博来霉素对肝癌细胞DNA损伤以及H2AX相互作用蛋白的影响

组蛋白H2AX是DNA损伤修复反应中的关键蛋白,磷酸化的H2AX可以作为DNA损伤早期检测的金标准.实验通过检测磷酸化H2AX的改变来研究博来霉素对肝癌细胞和正常肝细胞DNA损伤作用的差异,推测肿瘤细胞抗药性可能是通过H2AX磷酸化来介导的.利用免疫共沉淀的方法,对博来霉素刺激下肝癌细胞中的H2AX复合物进行了免疫印迹...     

β淀粉样蛋白来源的扩散性配体对胞外信号调节激酶活性的影响

β淀粉样蛋白来源的扩散性配体降低细胞外信号调节激酶的磷酸化水平,免疫印迹结果显示在培养的海马神经元上,给予500 nmol/L的可溶性β淀粉样蛋白寡聚体,作用不同时间均降低了胞外信号调节激酶的磷酸化水平;可溶性β淀粉样蛋白寡聚体对细胞不同部位胞外信号调节激酶磷酸化水平影响不同,并且对细胞质、细胞膜、细胞核中胞外信号调节激酶磷酸化水平的影响在时间上呈现明显的差异;β淀粉样蛋白来源的扩散性配体通过突触外N-甲基-D-天冬氨酸受体影响胞外信号调节激酶信号通路,单独激活突触外的N-甲基-D-天冬氨酸受体或给予β淀粉样蛋白来源的扩散性配体后再激活突触外的N-甲基-D-天冬氨酸受体,胞外信号调节激酶的磷酸化水平均明显降低;水迷宫实验显示,转入淀粉样前体蛋白基因的小鼠要花更多时间找到目标平台,其海马胞外信号调节激酶磷酸化水平显著降低.     

重组人肿瘤坏死因子蛋白TNF-α的纯化与功能鉴定

 串联亲和纯化系统（TAP）是近年来广泛使用的一种可在接近于生理条件下探究蛋白间相互作用的生化纯化方法。目前许多关于TAP 的研究报道均使用细胞内转录因子为目标蛋白,探索细胞内与其相互作用的蛋白分子。本文尝试建立一种细胞外配体-受体刺激介导的信号转导初始复合体的纯化体系,为此选择了一种多功能的免疫分子配体蛋白--肿瘤坏死因子蛋白超家族（TNFSF）中的核心成员TNF-α。TNF-α 是一个强效促炎因子,可介导炎症反应、细胞凋亡和激活等生理效应,是至今研究最多的TNFSF 成员。利用原核表达系统纯化出了一种带有多个标签的重组人源TNF-α 蛋白,通过检测其受体下游信号通路鉴定该蛋白与天然TNF-α 蛋白的生理活性相似,从而证明该蛋白可以用于胞外TAP 系统探究TNFR 下游信号通路,为配体-受体刺激介导的信号转导初始复合体的胞外串联亲和纯化系统的建立奠定了基础。     

具有磷酸酶活性的重组PTEN蛋白可抑制癌细胞的迁移

PTEN是迄今为止发现的第一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌因子,可通过对粘着斑激酶的去磷酸化抑制细胞迁移.在前期研究工作中证实了在大肠杆菌中表达的重组PTEN 蛋白具有抑癌活性后,本研究进一步检测重组PTEN 蛋白的磷酸酶活性及其对粘着斑激酶FAK 磷酸化程度和细胞迁移的影响.对[D3-32P]PIP3体外去磷酸化的实验表明重组PTEN蛋白具有明显的脂质磷酸酶活性;将重组PTEN蛋白转染DU-145细胞后,细胞中FAK的磷酸化水平明显下降,表明重组PTEN蛋白具有蛋白磷酸酶活性.细胞迁移实验结果表明转染的重组PTEN蛋白可以抑制DU-145细胞的迁移作用,从而起到抑制肿瘤转移或浸润的作用.     

力经PSGL-1介导ERM蛋白ITAM-like序列上磷酸化位点的暴露

炎症反应阶段,P-选择素糖蛋白配体1(PSGL-1)与埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白(ERM)的结合在招募脾酪氨酸激酶(Syk)并促进白细胞激活中发挥了重要作用.文中通过晶体结构分析发现,位于ERM蛋白非传统的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM-like)上的两个磷酸化位点(Y191和Y205)周围存在较大的空间位阻,这将阻碍其被Src家族激酶酪氨酸磷酸化继而招募Syk的过程.文中用拉伸分子动力学模拟的方法模拟力学环境下PSGL-1与根蛋白FERM结构域的相互作用,构象分析和残基溶剂可及表面积的变化都表明,经由PSGL-1传导的力学信号可以介导根蛋白ITAM-like序列上磷酸化位点Y205的暴露.文中结果揭示了一条经由PSGL-1胞内域激活Syk的力学信号通路,并且在原子层面上对PSGL-1/ERM/Syk之间的相互作用给予了阐释.     

γ-干扰素诱导沙眼衣原体感染细胞酪氨酸激酶活化的研究

目的探讨IFN-γ诱导的沙眼衣原体感染细胞信号转导中酪氨酸激酶活化。方法采用IFN-γ作用于沙眼衣原体感染的McCoy细胞，用免疫印迹法检测信号蛋白酪氨酸激酶磷酸化的诱导活化，并应用酪氨酸激酶特异性抑制剂genistein拮抗IFN-γ诱导的酪氨酸激酶磷酸化。结果IFN-γ可以在短时间内引起沙眼衣原体感染细胞内的蛋白质酪氨酸激酶磷酸化。磷酸化程度随时间延长而改变，在15min时磷酸化程度最高，以后逐渐减弱。Genistein可抑制IFN-γ诱导的酪氨酸激酶磷酸化；随着浓度增大，抑制作用有所增加。结论IFN-γ诱导沙眼衣原体感染细胞酪氨酸激酶活化。     

JAK2在生长激素介导的信号传导中的作用

在细胞水平上，JAK2在生长激素介导的信号传导中具重要作用。生长激素与生长激素膜蛋白受体结合，激活胞质酪氨酸激酶JAK2后，JAK2自身磷酸化。同时磷酸化生长激素膜蛋白受体，从而形成信号传导因子与转录激活因子、适配蛋白Shc等细胞信号分子高亲和位点。生长激素刺激下的JAK2也会磷酸化胰岛素受体底物，从而激活磷酯酰肌糖3激酶以及其它相关的调节新陈代谢的生物分子活性。而且JAK2还能激活适配蛋白SH2-B。这些因子和激活途径可能是生长激素作用于机体并调节机体生长代谢的基础。     

TAT-Apoptin蛋白制备及其诱导BGC-823细胞的凋亡作用

为了制备单一组分TAT-Apoptin融合蛋白,检测其跨膜及凋亡活性.利用IPTG诱导目的质粒p GEX-6p-1-TAT-Apoptipn及对照质粒p GEX-6p-1-TAT-EGFP和p GEX-6p-1-TAT-Apoptin-EGFP可溶性表达,纯化蛋白并孵育BGC-823细胞,荧光显微镜、DNA ladder、流式细胞术检测融合蛋白跨膜及凋亡活性.结果表明,成功诱导融合蛋白表达,获得单一蛋白,荧光显微镜检测TAT将融合蛋白带入细胞内且不影响其活性,TAT-Apoptin融合蛋白处理BGC-823细胞36和48 h时后出现典型DNA Ladder条带,流式细胞术检测早期凋亡率48 h为61.5%,在24~48 h范围内凋亡率增加.结论为制备的TAT-Apoptin蛋白可跨膜诱导BGC-823细胞凋亡,且具有较高活性.     

绿色荧光蛋白α2b-干扰素融合蛋白的表达与活性研究

采用基因重组技术,构建原核表达质粒pET 32a( )/GFP-α2b-IFN,转化大肠杆菌BL 21,以IPTG诱导融合蛋白的表达并用镍金属螯合层析柱进行纯化.SDS-PAGE及免疫印迹结果显示,46.0 kD的融合蛋白在大肠杆菌中得到了正确的表达,并具有α2b-IFN的抗原活性.受体结合实验表明,该融合蛋白能够与W ISH细胞上的干扰素受体特异性结合,并在激发光下呈亮绿色荧光.采用细胞病变法测定分离纯化的融合蛋白的抗病毒活性,比活力为1.0×107IU/m g.表达的GFP-α2b-IFN融合蛋白具有α2b-IFN的特性与荧光活性,为研究α2b-IFN受体功能以及IFN与细胞相互作用的机理奠定了基础.     

MBP-PTP19融合蛋白载体构建及蛋白纯化

蛋白磷酸酶在植物生长发育过程中发挥着重要的调控作用.酪氨酸蛋白磷酸酶属于蛋白磷酸酶中一个亚家族,在植物领域的研究中涉及较少.笔者所在实验室研究数据表明,酪氨酸蛋白磷酸酶19(PTP19)在植物盐响应中起负调控作用.使用MBP标签载体,构建MBP-PTP19融合蛋白表达载体,转化BL21大肠杆菌.以IPTG浓度、诱导时间、诱导温度3个因素设计L18正交实验探索MBP-PTP19蛋白的最佳诱导表达条件.找到该蛋白表达的最适诱导条件为IPTG终浓度0.1mmol/L、诱导时间4h、诱导温度37℃.该融合蛋白在上清液以及包涵体中均有分布.用直链淀粉树脂纯化得到了MBP-PTP19蛋白,并以其为抗原制备了PTP19的抗体,且抗体可识别PTP19蛋白,这为研究PTP19蛋白生化性质及其功能奠定了基础.     

LysM蛋白在植物免疫中的作用

溶解素基序（LysM）是在多种蛋白质中普遍存在的结构域.植物LysM蛋白能够感知几丁质及其寡糖等分子配体，从而启动植物对病原菌的免疫反应.在水稻、拟南芥等植物免疫应答过程中，LysM蛋白作为一种重要的模式识别受体，通过不同形式的寡聚化，激活多种类受体胞质激酶及其下游的MAPK（mitogen activated protein kinase）级联反应传递信号.同时，蛋白质可逆磷酸化和蛋白质降解途径可以负调节LysM蛋白介导的防御信号转导.文章综述了植物免疫过程中LysM蛋白介导的信号转导分子机制.     

过氧化氢诱导前列腺癌PC3细胞HSP60表达和Akt蛋白磷酸化的研究

以不同浓度H_2O_2刺激PC3细胞24h,应用MTT法分析细胞活力变化,并采用蛋白印迹方法检测HSP60蛋白、Akt蛋白(总Akt蛋白)和磷酸化Akt蛋白的表达水平.结果表明,15.625μmol/L的H2O2可诱导PC3细胞内HSP60表达显著升高(p0.05),7.312μmol/L和15.625μmol/L的H_2O_2均会导致磷酸化Akt蛋白的量显著下降(p0.01),但该两种浓度的刺激对细胞内总Akt蛋白量并无显著影响(p0.05).     

CDK1磷酸化修饰对驱动蛋白Kif18A的ATP酶活性的影响

为了探究真核细胞中蛋白激酶CDK1的磷酸化修饰对驱动蛋白分子Kif18A的ATP酶活性的影响,利用昆虫杆状病毒表达系统,在体外表达并纯化Kif18A模拟磷酸化(EE)和非磷酸化(AA)的突变体蛋白(Kif18A-EE,Kif18A-AA).首先构建驱动蛋白Kif18A的杆状病毒表达载体质粒pFast-Bac-FLAG-Kif18A-AA或EE,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑筛选得到阳性克隆.随后提取杆状病毒基因组,转染昆虫细胞SF9后得到能够表达FLAG-Kif18A突变体蛋白的杆状病毒.扩增病毒后,对病毒感染SF9细胞表达目的蛋白的条件进行优化,最终通过蛋白纯化得到有活性的Kif18A突变体蛋白,并在体外检测纯化蛋白的ATP酶活性.结果显示,Kif18A-EE蛋白的ATP酶活性低于Kif18A-AA蛋白.这一结果表明,CDK1的磷酸化修饰能够降低驱动蛋白Kif18A的ATP酶活性.     

BLAP75蛋白在细胞有丝分裂期中的磷酸化研究

BLAP75为分子量75kDa的一个维持基因组稳定性的重要蛋白,但是其在细胞有丝分裂期中的分子调控机制尚不清楚.运用Western印迹和细胞有丝分裂期细胞同步化技术,检测BLAP75蛋白在细胞有丝分裂期的变化,以及采用蛋白磷酸酶反应和基因定点突变技术来确定BLAP75蛋白的磷酸化位点.研究发现,当细胞处于有丝分裂期时,BLAP75蛋白会受到翻译后磷酸化修饰,位于BLAP75蛋白中部的第284位丝氨酸和第292位丝氨酸是其磷酸化位点.     

利用多克隆抗体检测纺锤体蛋白基因INMAP在肝癌细胞中的表达

 为探究纺锤体蛋白INMAP 的功能及其在细胞恶性增殖中发挥的作用,制备INMAP 多克隆抗体.利用0.1 mmol/L IPTG于16℃诱导His-INMAP 融合蛋白进行原核表达,SDS-PAGE 及免疫印迹检测蛋白表达.4.0 mol/L 尿素处理包涵体获得可溶性融合蛋白,镍亲和柱分离纯化融合蛋白抗原并检测蛋白浓度及纯度.以所获抗原免疫4 只Balb/c 小鼠,收集心脏抗血清.以纯化前、后的原核表达产物作为抗原,检测INMAP 多克隆抗体的特异性.通过免疫印迹分析INMAP 在正常肝细胞系L-02 及5个肝癌细胞系(PLC、HepG2、SUN449、SMMC-7721 和BEL-7402)中的表达差异.结果显示,His-INMAP 融合蛋白主要以包涵体形式存在,经4.0 mol/L 尿素处理可获得可溶性目的蛋白,且纯化后的抗原纯度较高(94.1%).INMAP 多克隆抗体能与INMAP 抗原特异结合.INMAP 在6 种肝细胞中具有多态性,除PLC 外,在其他肝癌细胞中其基因表达水平显著下调.本研究制备的INMAP 多克隆抗体特异性高,为INMAP 基因功能的进一步研究奠定了基础.     

Physagulin H通过阻断NF-κB和JNK/MAPKs信号通路抑制LPS诱导RAW 264.7细胞产生的炎症反应

采用脂多糖诱导的RAW 264. 7巨噬细胞体外炎症模型评价physagulin H的抗炎活性.以MTT法评价细胞毒性,Griess法检测NO的含量,ELISA法检测PGE2和TNF-α水平,Western Blot法检测炎症蛋白表达(iNOS和COX-2)以及对NF-κB炎性信号通路(IκB-α蛋白降解)和对MAPKs通路(JNK,p38和ERK蛋白磷酸化)的调控作用,研究physagulin H的抗炎活性及作用机制.结果表明,physagulin H可显著降低巨噬细胞RAW264. 7中NO、PGE_2和TNF-α的释放,还可显著降低iNOS和COX-2蛋白的高表达且呈浓度依赖性.Physagulin H对LPS诱导NF-κB/IκB-α降解具有显著抑制作用.进一步的抗炎机制研究表明,physagulin H能抑制JNK磷酸化,但对ERK 1/2和p38磷酸化无明显抑制作用.综上,physagulin H是通过调控NF-κB和JNK/MAPKs信号转导通路下调LPS诱导的炎性蛋白的高表达,进而抑制小鼠巨噬细胞产生和释放过量炎症介质以及炎症因子,从而发挥抗炎作用.     

新蛭素和人IgG-Fc融合蛋白的表达纯化和功能评价

新蛭素(EH)具有很好的抗凝血效果,但由于半衰期短限制了其在临床上的推广和应用.为延长EH的半衰期,制备人Ig G-Fc和EH的融合蛋白,并对其活性和药代动力学进行初步研究.将合成的Fc-EH和Fc-L-EH融合基因克隆至表达载体pc DNAHC上,再将重组表达载体转染CHO细胞.蛋白A亲和柱纯化融合蛋白,用SDSPAGE和WesternBlot鉴定蛋白表达情况,质谱法检测蛋白的分子质量和C端序列,体外凝块法和大鼠颈静脉血栓模型分别验证融合蛋白的体外抗凝活性和体内抗栓效果,应用化学发光免疫法检测融合蛋白半衰期.结果表明,成功构建了pc DNAHC-Fc-EH和pcDNAHC-Fc-L-EH两个重组表达载体,融合蛋白Fc-EH和Fc-L-EH分子质量分别为68 476,u和70 542,u,蛋白的C端序列正确,Fc-EH和Fc-L-EH活性分别为256,ATU/mg和64,ATU/mg.大鼠颈静脉血栓实验表明,Fc-EH具有抗血栓作用,体内消除半衰期为39.4,h.融合蛋白Fc-EH能延长EH体内半衰期,为融合蛋白的进一步研究奠定了基础.     

E3泛素连接酶Pellino蛋白的研究进展

Pellino蛋白是近年来新发现的一类E3泛素连接酶,通过靶蛋白泛素化介导蛋白降解、蛋白与蛋白的相互作用、蛋白质细胞定位以及信号传导.目前研究表明Pellino蛋白在固有免疫细胞和获得性免疫细胞中具有重要调控作用,与炎症和自身免疫密切相关.本文总结了近年来Pellino蛋白的表达与活性调控、介导的信号转导途径以及在免疫...     

生长因子受体介导的信号转导通路研究进展

生长因子受体本身具有酪氨酸激酶活性,它与生长因子结合后发生自动磷酸化并通过酪氨酸磷酸化识别机制作用于含SH2结构域蛋白,启动STATs、Ras、磷脂酶C-γ、磷脂酰肌醇3-激酶、Src激酶等多条胞内信号转导通路.这些通路间的信息交谈和引起基因表达效应的重叠性使它们形成复杂的信号网络系统.     

HproTα／hIL-2融合蛋白真核载体的构建及鉴定

利用基因重组技术构建了含信号肽的人源胸腺素α原和白介素2(proTα/IL-2)融合基因的真核表达载体pVAX-PI.用脂质体转染试剂转染COS-7细胞,转染后24、48、72、96 h采用ELISA法检测细胞培养上清中IL-2的表达情况,分别用CTLL-2依赖细胞株/MTT法和脾细胞增殖实验测定融合蛋白IL-2和proTα活性,采用ECL western blotting分析和鉴定目的蛋白的相对分子质量大小.结果表明,转染上清在31 kDa处有特异性阳性反应条带,质粒在转染COS-7细胞后不同时间均可进行分泌表达,且于转染后48 h目的蛋白的表达量达峰值.细胞转染上清中的IL-2活性可达58 IU/mL,proTa具有促进小鼠脾脏细胞增殖的作用,可作为基因治疗药物的开发之用.