鸡主要组织相容性复合体I（BF2和β2m）二级结构与同源模建

为了推进鸡主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类分子（BF2，β2m）空间结构的研究，克隆、表达了鸡BF2和屉研基因，采用圆二色谱（CD）测定了其重组蛋白的二级结构，并同源模建了其三级结构．首先，将BF2和β2m基因分别插入原核表达载体进行了可溶性表达．对表达的融合蛋白进行纯化、蛋白酶切割并对切割后的蛋白进行分离和纯化，获得了麦芽糖结合蛋白（MBP）-BF2，β2m蛋白以及MBP单体．随后，测定了BF2和β2m的CD值．CD表明BF2蛋白呈典型的α螺旋；其中，α螺旋、β折叠、转角和随机蜷曲分别为72，102，70和90个氨基酸．β2m重组蛋白呈典型的卢折叠，α螺旋、β折叠、转角和随机蜷曲分别为0，46，30和22个氨基酸．同源模建显示鸡BF2和β2m蛋白与人HLA—A2和小鼠H2的3D结构类似．结果显示了BF2和β2m蛋白在二维和三维上的分子特征及其与抗原多肽结合氨基酸的空间分布，为以后进一步构建鸡BF2-β2m复合物体外鉴定病毒抗原肽系统奠定了基础．     

鸡复等位基因BF2与 β2m的结构解析

为了阐明鸡主要组织相容性复合体I(BF)和β2微球蛋白(β2m)不同复等位基因的分子结构，利用pMAL-p2X/E.coli TB1系统表达了5类不同复等位基因BF2的胞外区和一类新的β2m，并采用纯化、蛋白酶切和Western blot进行了鉴定.最后，采用圆二色谱(CD) 测定了各重组蛋白的二级结构以及同源模建了其三级结构. 5类不同复等位基因的BF2蛋白分子中的α螺旋、β片层、转角和随机卷曲的氨基酸长度分别为69—73,67—72,35—37和94—98. 5类不同复等位基因BF2和一类新的β2m蛋白分子的同源模建揭示了其结构与人和鼠的MHC I类分子类似，但各有其特征性的结构；研究获得了正确折叠、不同复等位基因的BF2和β2m蛋白分子，并为进一步形成BF2-β2m复合体、鉴定抗原表位提供了依据.     

冻藏对面筋蛋白二级结构的影响

采用圆二色谱法表征了不同冻藏模式和冻藏时间对小麦面筋蛋白二级结构的影响.结果表明:在SDS溶液中,未经冻藏的面筋蛋白二级结构主要由β折叠和无规则卷曲组成;当冻藏时间小于60天时,两种冻藏模式对小麦面筋蛋白的二级结构影响不大;恒温冻藏模式中面筋蛋白二级结构在冻藏90天时变化最显著,易溶部分中α螺旋转化为β折叠和β转角,难溶部分中β折叠和β转角转化为α螺旋和无规则卷曲;冻融冻藏模式中面筋蛋白二级结构在冻藏60天时变化最显著,易溶部分中α螺旋转化为β折叠和无规则卷曲,难溶部分中β折叠和β转角转化为α螺旋和无规则卷曲.这说明,在恒温冻藏模式下,只有当冻藏时间达到或超过90天的时候,才对面筋蛋白的二级结构产生影响,而在冻融模式下,冻藏时间仅为60天时便可对面筋蛋白的二级结构产生影响.     

hNDR2、mNDR2基因及其蛋白质结构分析研究

基于Internet服务器上的工具软件包对hNDR2和mNDR2两个基因结构进行了分析 ,并对其蛋白质结构进行了预测。结果表明 :hNDR2和mNDR2氨基酸序列具有 91.9%的相似性 ,hNDR2蛋白质二级结构有 9个α螺旋和 11个 β叠片 ,属于α/β折叠类蛋白 ;mNDR2蛋白质二级结构有 9个α螺旋和 12个 β叠片 ,属于α/β折叠类蛋白 ;两者都有一个跨膜螺旋结构     

圆二色光谱研究Ni^2＋诱导血清白蛋白构象变化

在生理条件(pH7.43)下,采用时间扫描圆二色光谱(CD)研究了Ni2 诱导人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)产生的构象变化.拟合计算远紫外CD光谱.结果表明,血清白蛋白在结合Ni2 过程中产生了鲜见的N→R态和R→T态两步构象变化.在结合的最初几分钟,血清白蛋白中的部分α-螺旋结构分别转变为了β-折叠、β-转角和无规卷曲,其含量从66%(N态)降低到约64%(R态).随后发生了相反的变化,达到结合平衡时,α-螺旋结构含量上升到68.7%(T态).近紫外CD光谱结果表明,血清白蛋白在结合Ni2 的过程中,二硫键及芳香氨基酸残基附近的微环境发生了缓慢扰动.CD光谱观察到该构象变化持续约3 h才达到平衡.对Ni2 诱导血清白蛋白产生两步构象变化的生理意义做了讨论,推测该构象变化能暴露结合位点,提供合适的立体配位空间.有助于血清白蛋白结合Ni2 .     

绿色荧光蛋白α2b-干扰素融合蛋白的表达与活性研究

采用基因重组技术,构建原核表达质粒pET 32a( )/GFP-α2b-IFN,转化大肠杆菌BL 21,以IPTG诱导融合蛋白的表达并用镍金属螯合层析柱进行纯化.SDS-PAGE及免疫印迹结果显示,46.0 kD的融合蛋白在大肠杆菌中得到了正确的表达,并具有α2b-IFN的抗原活性.受体结合实验表明,该融合蛋白能够与W ISH细胞上的干扰素受体特异性结合,并在激发光下呈亮绿色荧光.采用细胞病变法测定分离纯化的融合蛋白的抗病毒活性,比活力为1.0×107IU/m g.表达的GFP-α2b-IFN融合蛋白具有α2b-IFN的特性与荧光活性,为研究α2b-IFN受体功能以及IFN与细胞相互作用的机理奠定了基础.     

拟南芥PP2A B′调节亚基β亚型抗体的制备及鉴定

拟南芥中,蛋白磷酸酶2A(PP2A)B′调节亚基有9个亚型,其中α亚型和β亚型是油菜素内酯(BR)信号通路的正调节子,它们能使转录因子BZR1脱磷酸化.选择β亚型特异的一段多肽P109,利用大肠杆菌表达系统表达并纯化了连有HIS标签和GST标签的融合蛋白HIS-P109和GST-P109.以HIS-P109作为抗原,免疫新西兰兔,获得抗体,然后用GST-P109对抗体进行了亲和纯化.利用此纯化的抗体在不同的拟南芥材料中免疫印迹检测β亚型蛋白的表达,证实制备的抗体能与拟南芥PP2AB′调节亚基β亚型特异性反应,为深入研究PP2A在BR信号转导途径中的功能提供了有力工具.     

鸡β_2-微球蛋白及其硒代衍生物的制备和晶体学研究

禽流感的暴发使得禽类免疫系统的研究显得愈加迫切.而以其他种属的同源β2-微球蛋白作为模板进行结构解析,不能解析鸡β2-微球蛋白(Chβ2m)的晶体结构.为了利用硒原子的反常散射获取Chβ2m晶体X射线衍射的相位信息.本研究以pET21a为表达载体,E coli BL21(DE3)为宿主菌,在含有硒代甲硫氨酸的M9培养基中,用IPTG诱导表达硒代甲硫氨酸Chβ2m.包涵体经提取和稀释复性法复性之后,通过分子筛层析和Resource Q阴离子交换层析进行纯化,产物经SDS-PAGE检验纯度达98%以上.利用悬滴气相扩散法采用与Chβ2m蛋白晶体生长相同的条件.获得了衍生物可供衍射的晶体.通过北京同步辐射装置收集数据,最高分辨率至1.9 A.     

低能N^＋离子注入对超氧化物歧化酶分子二级结构及其活性的影响

超氧化物歧化酶经低能N 离子注入,应用圆二色光谱分析不同剂量低能N 离子注入对超氧化物歧化酶二级结构的影响,并分析了酶蛋白的二级结构变化对酶活性的影响.结果表明,在1×1015～10×1015ions/cm2范围,N 离子注入对超氧化物歧化酶二级结构产生影响,且不同剂量N 离子注入对超氧化物歧化酶的α-螺旋、β-折叠、β-转角及无规卷曲二级结构单元相对含量的影响程度不同.低能N 离子注入使超氧化物歧化酶的活性增加,酶活性增加与其α-螺旋结构的变化具有较好的关联性.     

重组植物AHA2蛋白的真核表达及纯化

AHA2蛋白位于植物细胞质膜上,该蛋白在原核蛋白表达体系中无法重组表达.已经报道的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达体系操作复杂,成本高昂.本文将拟南芥aha2基因(全长2984bp)插入真核表达载体pPICZαA中,线性化质粒pPICZαA-aha2,电转化毕赤酵母X33细胞,通过同源重组获得工程菌.以0.5%甲醇诱导表达72h后,收获细胞.冷冻研磨细胞,离心并收集上清进行亲和层析和分子筛纯化.SDS-PAGE分析结果显示,目的蛋白为97kD的条带.本研究成功的在毕赤酵母X33细胞中实现了拟南芥AHA2蛋白的表达和纯化.     

酸碱度对重组鱼腥藻脂肪氧合酶构象与活性的影响

以重组表达、纯化得到的鱼腥藻脂肪氧合酶为研究对象,通过测定鱼腥藻脂肪氧合酶在不同缓冲体系中分子构象的变化(主要研究二级结构,螺旋、折叠、转角和无序结构单元质量分数),分析了鱼腥藻脂肪氧合酶分子构象变化与不同缓冲体系之间的关系,探求鱼腥藻脂肪氧合酶构象变化与生物酶学特性之间的关系.研究结果表明,该酶的最适反应pH值为9,最稳定pH值为7;发现在不同缓冲体系中,鱼腥藻脂肪氧合酶的相对活性变化和螺旋结构、转角结构、无序结构有密切关系.在pH值为6～9时,酶活性与螺旋结构、转角结构总体呈正相关,但与折叠结构的质量分数变化呈负相关.最稳定的酶的二级结果是折叠结构、无序结构、螺旋结构和转角结构,其质量分数均在20％ ～30％.     

虎纹捕鸟蛛神经毒素Huwentoxin-Ⅰ的二级结构研究

Huwentoxin-Ⅰ是一种小分子量的多肽类毒素,它能阻断脊椎动物的神经肌肉接头传递。该毒素分子内含33个氨基酸残基,有三对二硫键。本文报道用圆二色性光谱分析法对该毒素二级结构的测定和分析,并用Creenfield等介绍的方法计算其二级结构中各种成分的含量。结果表明,此多肽分子中,α螺旋约占22—28％,β折叠约占22—35％,而β转角和无规卷曲约占41—49％。实验还表明,此毒素在不同pH条件下的二级结构均比较稳定,将它加热到80℃保温20分钟后再测定其CD光谱,其二级结构成分变化不大。用各种不同的方法对其二级结构进行了预测,结果表明该分子一级结构序列N-末端有一小段β折叠,C-末端有一段α螺旋,分子中部的大部分残基为β转角和无规卷曲构象。     

鸡白细胞介素2基因的克隆、原核表达及功能研究

以RT-PCR法从鸡脾脏细胞中扩增出鸡白细胞介素2编码基因,通过双酶切、连接步骤克隆进原核表达载体pQE30及pGEX-4T-3,构建了鸡白细胞介素2基因的重组原核表达质粒pQE30-chIL-2及pGEX-chIL-2.重组质粒转化大肠杆菌JM109后经诱导表达,分别得到两种表达产物.以SDS-PAGE和Westernblot检测确认表达产物为带6组氨酸标签及GST蛋白的融合鸡白细胞介素2,分子量分别为16 kDa及39.5 kDa.表达蛋白与抗鸡白细胞介素2单抗均有良好的免疫结合性,进一步证实为鸡白细胞介素2.表达产物经过纯化复性后,具有明显促进鸡脾淋巴细胞增殖的作用.     

结核分枝杆菌H37Rv组氨醇脱氢酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,扩增hisD基因,构建pET-28a-HDH重组质粒;转化重组质粒到E.coli BL21(DE3)并诱导表达,纯化可溶性的结核分枝杆菌L-组氨醇脱氢酶(HDH),并对其性质进行研究,结果表明:重组结核分枝杆菌L-组氨醇脱氢酶能以L-组氨醇和NAD 为底物催化L-组氨醇生成L-组氨酸;该酶的最适pH值为8.3,最适温度为45℃,比活力为1.788 U/mg;Mn2 ,Ca2 ,Zn2 ,Co2 等对酶促反应有激活作用;底物NAD 和L-组氨醇的米氏常数分别为0.9765 mmol/L和2.755μmol/L;25℃时重组蛋白的二级结构中有20.5%的α-螺旋,40.9%β-折叠,4.2%β-转角,34.3%无规卷曲.     

钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白2(SNAT2)多克隆抗体的制备

钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白2(SNAT2)属于SLC38家族,参与小的中性氨基酸跨膜转运,在哺乳动物组织中广泛表达.SNAT2的功能紊乱可以导致许多神经性疾病,如阿尔茨海默症、帕金森症等.采用PCR方法扩增得到SNAT2氨基端75个氨基酸的编码序列,构建重组质粒pET28a-SNAT2-75aa,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达重组蛋白.利用组氨酸标签蛋白经镍柱亲和纯化后得到了纯度在95%以上的SNAT2氨基端蛋白SNAT2-75aa,将其作为免疫原免疫新西兰大白兔,从而获得SNAT2多克隆抗体.采用巯丙基琼脂糖凝胶6B(Thiopropyl sepharose)固定抗原亲和纯化法进一步对该抗体进行纯化,纯化后的抗体效价至少提高10倍.蛋白免疫印迹确定该抗体对SNAT2具有高度的特异性,表明SNAT2多克隆抗体制备的成功,为进一步研究SNAT2蛋白的结构和功能奠定了生化基础.     

猪胰蛋白酶及其自溶活性产物的圆二色性研究

用圆二色性谱(CD谱)研究了猪胰蛋白酶及其自溶活性产物在溶液中的构象,并观察了在十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中酶分子构象的变化。 猪胰蛋白酶的CD谱显示有相当量的α-螺旋成份及少量β-折叠成份,它在190nm附近的[θ]值远大于牛胰蛋白酶。其自溶活性产物的CD谱显示α-螺旋的成份减少5—6％,β-折叠成份上升3—6％,而有序部分所占比例基本不变,提示自溶后α-螺旋转化为β-折叠。 在SDS溶液中,α-螺旋和β-折叠在胰蛋白酶分子中所占的比例提高,而α-螺旋成份增加更为明显,表明酶分子的有序度提高。 参照Chou与Fasman以及Chen,Yang与Martinez等人的方法,预测猪胰蛋白酶有36％的氨基酸残基可以形成α-螺旋,由实测CD谱计算,亦在37％左右,两者相符。     

PP2A B56α调节亚基原核表达载体的构建及表达

为了构建PP2A B56α调节亚基原核表达载体,以p CEP-4HA-B56α质粒为模板,设计引物克隆人源PP2A B56αc DNA,连入p GEX-4T-1载体中,测序正确后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并将诱导表达重组蛋白的菌体超声破碎后,进行可溶性分析,对可溶性蛋白进行纯化.SDS-PAGE电泳及Western Blot分析鉴定重组蛋白.结果表明,经测序和酶切鉴定后成功构建重组质粒p GEX-4T-1-B56α,表达大小约79 k D的重组蛋白,可溶性表达的重组蛋白为菌体总蛋白质量的8.6%,经GST纯化系统纯化得到纯度约为78.9%的重组蛋白,回收率达到52.2%.因此,本研究成功构建了PP2A B56α原核表达体系,获得重组蛋白,为研究PP2A B56α的生物学功能奠定了基础.     

拟南芥PP2A B'调节亚基β亚型抗体的制备及鉴定

拟南芥中,蛋白磷酸酶2A(PP2A)B’调节亚基有9个亚型,其中a亚型和β亚型是油菜素内酯(BR)信号通路的正调节子,它们能使转录因子BZR1脱磷酸化.选择β亚型特异的一段多肽P109,利用大肠杆菌表达系统表达并纯化了连有HIS标签和GST标签的融合蛋白HIS-P109和GST-P109.以HIS-P109作为抗原,免疫新西兰兔,获得抗体,然后用GST-P109对抗体进行了亲和纯化.利用此纯化的抗体在不同的拟南芥材料中免疫印迹检测β亚型蛋白的表达,证实制备的抗体能与拟南芥PP2A B '调节亚基β亚型特异性反应,为深入研究PP2A在BR信号转导途径中的功能提供了有力工具.     

人SEPT9蛋白同源建模和活性位点分析

利用生物信息学在线软件预测了人SETP 9蛋白质的二级结构和模体信息,同时对其三级结构进行同源建模和模建结果质量评价,其次预测了该蛋白质的活性位点信息,旨在从蛋白质序列特征和分子结构水平理解其在人类生理病理过程中的作用.结果表明,模建的SEPT 9蛋白结构品质较高,具有7段α-螺旋和2组β-折叠结构,是一个典型的α/β类蛋白,表面呈弱正电势分布;人SEPT 9蛋白具有8个不同模体,可能参与不同生化反应或执行不同的功能.搜寻获得了人SEPT 9蛋白配基结合位点有10个,其中位点1可能是该蛋白的活性位点.这些研究结果对理解人SEPT 9蛋白功能以及配基结合位点定位非常重要,也为针对SEPT 9蛋白的分子对接和药物从头设计提供了理论基础.     

小鼠Ogg1基因pET28a-mOgg1原核表达系统建立及其生物信息学探讨

将小鼠Ogg1(mOgg1)基因克隆至pET-28a(+)原核表达载体上,分析其相关的生物信息学特性.运用分子克隆的方法,获得重组质粒pET28a-mOgg1;经同源性分析证实与NCBI基因库中mOgg1基因相似度为100%;mOgg1基因可翻译成345个氨基酸序列,翻译后的蛋白不存在N-糖基化位点、跨膜螺旋区域,不含信号肽且无信号肽剪切位点,但含有31个磷酸化位点;运用在线软件对mOgg1蛋白进行结构分析并建立蛋白的3D结构,发现在该蛋白链上含有48%α螺旋、10%β折叠.成功获得了pET28a-mOgg1重组质粒,并对重组蛋白进行Western-blot鉴定,从基因及氨基酸组成上分析该蛋白的特性,由此探讨mOgg1基因及蛋白表达相关的生物信息学特性.