病基因同源序列（RGA），与已知R基因相应区段的氨基酸序列一致性为13.5%-45.9%。这些RGA既可进一步用于筛选荔枝的抗病候选基因，同时也可以作为分子标记，用于荔枝遗传图谱的构建。该研究表明R基因同源克隆技术可望成为荔枝抗病基因克隆和基因组研究的重要手段。     

甘蓝抗病基因同源序列分离的初步研究

根据已分离植物抗病基因N(烟草)、RPS2(拟南芥)和L6(亚麻)的保守区域设计简并引物,从抗TuMV甘蓝材料84075第1链cDNA中扩增出1个与植物抗病基因同源的序列,经克隆测序结果表明,该基因片段与许多NBS类抗病基因同源,Southem杂交分析表明甘蓝抗病基因同源序列在基因组中以多基因家族的形式存在.     

半套式PCR技术在植物基因克隆中的应用

常规ＰＣＲ方法在分离克隆已知序列的基因中发挥着重要的作用，但要求目的基因片段与引物间的同源性几乎是１００％，一旦引物序列与目的基因间存在有差异，便往往会导致扩增的特异性不强，扩增效率不高，给克隆带来很大的困难．在常规ＰＣＲ基础上，若所分离的基因在不同植物间存在保守序列，依据这一序列再合成一对引物，进行半套式ＰＣＲ则能大大提高扩增的特异性及扩增效率．对于较长的基因片段而言还能同时完成亚克隆．本文依据南瓜ＧＰＡＴ（甘油－３－磷酸酰基转移酶）基因ｃＤＮＡ序列及比较拟南芥菜、豌豆间在该基因内的保守区段序列合成相应引物来分离克隆黑子南瓜及西瓜ＧＰＡＴ基因的ｃＤＮＡ片段为例来说明半套式ＰＣＲ技术在植物基因克隆中的应用     

PJ综合症相关抑癌基因LKB1/STK11的逆转录PCR法克隆及序列分析

从正常人胎盘组织中克隆出人野生型PJ综合症相关抑癌基因LKB1/STK11cDNA片段.以提取的总RNA为模板,采用逆转录法获得cDNA第一条链,采用94℃变性、72℃退火及延伸的特殊条件,经PCR扩增出抑癌基因LKB1/STK11cDNA片段,克隆到T载体,在国内首次报道了LKB1/STK11基因的克隆.序列分析表明,该cDNA全长1299bp,与GenBank中人野生型LKB1cDNA编码序列完全相同,证实获得了人野生型抑癌基因LKB1/STK11的cDNA克隆.LKB1/STK11cDNA的成功克隆为其原核表达载体的构建和LKB1/STK11蛋白在细胞内的作用及其抑癌效果、抑癌机理的研究打下了基础.     

无蹼壁虎6个鸟类Z染色体连锁基因的cDNA克隆和序列分析

利用RT-PCR技术从无蹼壁虎中获得了6个鸟类Z染色体连锁基因的cDNA片段序列.与铅山壁虎的同源基因序列相比,除CHD1-5'端序列中有3 bp的缺失外,其他基因序列均具有相同的核苷酸和氨基酸长度,且核苷酸序列和氨基酸序列的保守性均非常高(97%~100%).在与有鳞目、龟鳖目和鳄目的其他已知序列比较时,发现6个基因的8个片段有不同程度的同源性,其中GHR基因的同源性最低,与该基因片段在进化分析中较高的ω值(Ka/Ks)是一致的.性染色体连锁基因的克隆和染色体定位,将有助于进一步了解壁虎类甚至高等脊椎动物不同类型性染色体的起源和进化.     

马缨杜鹃Actin基因片段的克隆及序列分析

为研究马缨杜鹃相关功能基因的表达模式提供内参基因,本研究根据Gen Bank中公布的锦绣杜鹃肌动蛋白基因(Actin)的保守序列设计引物,以马缨杜鹃c DNA为模板,利用RT-PCR方法克隆得到马缨杜鹃Actin基因部分c DNA片段,将其命名为Rd Actin。结果显示:该基因片段长度为468 bp,编码156个氨基酸;保守域分析表明该基因具有Actin的功能保守域,同时Rd Actin与其它植物Actin的氨基酸序列同源性达97%以上。     

白菜快速碱化因子基因BcMF14的克隆及序列分析

快速碱化因子是近年来新发现的一种植物多肽类信号分子．从一个在‘矮脚黄’白菜雄性不育两用系的可育株系中特异表达的cDNA—AFLP差异片段入手,采用RACE技术克隆了该片段的基因,将其命名为BcMF14,全长581bp,不含内含子,开放阅读框长度为240bp,编码79个氨基酸．序列分析结果表明该基因与花椰菜、拟南芥等的快速碱化因子基因cDNA序列有很高的相似性,证明BcMF14属于快速碱化因子家族．     

大腹圆蛛拖丝蛋白基因3'端克隆和序列分析

用PCR(Polymerase Chain Reaction)技术从大腹圆蛛主壶腹腺组织的基因组DNA和RNA中分别扩增获得编码拖丝蛋白基因的3'端基因序列,克隆PCR产物到pDrive载体,经PCR、限制性酶切筛选和序列分析后证明获得了蜘蛛拖丝蛋白基因两个克隆AvDS1和AvRS2.基因序列和氨基酸序列分析表明AvDS1和AvRS2具有拖丝蛋白基因序列和蛋白质氨基酸序列特有的结构特征,氨基酸序列中存在4个motifs-(A)n(GA)n(GFGX)n以及(GGX)n.AvDS1与基因库中已报道的蜘蛛拖丝蛋白基因序列同源性较低,而AvRS2与已经报道的Nephila clavipes拖丝蛋白基因组分-1的同源性可达91%,推测AvRS2是编码大腹圆蛛拖丝蛋白基因组分-1基因片段.比较这两个克隆的核苷酸序列和氨基酸序列,发现它们之间没有同源性.推测它们是同一基因的不同片段,或是编码大腹圆珠拖丝蛋白的两个基因组分. 明AvDS1和AvRS2具有拖丝蛋白基因序列和蛋白质氨基酸序列特有的结构特征,氨基酸序列中存在4个motifs-(A)n(GA)n(GFGX)n以及(GGX)n.AvDS1与基因库中已报道的蜘蛛拖丝蛋 基因序列同源性较低,而AvRS2与已经报道的Nephila clavipes拖丝蛋白基因组分-1的同源性可达91%,推测AvRS2是编码大腹圆蛛拖丝蛋白基因组分-1基因片段.比较这两个克隆的核苷酸序列和氨基酸序列,发现它们之间没有同源性.推测它们是同一基因的不同片段,或是编码大腹圆珠拖丝蛋白的两个基因组分. 明AvD     

夏威夷椰子超氧化物歧化酶基因片段的克隆与序列分析

以热带植物夏威夷椰子(Chamae doreacostricana)基因组DNA为模板,根据SOD基因保守序列设计特异引物进行PCR扩增,得到特异基因片段.回收该基因片段,与pMD182T载体连接,并转化到感受态大肠杆菌ER2566细胞,获得Cu*Zn-SOD基因片段的克隆.序列分析表明夏威夷椰子Cu*Zn-SOD基因片段含3个外显子和3个内含子,编码64个氨基酸,与玉米、红薯和白杨相应氨基酸序列的同源性分别为82.81%,81.25%,81.25%和79.69%.     

Fly and frog homoeo domains show homologies with yeast mating type regulatory proteins

Homoeotic genes in the bithorax and Antennapedia complexes of Drosophila melanogaster appear to specify the developmental fate of segments of the fly. Some of these genes (Ultrabithorax, Antennapedia and fushi tarazu) share homology due to their conservation of a 'homoeo domain'1,2 consisting of 60 amino acids. Cross-hybridization and cloning experiments show that the homoeo domain is conserved in a frog (Xenopus laevis) gene expressed in early development and may also be present in earthworm, beetle, chicken, mouse and human genomes. The extreme conservation found in the amino acid sequences between the Drosophila and Xenopus domains suggests that the domain has a vital function in the control of early development. Here we report the results of a search made in the Dayhoff sequence bank, which reveals a lesser but apparently significant homology between the homoeo domain and the amino acids coded from parts of the a 1 and alpha 2 mating type genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae.     

基于基因表达谱芯片杂交分析Lamprey-PHB2转染前后Chang liver细胞的基因表达差异

选取了10个物种与本课题组前期克隆得到的东北七鳃鳗抗增殖蛋白2(Lm-PHB2)进行氨基酸序列相似性对比,检测PHB2基因进化水平,结果表明各物种的PHB2氨基酸序列在PHB结构域处高度保守,但在N-端和C-端氨基酸序列保守性较低.将重组质粒pEGFP-N1-Lm-PHB2瞬时转染入张氏肝(CHL)细胞后,利用基因表达谱芯片技术分析基因的表达差异.结果显示CHL细胞中共有270条显著差异表达基因,其中显著上调基因共141条,显著下调基因共129条,涉及细胞信号转导、细胞周期调节、细胞增殖、细胞代谢和细胞凋亡等多个方面.通过实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)对基因表达谱芯片分析结果进行验证,结果显示转染pEGFP-N1-Lm-PHB2质粒后,细胞周期基因CDC25C、氧化应激相关基因(CAT,SOD,GST)和抗细胞凋亡基因HAX1均有显著性差异.     

Cloning and analysis of [NiFe]-hydrogenase genes from Arthrospira platensis FACHB341

0IntroductionHydrogenase(H2ase)has beeninvestigatedin a va-riety of bacterial groups since it was firstly reported in1931[1-3].Cyanobacteria contain two different types ofH2ase,uptake H2ase(EC1.12.7.2)and bidirectional orreversible H2ase(EC1.12.1.12).Uptake H2ase is in-duced under N2-fixing situation,mainly confinedin hete-rocysts.Bidirectional H2ase is constitutively synthesized,active in both heterocysts and vegetative cells present inboth N2-fixing and non-N2-fixing conditions.This en…     

mRNA transcripts related to full-length endogenous retroviral DNA in human cells

Mammalian cells contain multiple copies of endogenous type C retroviral DNA sequences. Among these sequences are complete, potentially infectious proviruses, proviral DNA that is expressed only in the form of viral antigens, retroviral segments that may contribute portions of envelope (env) genes during the generation of recombinant polytropic viruses, and many subgenomic viral DNA segments that may not be expressed at all. We have previously reported the identification and molecular cloning of type C retroviral sequences from human DNA and have shown that the partial nucleotide and deduced amino acid sequences of one of the clones obtained (lambda 51) are homologous to Moloney MuLV (MoMuLV) in the gag and pol regions. The lambda 51 clone as well as several others isolated from a human DNA library contained approximately 4.3 kilobases (kb) of retroviral sequences, were deleted in the env region, and were flanked by tandem repeats unlike the long terminal repeats (LTRs) typically found in proviral DNAs (P.E.S., in preparation). We describe here the characterization of a full-length human retroviral clone (lambda 4-1) containing LTR elements as well as a putative env region. DNA-RNA hybridization experiments reveal that human cells contain species of poly(A)+ RNA that anneal to segments of the full-length retroviral DNA clone.     

新型预苯酸脱氢酶基因的克隆和生物信息学分析

采用基于序列特异性直接测序策略,从所构建的碱性污染土壤宏基因组文库中分离得到一个编码预苯酸脱氢酶的新基因pdhE-1,并对新基因进行生物信息学分析和保守区域特征研究。结果表明,pdhE-1编码一个由287个氨基酸编码组成的多肽。在DNA水平上,该基因与来自新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobiumsp.)的预苯酸脱氢酶相似性较高,为82%;在氨基酸水平上,与来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的预苯酸脱氢酶序列相似性为65%,一致性为42%。新型预苯酸脱氢酶基因pdhE-1的克隆和生物信息学分析研究为进一步完成酶基因的功能鉴定奠定了基础。     

非天然D-型氨基酸生物转化中酶的纯化及其基因序列

D-海因酶 (D- Hydantoinase,HDTase )和 N -氨甲酰基 - D-氨基酸酰胺水解酶 (D- Carbam oylase,DCase )是医药和食品工业上用于生物转化 D-型氨基酸的酶。为了用人工酶替代现用的天然酶转化工艺 ,我们用热变性、硫酸铵分级及 Q - Sepharose、Phenyl- Sepharose、Superose12等多步柱层析 ,从现用菌株 No.2 2 6 2中纯化了 HDTase和 DCase,二酶均达到 SDS- PAGE纯 ,经 N -端序列分析 ,HDTase和 DCase的 N -末端氨基酸序列分别为 :MDKL IKNGTI和 MTRQKIL AF。首先 ,根据酶的 N -末端氨基酸顺序推论并合成了正向多核苷酸简并引物 ,然后按蛋白质数据库资料 ,在比较不同菌株氨基酸残基同源性基础上 ,化学合成了数对反向多核苷酸引物 ,以菌株 No. 2 2 6 2基因组 DNA为模板 ,经 PCR扩增获得了 HDTase的部分基因序列 (～ 70 0 bp )和 DCase的全部基因序列 (912 bp ) ,为使人工酶用于非天然 D-型氨基酸的生物转化奠定了基础。     

Molecular cloning of a fulllength cDNA for ECBP21 from Angelica dahurica

ECBP21 is an extracellular calmodulin-binding protein which was first detected and purified from extracellular extracts of suspension-cultured cells of Angelica dahurica. The purified protein was electroblotted onto PVDF membrane and the amino acid sequences from 1 to 20 were determined. Using degenerate oligonucleotides of the sequence, a full-length cDNA coding for ECBP21 was isolated by a combination of RT-PCR and 5′-RACE cloning. The cDNA contains 947 nucleotides and codes for a precursor protein of 216 amino acids. The N-terminal 1–25 amino acid sequence is a predicted signal peptide and the other 26–216 amino acid sequence is a mature peptide. The 26–45 amino acid sequence shows identity with the N-terminal amino acid sequence of purified ECBP21 from Angelica dahurica. The fragment of encoding the mature protein was cloned into pET-28b(+) and transformed into E. coli BL21(DE3). A protein with relative molecular mass 21 ku was expressed in E. coli. Using a biotinylated-CaM gel overlay technique, the expression protein was tested for its ability to bind CaM. The results indicated that the expression protein is a Ca²⁺-dependent CaM-binding protein. Thus, these results further defined the cDNA clone for ECBP21. This work laid a foundation for elucidating biological functions of ECBP21 by using molecular biological means.     

A型肉毒杆菌毒素的基因测序与分析

对国内A型肉毒杆菌毒素基因测序,分析了解毒素基因结构并推测其氨基酸序列。提取肉毒杆菌总DNA,利用自行设计的引物对目的基因进行PCR扩增,把目的基因导入E.Coli JM109,筛选含目的基因的阳性克隆菌进行测序和分析,从而了解毒素基因结构并推测其氮基酸序列。对A型肉毒杆菌毒素基因的核苷酸序列成功测序并与GenBank中的相应序列比较,其序列同源性为96％。推测其氨基酸序列同源性为100％。成功地对A型肉毒杆菌毒素的基因进行了测序,这为肉毒杆菌毒素中毒的快速诊断,以及进一步探求以基因工程方法生产此毒素奠定基础。