松材线虫和拟松材线虫活体染色比较其分泌-排泄物

松树萎蔫病是由松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)引起的松属树种上的一种毁灭性的病害,因此,对松材线虫致病机理的研究具有重要的理论和实践意义.根据松材线虫和拟松材线虫致病性的差异,通过活体染色对松材线虫和拟松材线虫分泌-排泄物进行了比较研究,发现松材线虫和拟松材线虫线虫分泌-排泄物存在明显的差别,这种差别可能与松材线虫的致病性有关.     

松材线虫与拟松材线虫种间杂交特性研究

选取来自中国、日本和美国的松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)4个虫株,以及中国的拟松材线虫(B.mucronatus)2个虫株进行生物学杂交和交配对象选择试验。结果表明:松材线虫和拟松材线虫的部分虫株可以发生种间杂交,正交总交配成功率为4.2%,反交总交配成功率为10%,反交成功率是正交的2倍。杂交整体发生率极低,杂交后代较难形成可持续的繁殖种群。采用松材线虫(简称Bx)/拟松材线虫(简称Bm)快速分子检测系统对杂交F1代幼虫进行分子鉴定,结果表明F1代幼虫既含有Bx分子标记也含有Bm分子标记。继代培养30 d后,杂交后代在基因型上表现出了不同趋向的分化,其中BxAN5♀×Bm JNL1 ♂、BxAN5 ♂×BmAN5♀和BxUSA ♂×Bm JNL1♀的杂交后代趋向于成为松材线虫占主导的种群,BxJNL5 ♂×BmJNL1♀的杂交后代趋向于成为拟松材线虫占主导的种群。在有种内交配资源存在情况下,无论松材线虫还是拟松材线虫均倾向于优先选择种内交配资源。研究表明松材线虫和拟松材线虫之间存在一定的生殖隔离,自然状态下种间交配可能会产生,但杂交后代较难形成可持续性繁殖的生殖后代。     

应用PCR-RFLP技术鉴别松材线虫与拟松材线虫

应用PCR—RFLP技术分析松材线虫与拟松材线虫之间的差异。实验扩增出松材线虫rDNA—ITS区片段长度约为890bp，拟松材线虫rDNA—ITS区片段长度约为930bp。用5种限制性内切酶对两种线虫的ITS区扩增产物进行酶切，结果表明：（1）DraⅠ酶切松材线虫群体均产生两个长度约510bp和380bp的片段，而拟松材线虫均不能被DraⅠ酶切；（2）所有的松材线虫群体与拟松材线虫群体的ITS区扩增产物均不能被ApaⅠ酶切；（3）用MspⅠ酶切松材线虫群体，除GZ02不能够被酶切外，其余样本能够产生两条长度分别为530bp和360bp的谱带。拟松材线虫群体，都能产生3条一致的亮带，长度分别为340bp、290bp、180bp；（4）所有松材线虫样本均不能被SalⅠ酶切，而拟松材线虫群体均能够被酶切为两个720bp和220bp的片段；（5）XhoⅠ酶切松材线虫ITS区为两条大小分别为520bp和370bp的谱带。而拟松材线虫产生两条大小分别为530bp和400bp的谱带。因此，内切酶DraⅠ、SalⅠ可以用于检测松材线虫与拟松材线虫。MspⅠ、ApaⅠ、XhoⅠ不宜用于鉴别松材线虫与拟松材线虫。     

松材线虫和拟松材线虫种间及种内遗传相关性的RAPD分析

运用RAPD技术对来自日本、韩国、美国、加拿大和中国大陆6省及台湾地区的松材线虫和拟松材线虫16个虫株的基因组DNA进行随机扩增,聚类分析结果显示,松材线虫和拟松材线虫明显分为两大类。在松材线虫群体中,又可分为3个亚组:中国大陆虫株与日本虫株为一亚组,加拿大虫株为一亚组,中国台湾虫株与美国虫株为一亚组。拟松材线虫群体亦可分为两亚组:一为日本、中国台湾和中国江苏虫株,二为韩国和中国湖南虫株。     

松材线虫与拟松材线虫RAPD检测技术

采用RAPD技术对松材线虫和拟松材线虫进行了检测研究,从140个随机引物中筛选出引物OPK09与引物组合OPC18 OPN18。引物OPK09对12个松材线虫株系扩增出一条约2400bp左右的特异片段,引物组合OPC18 OPN18对10个拟松材线虫株系扩增出一条970bp左右的特异片段。实验表明,引物OPK09与引物组合OPC18 OPN18具有特异性强、灵敏度高的优点。用这两组引物可以快速、准确鉴定松材线虫和拟松材线虫。     

松材线虫和拟松材线虫的繁殖力及其超氧自由基差异

采用不同毒力的松材线虫和拟松材线虫进行研究,探讨不同毒力线虫的繁殖力及虫体自身超氧自由基(O·2)释放能力差异与各虫株致病力之间的关系。对强、弱毒松材线虫和无毒拟松材线虫在单异活体培养下的繁殖力进行测定,发现三者的繁殖力从大到小依次为：无毒拟松材线虫、强毒松材线虫、弱毒松材线虫。单异活体培养下的松材线虫和拟松材线虫虫体、水培滤液的超氧自由基测定表明,两组分中的超氧自由基含量与供试线虫的毒力呈负相关,从高到低依次为：无毒拟松材线虫、弱毒松材线虫、强毒松材线虫。结果表明：供试的不同毒力松材线虫和拟松材线虫的致病力与其繁殖力无显著相关性,但与其虫体超氧自由基含量有密切关系。     

黑松与松材线虫和拟松材线虫互作早期超氧自由基研究

为探讨黑松受不同毒力松材线虫与无毒拟松材线虫侵染后,超氧自由基(O2.-)在互作早期对松材线虫病发生发展的作用,采用2年生黑松接种强毒、弱毒松材线虫与无毒拟松材线虫,于接种后4、12、24、48、72、96、120 h对受侵染黑松的茎干和针叶取样测定。结果表明:黑松受不同毒力供试线虫侵染后体内O2.-和SOD活性变化差异显著。接种后12 h,松树茎、叶中的O2.-均出现第1次突增,茎部突增的强度与供试线虫毒力呈负相关,在针叶内O2.-出现第2次突增,且无毒拟松材线虫处理(48 h)的启动时间早于强毒松材线虫(72 h)的。SOD活性在接种无毒拟松材线虫的松树茎、叶中出现两次突增,而接种强毒松材线虫的处理仅出现1次突增。3种处理黑松茎、叶的Mn-SOD含量在24 h后第1次突增,且接种无毒拟松材线虫的高于接种强毒松材线虫的。O2.-与SOD的变化趋势在一定程度上呈正相关关系,但SOD的特异变化滞后于O2.-的变化。由此可见,超氧自由基可能是松树受松材线虫侵染后进行信号转导的重要桥梁物质。     

俄罗斯拟松材线虫的致病性

调查表明在俄罗斯目前尚未发现松材线虫的分布,但是有松材线虫的近缘种拟松材线虫的分布。在温室中利用从俄罗斯远东地区天然病死树上分离到拟松材线虫BmRFE,其分离物的接种实验表明,BmRFE分离物可使5年生Pinus koraiensis和Larix olgensis全部死亡,而70 %的P.sylvestris和P.densiflora可存活下来。室外试验的结果表明,用3种拟松材线虫分离物接种黑松,1 a之后只有BmRFE接种的2年生黑松中的线虫存活下来。在第2次试验的南方利用B.mucronatus(BmKOMY)和法国拟松材线虫分离物(BmFr),及两者杂交种分离物接种4年生P.sylvestris,结果表明接种后1 a几乎所有分离物均存活下来了,但是只有接种BmFr的松树表现出病害症状。病状的严重程度与拟松材线虫携带的致病细菌的毒性有关。毒性生测证明拟松材线虫BmRFE分离物携带了致病性最强的细菌。     

拟松材线虫个体发育研究

【目的】探索拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)的繁殖能力,并对其胚胎发育过程中经历的重要阶段和卵的形态变化进行研究,了解胚胎发育和完成整个生活史所需时间,为进一步研究其生长发育并进行有效防控提供参考。【方法】分别挑取3组180条拟松材线虫雌成虫,观察记录雌虫在25 ℃条件下的产卵情况,每隔2 h统计每组线虫的累积产卵量,直至卵的数量基本不再增加。挑取尚未产卵的拟松材线虫雌虫于载玻片上,待其产卵后,将卵置于蔡司体视显微镜下观察。连续观察胚胎的发育过程并使用照片记录不同发育阶段胚胎的形态变化,记录卵发育至不同阶段所需时间。挑取约200个刚产下的拟松材线虫卵,在25 ℃条件下发育24 h后每隔4 h统计其总孵化率,直至孵化数不再增加,设置3组重复。将刚孵化的2龄幼虫接种于灰葡萄孢(Botrytis cinerea)上,分为3组,每组设置3个重复,分别在接种1、2、3 d后使用贝尔曼漏斗法收集线虫,计算混合龄线虫中每龄期线虫所占比例,计算拟松材线虫胚后发育及完成整个生活史所需时间。【结果】① 在拟松材线虫产卵能力方面,0~10 h拟松材线虫产卵总量增长较快,16 h后产卵量逐渐趋于稳定,28 h内雌虫平均累积产卵12粒/条。② 拟松材线虫的胚胎发育过程主要经历以下几个关键阶段:单胞期、双胞期、3胞期、4胞期、5胞期、8胞期、16胞期、囊胚期、利马豆期、蝌蚪期、蠕虫期、1龄幼虫(J1),至孵化为2龄幼虫(J2)时结束。③ 在胚胎发育前期,第1次卵裂发生的位置存在两种情况,即卵的1/2和1/3处。双胞发育至5胞时也存在两种不同的发育方式,一种是双胞不移动直接分裂成3胞并列排列,另外一种是细胞进行移动,3胞呈三角形排列。通过观察30个卵的第1次卵裂和100个卵双胞的发育过程发现,这些不同的发育方式均是普遍存在的。④ 在25 ℃条件下,拟松材线虫卵的累积孵化率随时间增加而增加,在32 h时达到最高(93.31%),随后逐渐趋于稳定。⑤ 在25 ℃条件下记录了拟松材线虫卵从单胞发育至各个阶段的时间,完成整个胚胎发育过程需要约28 h。2龄幼虫接种于灰葡萄孢3 d后即可获得新的2龄幼虫,因此拟松材线虫完成整个生活史只需要3 d。【结论】对拟松材线虫卵从单胞阶段直至孵化的整个胚胎发育过程进行观察发现,拟松材线虫完成胚胎发育大约需要28 h,完成整个生活史需要3 d。对拟松材线虫产卵能力和卵的孵化率进行统计,收集拟松材线虫卵和2龄幼虫的最佳时间分别为16 h和36 h。拟松材线虫胚胎发育前期,在第1次卵裂期以及由双胞期发育至5胞期的两个过程中均存在两种与同属线虫不同的发育方式。这种现象还有待进一步研究。     

松材线虫与拟松材线虫hsp70和hsp90基因结构特征及其分子进化

转录组的多态性是探讨物种多样性与分子进化的重要方面。笔者选取物种间保守性较高的HSP70、HSP90蛋白作为研究对象,探讨二者在松材线虫和拟松材线虫基因组中的结构差异,探明他们在松材线虫和拟松材线虫中的特点,并试图揭示两种线虫的系统发育关系。结果表明二者内含子具有丰富的多态性,内含子中的G+C含量也显著不同。核酸序列gABG和gmc2分别编码松材线虫和拟松材线虫HSP70的642个氨基酸,相似性高达99%,仅存在9个氨基酸的差异,并且这种差异是由13个碱基的多态性造成的。gABO和gmc19分别编码松材线虫和拟松材线虫的HSP90,其氨基酸序列相似性为92%。对同义密码子的偏好性分析表明,17种氨基酸对应的58个密码子中,gABG和gmc2存在10个密码子差异,gABO和gmc19存在5个密码子差异。采用邻接法分别构建的系统进化树表明松材线虫与拟松材线虫hsp70和hsp90在系统发育关系上最为接近,并与其他线性动物门物种高度同源。     

松材线虫携带细菌的致病性

用松材线虫携带的3种细菌（菌株Njh,菌株Njt和菌株Njw)和2种线虫（松材线虫和拟松材线虫）为接种体，以黑松愈伤组织和黑松无菌苗为接种对象，分别用无菌线虫单独接种，细菌单独接种，细菌和无菌松材线虫混合接种，细菌和无菌的拟松材线虫混合接种等，测定对黑松愈伤组织和黑松无菌苗的致病能力，接种试验结果表明，单独用无菌松材线虫或松松材线虫接种，均不能使黑松愈伤组织褐变和无菌黑松苗枯萎，而用无菌线虫与上述3种细菌分别混合接种均能使黑松无菌苗发生枯萎及愈伤组织严重褐变，其中线虫和菌株Njh，线虫和菌株Njt致萎活性很强，线虫和菌株Njw致萎活性较弱，在自然界致病力弱的拟松材线虫与细菌混合接种同样能引起松苗严重萎蔫及愈伤组织褐变，实验室条件下，人工接种幼苗病害的发生与松材线虫携带的细菌密切相关，而与线虫的在关系不大，松材线虫所携带的细菌在这一病害过程中起至关重要的作用。     

松材线虫行为及松材线虫病的致病因子

松材线虫 (Bursaphelenchusxylophilus(Steiner&Buhrer)Nickle)病是松树上的一种毁灭性病害 ,主要由松墨天牛(MonochamusalternatusHope)传播 ,可危害黑松 (Pinusthunbergii)、马尾松 (P .massoniana)等多种松树。我国于 1982年在南京中山陵园风景区首次发现松材线虫病。目前 ,该病害已扩散到了我国的江苏、安徽、浙江、广东、山东、河北、台湾和香港 7省一地区 ,并且疫区有继续扩大的趋势。到 2 0 0 0年底 ,我国松材线虫病害发生面积已超过 7.3× 10 4hm2 ,累计枯死松树近 2× 10 7株 ,直接经济损失数亿元 ,使我国的松林资源、自然景观和生态环境遭受严重破坏。虽然投入了大量人力、物力和财力对松材线虫病进行了研究和防治 ,但目前仍未找到经济有效的可大面积遏制该病扩散和蔓延的系统配套技术措施。这主要是由于对松材线虫病的致萎机理还不十分清楚。因此 ,研究松材线虫病的致萎机理 ,不仅对于致病机理研究具有重要的理论价值 ,而且对于寻找新的防治途径也具有重要的实践意义。研究表明 ,一些外界因素会对松材线虫的行为产生影响。如 :重力会使松材线虫向下运动 ;松材线虫具趋光性 (这可能与松材线虫向松树梢部的扩散运动有关 ) ;温度也会对松材线虫的运动产生影响 ,适当的高温 (45℃ )可以阻止松材     

拟松材线虫两个HSP基因的克隆与分析

采用RACE(快速扩增cDNA末端)技术从拟松材线虫中克隆了HSP70蛋白编码基因mc2和HSP90蛋白编码基因mc19,两个基因的全长cDNA分别为2 067和1 222 bp。生物信息学分析结果表明：mc2基因的ORF为1 926 bp,推测的编码蛋白包含642个氨基酸,分子质量为170.85 ku,等电点为4.69。mc19基因的ORF为1 083 bp,推测的编码蛋白包含361个氨基酸,分子质量为97.70 ku,等电点为4.83。多序列比对和系统进化树结果分析都表明,拟松材线虫的mc2、mc19基因的编码蛋白与植物寄生线虫HSP70和HSP90蛋白具有较高的同源性,拟松材线虫和松材线虫之间的亲缘关系尤其密切。     

松材线虫分离及不同真菌对松材线虫繁殖的影响

主要对松材线虫的取样分离进行探索,并初步研究了以真菌作为食料培养松材线虫。结果表明：取样部位对分离效果有影响,蛀孔及蛹室周围分离到的线虫量明显比枝条及树干其他部位多;不同真菌培养松材线虫效果有差异,主要采用了灰葡萄孢、黄瓜镰刀菌和香蕉镰刀菌3种真菌,通过设计不同影响因素比较培养效果,发现灰葡萄孢培养效果较为稳定且最佳,其次是黄瓜镰刀菌。因此,灰葡萄孢和黄瓜镰刀菌可选用于培养松材线虫。     

松材线虫携带细菌的鉴定和毒性研究

从松材线虫病致死的松材木质部和松材线虫体表分离到3个出现频率较高的细菌菌株，菌株Nji、Njt和Njw。经鉴定3种细菌分别为荧光假单胞菌I型（Pseudomonas fluorescens biotype I)荧光假单胞菌Ⅱ型（Pseudomonas fluorescens biotype Ⅱ）和泛菌属某种（Pantoea sp.)。用牛肉膏蛋白胨液体培养基振荡培养细菌，培养液直接处理黑松愈伤组织，测定各细菌的产毒能力。与对照（空白培养液）相比，3种细菌的培养原液都可对黑松愈伤组织产生明显影响，其中菌株Nih和菌株Njt可以在2d内使愈伤组织明显变色，菌株Njw处理变色较慢。表明菌株Nij和Njt培养液内有大量致萎毒性物质存在。     

无菌松材线虫的获得及培养方法研究

采用不同浓度的H2O2和抗菌素处理松材线虫虫卵和松材线虫虫体,筛选松材线虫无菌化处理有效途径.多种方法的比较表明,采用高浓度抗菌素和低浓度H2O2交替并反复处理松材线虫虫体,获得无菌线虫的比例高,线虫生命力强.将获得的无菌松材线虫与带菌线虫分别用PSA和玉米粒上培养的灰葡萄孢进行人工培养,发现线虫生长繁殖情况无明显差异.     

松材线虫携带细菌数量的测定及无菌松材线虫的培养

对来源于自然条件和常规培养条件下的松材线虫携带的细菌数量进行了测定 ,并采用黑松愈伤组织对松材线虫进行了纯培养。结果表明 ,自然感病的黑松病组织中的松材线虫携带活细菌的数量平均为 2 .9× 10 2 个 条 ,灰葡萄孢菌丝上培养的松材线虫携带活细菌的数量平均为 3.0× 10 3 个 条 ;来源于自然感病的黑松和马尾松上的松材线虫 ,经无菌处理后 ,在黑松愈伤组织上生长良好 ,用 3g新鲜愈伤组织培养 9d ,虫口数量可达 10万余条。     

松材线虫低温冷冻保存研究

为满足大量松材线虫虫株长期保存的需要,对其低温冷冻保存技术进行了研究。试验比较了不同种类及浓度冷冻保护剂对松材线虫在低温冷冻保存时的保护效果,以及冷冻线虫繁殖力与致病力的变化。结果表明:使用15%甘油和4%DMSO作为冷冻保护剂,经-80℃保存1 d后,松材线虫存活率分别为(39.4±6.6)%和(37.5±21.8)%,且冻存10 d、1个月后均没有显著性下降。与未冷冻的线虫相比,冷冻线虫的繁殖力与致病力均未发生改变。     

松材线虫携带的细菌的寄生性和致病性研究

用荧光方法观察了松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）携带的细菌对悬浮培养的黑松（Pinus thunbergii）细胞的毒性,表明其中的假单胞菌、荧光假单胞菌和少动鞘氨醇单胞菌的滤液对黑松细胞具有较强的毒性,这与松树发病早期出现的细菌种类一致;这些细菌在添加松树提取液的细菌培养基上不能生长或基本不能生长,表明松树体内可能存在某些不利于细菌生长的物质;同时,单独接种这些细菌不能感染健康的黑松,因此,在线虫最初进入树体中,细菌的生长与线虫密切相关．     

松材线虫鉴定方法的研究与比较

通过形态学观察,同工酶分析,ITS-RFLP以及RAPD分析等方法分别对来自于不同国家和地区的40个线虫群体进行鉴定,并对四种分析方法进行比较.形态学观察可以初步区分松材线虫和拟松材线虫;通过谷草转氨酶的同工酶分析,可以准确地区分上述两种线虫;基于分子生物学的ITS-RFLP分析除了可以准确地鉴定两种线虫外,还可以对拟松材线虫的地域特征作出判断,划分为亚洲型和欧洲型;而RAPD分析不仅能准确地鉴定两种线虫,还可以描述各种松材线虫和拟松材线虫种内以及种间的遗传进化关系.