人类胰岛素基因的克隆及其真核表达载体的构建

从胎儿胰腺细胞中提取出总RNA作为模板,用特异性引物和RT-PCR法扩增INS基因的cDNA,PCR产物T-A克隆到T载体构建中间重组体pUC57-INS,其测序结果和Genbank公布的序列一致。HindIII和BamHI双酶切pUC57-INS后,将INS基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,经PCR扩增、酶切分析和序列测定后证实了重组表达质粒pEGFP-N1-INS构建成功。这将为转人类胰岛素基因动物模型的建立及人类糖尿病的基因治疗奠定必要的基础。     

GGT1基因的真核表达载体构建及其表达定位

构建GGT1重组真核表达载体,观察GGT1在COS7细胞中的定位.利用PCR技术扩增GGT1全长基因,经HindⅢ和EcoR Ⅰ酶切后连接入pEGFP-N1真核表达载体.将构建完成的重组表达质粒转染入COS7细胞,利用激光共聚焦显微镜观察GGT1在细胞中的定位.构建载体经双酶切和序列测定证实重组载体包含有正确的GGT1编码序列.激光共聚焦显微镜观察到,整个细胞内弥散绿色荧光,绿色荧光分布于COS7细胞浆中,提示GGT1定位于细胞浆中.成功构建人pEGFP-N1-GGT1真核表达载体,检测到GGT1定位于哺乳细胞的细胞浆中,为GGT1的功能研究提供了线索.     

PDXl与PAX4双基因表达腺病毒载体的构建与表达

运用pADxsi系统制备可表达人PDX1与PAX4双基因的重组5型腺病毒。从pEGFP-N1-PDX1质粒上酶切下目的基因PDX1并酶连到腺病毒穿梭质粒pShuttle-EGFP-CMV上,替换EGFP而得到pShuttle-CMV-PDX1;再将PAX4从pEGFP-N1-PAX4质粒上酶切下连到pShuttle-CMV-PDX1的多克隆酶切位点而得到穿梭质粒pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4;双酶切pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4将CMV-PDX1/CMV-PAX4转移到ADxsi骨架质粒上,得到pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4腺病毒质粒,然后在293细胞中进行包装并扩增重组腺病毒,并进行病毒滴度测定;体外感染人间充质干细胞。依据酶切、测序和PCR的结果均证明重组人PDX1与PAX4双基因表达腺病毒载体构建正确;而RTPCR与WB结果也显示目的基因在细胞中稳定表达。应用重组技术成功构建人PDX1与PAX4双基因表达5型腺病毒载体,转录因子PDX1与PAX4在间充质干细胞内稳定表达且定位于细胞核内。     

构建重组质粒pEGFP-N1-ND CyclinB1及在胃癌细胞SGC-7901中的表达

目的:构建真核表达载体pEGFP-N1-ND CyclinB1,并观察其在人胃癌细胞SGC-7901中的表达及对SGC-7901活性的影响.方法:通过RT-PCR法扩增不可降解CyclinB1(ND CyclinB1),将其插入到pEGFP-N1载体的XhoⅠ和BamHⅠ酶切位点,构建真核表达载体pEGFP-N1-ND CyclinB1,并以PCR、双酶切、测序鉴定.通过脂质体法转染胃癌细胞SGC-7901,进行荧光检测、Western blotting分析和流式细胞仪分析.结果:PCR、酶切及测序证明重组质粒pEGFP-N1-ND CyclinB1构建成功.转染胃癌细胞SGC-7901 24 h后,荧光显微镜下观察到绿色荧光.Western blotting检测到CyclinB1的表达明显增加.流式细胞仪检测重组质粒细胞组凋亡指数高于对照组,差异有显著性.结论:成功构建pEGFP-N1-ND CyclinB1荧光真核表达载体,并可在SGC-7901细胞中有效表达.     

pEGFP-N1/PDX1真核载体的构建与表达

目的: 构建胰腺十二指肠同源框蛋白1 (pancreatic and duodenal homeobox factor 1, Pdx1)转录因子真核表达质粒,并检测其在真核细胞中的表达能力及其生物活性.方法:以人胚胎胰腺组织基因组的mRNA为模板经RT-PCR扩增获得Pdx1基因编码序列,克隆到真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点中,构建pEGFP-N1/Pdx1真核表达质粒,并转染L02细胞,用RT-PCR、免疫组化、间接荧光法和Western Blot检测目的基因表达情况.结果:酶切与测序结果表明目的基因序列克隆正确;RT-PCR检测目的基因Pdx1 mRNA在靶细胞L02中表达;免疫组化和间接荧光结果证实Pdx1主要存在于细胞核内;Western blot检测到细胞核内Pdx1目的蛋白.结论:完成人Pdx1基因克隆,成功构建了目的基因Pdx1真核表达载体,并在L02细胞中获得有效表达.     

结核分枝杆菌ESAT6基因真核表达载体的构建及表达

为了研究结核杆菌毒力因子ESAT6在结核杆菌感染细胞过程中的功能。采用分子生物学方法,根据Gen-Bank中登录的结核杆菌H37Rv的ESAT6基因序列设计1对引物,以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增得到ESAT6基因DNA片段。将扩增片段克隆于pGM18-T载体中,测序验证后,再将ESAT6基因亚克隆至pEGFP-N1中,经核苷酸序列测定和酶切鉴定获得重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6。用重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6转染293T细胞。结果显示:重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6测序结果正确,转染细胞后出现绿色荧光,经Western blot分析鉴定,可见约35kDa的预期蛋白条带,证实ESAT6-EGFP融合蛋白在293T细胞中获得了表达。研究结果为进一步研究毒力因子ESAT6在感染宿主细胞中所发挥胞内生存机制奠定了基础。     

弹性蛋白酶保护因子--Elafin结构基因腺病毒载体穿梭质粒的构建、鉴定及表达

构建能表达弹性蛋白酶保护因子———elafin基因腺病毒表达载体的穿梭质粒,为进一步包装能高效表达结构蛋白的腺病毒载体做准备.以含有elafin基因的真核质粒pEGFP-N1-Elafin为模板,PCR扩增elafin基因,PCR产物以SalⅠ、EcoRⅤ双酶切,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中CMV启动子下游SalⅠ与EcoRⅤ位点之间,获得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-Elafin,通过SalⅠ及EcoRⅤ双酶切、PCR及插入片段序列测定对该质粒进行鉴定,将pAdTrack-CMV-Elafin转染293细胞,以RT-PCR及Western-Blot检测其在293细胞中的瞬时表达.结果表明:双酶切、PCR及测序鉴定证实,pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒的插入片段为elafin基因,用pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒转染293细胞后可见绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR和Western-blotting表明其可在293细胞中瞬时表达.     

人TCTP基因的克隆与原核表达

人翻译控制肿瘤蛋白（hTCTP）是一个在进化过程中高度保守且具有很高表达量的蛋白家族。本实验通过PCR技术扩增人hTCTP基因,经酶切后插入表达质粒pGEX-4T-2构建表达载体,转化大肠杆菌后挑选阳性菌进行菌落PCR及质粒酶切鉴定,确证克隆成功并构建了人hTCTP基因表达载体。重组表达载体经IPTG诱导表达出目的蛋白,用超声破碎、亲和层析和SDS-PAGE对目的蛋白进行了分离纯化并鉴定。     

LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

为构建人LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达及定位,通过基因重组的方法构建LMP3／pEGFP-N3重组真核表达载体,并通过酶切和基因测序鉴定。脂质体法转染HEK293细胞,用倒置荧光显微镜检测、分析其在HEK293细胞表达及定位。经酶切和基因测序鉴定LMP3／pEGFP-N3重组真核表达载体构建成功。转染HEK293细胞后,荧光显微镜检测显示融合蛋白仅在细胞浆中表达。说明基因重组技术可成功构建LMP3／pEGFP-N3重组体真核表达载体,重组表达的融合蛋白仅存在于细胞浆内。     

HPV16 E6基因真核表达载体的构建

本研究目的是构建HPV16 E6真核表达载体，为细胞转染研究E6蛋白和p53Arg或p53Pro蛋白的相互作用以及作用后对细胞功能的影响奠定基础。应用PCR技术从质粒pSP64-HPV16 E6上扩增出HPV16 E6片断。根据Kozak序列对真核蛋白表达的影响，设计2条引物扩增出2个HPV16 E6目的片断均插入真核表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）A中，构建pcDNA3．1／myc-His（-）A．HPV16 E6重组质粒。研究结果显示：经酶切和测序鉴定克隆的基因片段为HPV16 E6 cDNA；建立了pcDNA3．1／myc-His（-）A-HPV16 E6重组质粒。这表明，已成功构建HPV16 E6真核表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）A-HPV16 E6。     

人野生型p53基因的克隆及原核表达

利用RT PCR方法由人外周静脉血淋巴细胞中获得人p53 cDNA片段, 并将其克隆入原核表达载体pQE40中, 构建重组质粒pQE40-p53; 转化于E.coli M15宿主菌, 经IPTG诱导, 表达了N端融合6His的p53融合蛋白. 利用6His与Ni²⁺高亲合力结合的性质, 经镍柱纯化、 透析袋分级透析复性、 Western Blot鉴定, 结果表明获得了纯化的6His-p53融合蛋白.
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基于原子力显微镜研究p53蛋白与PBR322 DNA的相互作用

肿瘤(癌症)是由于细胞在复制过程中,DNA损伤不能修复导致细胞凋亡或者细胞无限增殖而形成的。DNA在细胞中转录和翻译都会涉及蛋白与DNA的结合,肿瘤抑制蛋白也是参与这一过程的关键蛋白之一。然而,众多研究发现,肿瘤抑制蛋白p53具有识别和修复损伤DNA的效果,对于细胞的凋亡、基因的保护和避免癌症发生有着重要的意义。有研究表明,金属镁离子和锌离子可以增强p53蛋白的结构稳定性和p53-DNA的亲和力。因此,我们基于原子力显微镜(AFM),直观地呈现出p53蛋白与PBR322环状DNA相互作用的图像,同时发现p53蛋白可以使环状DNA自身形成聚集或者相交。但是,对于长度相当的5 000bp的线状DNA几乎没有这样的效果,而对于20 000bp DNA不会出现这样的现象。然而,在高浓度镁离子环境下,环状DNA会扭转成为麻花状,即形成超螺旋结构。这一现象,可为p53蛋白功能和作用机理研究提供指导,也为癌症治疗、癌症药物开发以及癌症检测方法提供启发。     

p53抗体与恶性肿瘤

p53基因是人类肿瘤中突变频率最高的抑癌基因,几乎发生于所有的恶性肿瘤.突变基因编码的p53蛋白释放入血,可诱发机体自身免疫应答,产生p53自身抗体.在肿瘤病人和高危人群中检测血清p53抗体可以反映早期p53基因突变,作为一种新的肿瘤生物学指标,p53抗体有望在恶性肿瘤的早期诊断、治疗、预后、监测、复发等方面发挥重要作用.     

头颈部鳞癌中p53-mdm2基因异常的研究

目的:检测头颈部鳞癌患者p53基因突变、mdm2基因扩增的状况,了解其与头颈部鳞癌患者的性别、鳞癌分级、淋巴结转移等的相关性及两异常基因的相关性。方法:收集50例行手术切除的头颈部鳞癌患者的新鲜肿瘤组织及其相应的癌旁正常组织,提取标本DNA;用PCR-SS-CP-银染法检测p53基因第5~8外显子的突变状况;用dPCR法检测mdm2基因扩增情况;采用SPSS 10.0统计软件包行2检验分析实验结果。结果:在50例头颈部鳞癌患者标本中,检测出17例存在p53基因突变,突变率为34%,所有的癌旁正常组织未发现p53基因突变;在50例鳞癌标本中检测出6例标本存在mdm2基因扩增,扩增率为12%,其中有一例同时存在p53基因突变;p53基因突变、mdm2基因扩增与患者的鳞癌分级、淋巴结转移、性别等相关性分析结果均无统计学意义(P>0.05)。结论:p53基因突变与mdm2基因扩增在头颈部鳞癌中较常见,可能是头颈部鳞癌发生发展的主要分子机制。     

High frequency of p53 intronic point mutations in laryngeal squamous cell carcinoma

Intronic point mutations are rare and totally unknown for human laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC). To explore the relationship of p53 gene intronic mutation to the development of human LSCC, DNA was extracted from both tumor tissues and matched normal tissues of 55 patients with LSCC in northeast of China. Polymerase chain reaction amplification-single strand conformational polymorphism (PCR-SSCP) combined with silver staining and DNA direct sequencing were used to detect mutations in exons 7～8 (p53E7 and p53E8) and introns 7～8 (p53I7 and p53I8) of p53 gene. The p53E7 mutation was detected in 17 out of 55 patients, and the p53I7 mutation in 21 patients. No mutation was found at p53E8 or p53I8 site. The difference between tumor group and paired normal group on the rates of both p53E7 and p53I7 mutations was statistically significant. The rate of p53I7 mutations in tumor tissue was higher than that of normal tissue, and so was that of p53E7. Sequence analysis revealed that most p53I7 mutations were at the nucleotides in the branch point sequence or the polypyrimidine tract in the 3′-splice acceptor site of the intron 7. The high incidence of p53 gene intronic mutation in LSCC indicates that genetic changes within the noncoding region of the p53 gene may serve as an alternative mechanism of activating the pathogenesis of human laryngeal squamous cell carcinoma. Mutations in the noncoding region of this gene should be further studied.     

抑癌基因P53与肾母细胞瘤的研究进展

目的 :介绍近年来肾母细胞瘤(wilm瘤)与P53基因的研究进展。方法:查阅国内外有关文献进行综述。结果 :在wilms瘤中存在P53基因的丢失、突变和异常表达。结论 :P53基因与wilm瘤的发生及预后明确相关。     

肿瘤抑制基因p53的研究进展

综述了p53基因的特性、认识阶段、作用机理主其在癌症研究中的进展。