树鼩角膜内皮细胞体外原代培养方法的建立

摘要: 目的 建立树鼩角膜内皮细胞( corneal endothelial cells,CECs) 体外分离、培养及纯化的稳定技术,为人类眼科角膜疾病提供新的实验材料。方法 通过比较揭膜法、双酶消化法及揭膜-消化两步法,确定每种树鼩原代 CECs 取材方法的优劣性。分别使用 DMEM /F12,M199,Ham’s F12 /M199 三种培养液以确定树鼩 CECs 原代细胞最适培养液。使用 TGF-β 抑制剂、低血清培养法及梯度消化法来探讨树鼩 CECs 纯化的可行性。苏木精-伊红染色观察细胞形态,根据树鼩神经元烯醇化酶( NES) 设计并筛选特异性引物,使用 PCＲ 方法检测细胞 NES 表达情况并用 NES 抗体进行细胞免疫荧光染色鉴定。结果 揭膜法可以快速、有效得到高纯度的树鼩 CECs 细胞。Ham’s F12 /M199 培养液是树鼩 CECs 的最适培养液。使用 TGF-β 抑制剂可以达到 CECs 的纯化目的。结论 优化的树鼩 CECs 细胞培养纯化方法对树鼩 CECs 的体外培养更适宜,优化条件下分离培养的细胞符合 CECs 的一般特征。     

树鼩PD-1基因的分离、鉴定及表达分析

PD-1(Programmed cell death 1)是一种抑制性的受体,是免疫球蛋白超家族的成员.大量研究证明PD-1能被诱导而在活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞、NKT 细胞和单核细胞上表达,从而在慢性感染的病因学中起着重要作用.树鼩(Tupaia belangeri)做为一个理想的模型可被应用于许多人类感染性疾病如乙型病毒性肝炎.为了充分利用树鼩对于感染性疾病的宿主免疫应答模型,我们分离出树鼩PD-1基因.利用迅速扩增cDNA末端PCR(RACE-PCR)技术,从树鼩脾组织中克隆了PD-1基因的全长cDNA序列.序列分析显示树鼩PD-1 cDNA 的开放阅读框编码一个由242个氨基酸组成的跨膜蛋白,并且和人类、灵长类和啮齿类中的同源基因有高度相似性.组织分布分析表明在所检测的几种组织中PD-1基因只在脾中表达.此外,淋巴细胞刺激实验显示,利用PMA和ionomycin刺激新鲜分离的树鼩外周血单核细胞(PBMCs)能够诱导PD-1 mRNA水平上的表达.我们的结果为将来进一步探讨树鼩的免疫功能提供了良好的基础.     

红藻氨酸致癫痫大鼠不同时点神经生长因子变化研究

摘要: 目的 探讨红藻氨酸( Kainic Acid,KA) 致癫痫大鼠癫痫发作过程中海马组织神经生长因子( nerve growth factor,NGF) 不同时间点表达量的变化。方法 腹腔注射 KA 建立大鼠癫痫模型。采用 TaqMan 探针实时定量 PCＲ ( Ｒeal-time quantitative PCＲ) 技术,检测注射 KA 后不同时点大鼠海马组织中 NGF 表达量的变化。结果 与 NGF 表达量与生理盐水对照组( NS) 相比,6 ～ 12 h NGF 表达量明显低于 NS 组( P ＜ 0. 05) 、48 ～ 72 h NGF 表达量开始升高并高于 NS 组,在 24、72 h 时其表达量显著高于 NS 组( P ＜ 0. 05) 。结论 NGF 对致癫大鼠的海马具有修复与保护作用。     

SPF 级FMMU 白化豚鼠基础生理指标的测定与比较

摘要: 目的测定与比较SPF 级FMMU 白化豚鼠血液指标、心率、颈总动脉压及心室压、脏器参数。方法取30 只雌雄各半、体质量250 ～ 300 g 范围内SPF 级FMMU 白化豚鼠,心脏采血后分别检测血常规、血生化及血气指标; 穿刺颈总动脉量取动脉压,辅助呼吸下开胸测定心室压; 解剖后称量各脏器质量。结果雄性与雌性豚鼠比较: 血液指标中,红细胞、血红蛋白、红细胞压积、谷草转氨酶、淀粉酶、胆固醇、二氧化碳总量、实际碳酸氢根、钠离子、总血红蛋白差异有显著性意义( P ＜ 0. 05 或P ＜ 0. 01) ; 颈总动脉舒张压、颈总动脉平均压、左心室舒张压、右心室收缩压、右心室平均压差异有显著性意义( P ＜ 0. 05 或P ＜ 0. 01) ; 体质量、脑质量差异以及脑垂体、肾上腺、左肾、右肾脏器系数差异有显著性意义( P ＜ 0. 05 或P ＜ 0. 01) 。结论不同性别的SPF 级FMMU 白化豚鼠血生理生化、血气、 颈总动脉压、心室压指标及脏器参数存在差异。     

不同福利条件下ICＲ 小鼠肝细胞NF-κB 表达的比较

摘要: 目的比较不同福利水平下ICＲ 小鼠肝脏NF-κB 的表达。方法选取6 周龄雄性ICＲ 小鼠,交叉使用制动和丰富环境干预形成不同的福利环境,观测小鼠的体质量增重、饲料能效及脾脏系数,ELISA 法测定血清IL-2 和COＲT,实时定量PCＲ 和免疫印迹法分别检测小鼠肝细胞内NF-κB p65 的mＲNA 和蛋白表达水平。结果与对照组相比,丰富环境组小鼠的体质量增重显著提高( P ＜ 0. 05) ,其他指标无差异( P ＞ 0. 05) ; 丰富环境+ 制动组小鼠的体质量增重、脾脏系数显著低于对照组( P ＜ 0. 05) ,而COＲT、NF-κB p65 的基因和蛋白表达显著高于对照组( P ＜0. 05) ; 制动组的体质量增重、饲料能效、脾脏系数及血清IL-2 均显著低于对照组( P ＜ 0. 05) ,COＲT、NF-κB p65 的基因和蛋白表达均显著高于对照组( P ＜ 0. 05) 。其中制动组的体质量增重显著低于丰富环境+ 制动组( P ＜0. 05) ,COＲT、NF-κB p65 的基因和蛋白表达显著高于丰富环境+ 制动组( P ＜ 0. 05) 。结论不同组别小鼠存在福利水平差异,NF-κB 表达差异与福利差异相类似,福利水平与NF-κB 表达水平之间存在紧密关联。     

树鼩脂肪转录组SNP 位点发掘及其功能注释

摘要: 从正常笼养树鼩腹部的脂肪转录组数据开发SNP 分子标记。检测了6 只动物共计274 278 568 条unigene( 总长度43 138 417 bp) 序列信息后,在262 980 条unigene( 5. 75%) 中发现SNP 位点263 071 个,SNP 发生频率为1 /164 bp,其中转换( transition) 177 562 个,颠换( transversion) 85 509 个。在所有变异类型中,A/G 和C/T 发生频率最高,分别达33. 85%和33. 66%。将包含SNP 位点的262 980 条unigene 通过参比序列进行注释,并对其进行GO分类、COG 分类注释和代谢通路注释( KEGGpathway) ,结合已有研究,分别筛选到1 187 个有GO 注释、77 个有COG注释和1 080 条个有KEGG 通路注释的脂肪转录组中的可能与脂肪形成和代谢有关的SNP 标记。     

H-1 细小病毒感染大鼠神经胶质瘤细胞C6 机制的初步探讨

摘要: 目的探讨H-1 细小病毒感染大鼠神经胶质瘤细胞C6 后细胞因子水平的变化。方法取感染C6 细胞后不同时间点的H-1 细小病毒,同时取相同时间点的正常C6 细胞,采用ELISA 方法检测同时检测TNFα、IL-6、TGF-β1和IL-17A 的表达水平。结果正常C6 细胞中TNF-α、TGF-β1 和IL-17A 的浓度随培养时间增长而提高, IL-6 浓度无明显变化; H-1 细小病毒感染的C6 细胞中TNF-α、TGF-β1 和IL-17A 浓度无明显变化,而IL-6 浓度随感染时间推移而显著增加。结论H-1 细小病毒感染导致C6 细胞中细胞因子表达水平的变化。     

沙漠干热环境不同温度对创伤失血性休克猪生存时间的影响

摘要: 目的探讨沙漠干热环境下不同温度对创伤失血性休克猪生存时间的影响,为进一步的研究提供理论依据。方法选取雄性的长白仔猪30 头( 25-35 kg) ,随机分为常温实验组( 环境温度25℃ ± 1℃,湿度35% ± 5%,n =10) ,干热环境Ⅰ组( 环境温度40. 5℃ ± 0. 5℃,湿度10% ± 2%,n = 10 头) ,干热环境Ⅱ组( 环境温度41. 5℃ ±0. 5℃,湿度10% ± 2%,n = 10 头) 。将实验动物置于人工实验舱内,按实验设计设置相应的环境参数,分别在各自环境暴露3 h,建创伤失血性休克模型,观察生命体征及死亡时间。结果1． 常温组创伤失血性休克后体温较长时间稳定在一定水平,稳定期后呈进行性下降; 而干热Ⅰ组休克后缓慢上升,两相邻时间点温度无显著差异; 干热Ⅱ组模型成功后体温很快升至42℃,一直呈快速上升趋势,直至动物死亡,相邻两时间点体温差异显著。2． 常温组模型成功后三组的平均存活时间分别是( 567 ± 16. 9) min、( 178 ± 3. 6) min、( 61 ± 2. 8) min,三组平均生存时间差异显著。结论1． 沙漠干热环境创伤失血性休克存活时间明显短于常温环境,提示沙漠干热环境可加速创伤失血性休克动物死亡; 2． 而沙漠干热环境Ⅱ组存活时间更短,提示在沙漠干热环境下,环境每升高1℃,可明显缩短创伤失血性休克猪的生存时间。3． 体温升高的速度与死亡速度呈正相关,温度升高越快死亡时间快,生存时间越短,提示沙漠干热环境创伤失血性休克救治过程中有效地控制体温可能具有重要的临床意义。     

破壁灵芝孢子粉胶囊毒性的实验研究

摘要: 目的观察破壁灵芝孢子粉胶囊毒性。方法( 1) 急性毒性试验: 选用昆明种小鼠20 只,雌雄各半,实验前禁食16 h, 24 h 内灌胃3 次,剂量为15 g /kg BW。灌胃后,连续观察7 d,记录中毒表现及死亡情况。( 2) 30 d 喂养试验: 断乳大鼠,体质量60 g 左右, 80 只,雌雄各半。随机分为4 组,即对照组和高、中、低剂量实验组( 1. 5、0. 75、0. 375 g /kg BW) ,各剂量组在基础粉料中分别掺入1. 5%、0. 75%、0. 375% 的受试物,单笼喂养,自由饮食,记录大鼠进食量、体质量,连续喂养并观察30 d。观察动物的一般表现、体质量、食物利用率,血常规及生化指标: 白细胞计数及其分类、红细胞计数、血红蛋白、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、尿素氮、肌酐、胆固醇、甘油三酯、血糖、总蛋白、白蛋白。结果各剂量组动物体质量、食物利用率与对照组比较差异无显著性( P ＞ 0. 05) 。其血液指标: 白细胞计数及其分类、红细胞计数、血红蛋白; 生化指标: 谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐、胆固醇、甘油三脂、血糖、总蛋白、白蛋白均在正常值范围; 病理学检查未见有意义的病理变化。该受试物对两种性别小鼠的急性毒性LD50均大于15 g /kg BW。结论破壁灵芝孢子粉胶囊属无毒级。     

以斑马鱼模型评价6 种药物的神经毒性

摘要: 目的以斑马鱼为模式生物,评价6 种已知对人类具有神经毒药物吗替麦考酚酯、异烟肼、环孢素A、卡马西平、苯妥英钠和乙醇对斑马鱼的神经毒性。方法挑选受精后5 d( 5 dpf) 的野生型AB 系斑马鱼在含吗替麦考酚酯( 4. 5、15、45 和51 μmol /L) 、异烟肼( 1 460、4 866、14 599 和15 328 μmol /L) 、卡马西平( 17. 5、58. 3、175 和187μmol /L) 、苯妥英钠( 16. 7、55. 7、167 和185 μmol /L) 、乙醇( 0. 18%、0. 63%、1. 81% 和2. 0%) 、环孢素A( 5、16. 7 和50 μmol /L) 的养鱼用水中暴露,实验过程中不做换液处理, 24 h 后,利用斑马鱼行为分析仪检测斑马鱼的总运动距离,评价6 种药物对斑马鱼运动活力的影响; 受精后1 d( 1 dpf) 的运动神经元转基因斑马鱼胚胎在含吗替麦考酚酯( 0. 15、0. 5、1. 5 和5. 5 μmol /L) 、异烟肼( 10 971、36 596、109 708 和111 825 μmol /L) 、卡马西平( 45. 9、153、459 和 484 μmol /L) 、苯妥英钠( 200、667 和2000 μmol /L) 、乙醇( 0. 19%、0. 62%、1. 86% 和1. 98%) 、环孢素A( 5、16. 7 和 50 μmol /L) 的养鱼用水中暴露,实验过程中不做换液处理, 48 h 后,在荧光显微镜下拍照,分析统计斑马鱼次级运动神经元轴突的长度,评价6 种药物对斑马鱼运动神经元轴突生长的影响。结果吗替麦考酚酯、乙醇、卡马西平暴露后,随着浓度增加,斑马鱼运动距离先增加后减少,产生典型剂量依赖性倒“U”型运动; 异烟肼和苯妥英钠暴露后,随着浓度增加,对斑马鱼运动活力抑制作用逐渐增强; 环孢素A 暴露后,随着浓度增加,斑马鱼产生兴奋性,斑马鱼总运动距离逐渐增加; 6 种药物作用后,斑马鱼运动神经元轴突长度均变短,表明6 种药物在实验剂量下均能抑制运动神经元轴突的生长。结论斑马鱼模型可用于初步评价药物神经毒性。     

大黄牡丹汤组方对急性胰腺炎模型大鼠胰腺微循环的影响

摘要: 目的研究大黄牡丹汤组方( ＲPDP) 对急性胰腺炎( AP) 模型大鼠胰腺早期胰腺微循环的改变,探讨微循环改变在AP 发生发展中的作用,观察ＲPDP 对胰腺微循环的影响。方法60 只SD 大鼠随机分为药物作用4 h 假手术( SO) 组、模型组和ＲPDP 组; 药物作用8 h SO 组、模型组和ＲPDP 组,每组各10 只。模型组和ＲPDP 组在距离胆胰管开口0. 3 mm 处的胆管,经十二指肠壁浆肌层针刺,用3. 5%牛磺胆酸钠0. 1 mL/100 g 缓慢注射,建立SD 大鼠AP 模型,治疗组用ＲPDP 40 g /kg 灌胃1 次。分别与给药后4 h 和8 h,麻醉相应组大鼠抽取血液及腹水,检测各组血清和腹水淀粉酶含量。用荧光显微流速测试方法,观察胰腺微血管在造模后4 h 和8 h 的变化。结果模型组大鼠胰腺微循环血流速度存在差异,ＲPDP 治疗组血流速度则比较一致。与SO 组比较,模型组大鼠血清淀粉酶及腹水淀粉酶均显著升高; 与模型组比较,ＲPDP 组大鼠血清淀粉酶及腹水淀粉酶均显著降低( P ＜ 0. 01) 。结论AP发病与胰腺微循环障碍有关,AP 向重症急性胰腺炎( SAP) 发展也与其有关,AP 时胰腺水肿与坏死同时存在。ＲPDP 有改善AP 模型大鼠胰腺微循环的作用。     

两株小鼠诺如病毒的分离与鉴定

摘要: 目的了解江苏地区常用实验小鼠诺如病毒( murine norovirus,MNV) 的感染情况及进化特征。方法在江苏地区抽取三个实验动物中心的实验小鼠,采集直肠及内容物样本,应用ＲT-PCＲ 方法检测MNV OＲF2 特异性基因( 547bp,MNV nt5104-5650) 。阳性样本经ＲAW264. 7 细胞分离病毒,对MNV 分离株的VP1 基因进行扩增,将其连接在pEASY-Blunt 载体上,转化至大肠杆菌Trans1-T1 感受态细胞,通过Kanamycin 抗性筛选,挑取菌落进行PCＲ鉴定,鉴定为阳性的克隆送检测定其VP1 基因序列,构建系统发生进化树。结果共检测小鼠直肠内容物30 份,检出MNV 阳性样本4 份,包括ICＲ 小鼠( 2 /8) 、BALB/c 小鼠( 1 /12) 和C57BL/6J 小鼠( 1 /10) ,感染率为13. 3%;ＲAW264. 7 细胞接毒盲传三代,两只ICＲ 小鼠样品接种的细胞产生明显细胞病变( CPE) ,表现为细胞圆缩聚集,大部分脱落死亡,而C57BL/6J 和BALB/c 小鼠样本接种ＲAW264. 7 细胞无CPE; 应用VP1 特异引物经ＲT-PCＲ 检测,表现CPE 的细胞样本出现特异条带,测序结果显示分离到的2 株MNVVP1 核酸序列均为1626bp,与引物设计参考毒株S7-P2( GenBank 登录号: AB435514) VP1 基因大小相同,进化树图表显示检测到的2 株MNV 属同一独立小分支与参考株BJ10-2062、CＲ4 最为相近。结论此次抽检的实验小鼠MNV 感染率为13. 3% ( 4 /30) ,考虑可能在同一设施内传播。常用实验小鼠携带病毒的生物学意义有待进一步研究。     

ＲAG2 /IL2ＲG 双基因缺陷小鼠杂交群体的建立

摘要: 目的建立ＲAG2 /IL2ＲG 双基因缺陷的CＲG 小鼠杂交群体。方法将ＲAG2 基因缺陷小鼠与IL2ＲG 基因缺陷小鼠分别进行繁殖,选取ＲAG2 基因缺陷雄鼠ＲAG2( － / － ) 与IL2ＲG 基因缺陷雌鼠IL2ＲG( － / － ) 进行配对,培育杂交后代,通过PCＲ 扩增基因组ＲAG2 和IL2ＲG 基因进行鉴定; 应用流式细胞仪分析检测ＲAG2 /IL2ＲG 双基因缺陷小鼠外周血T 细胞( CD3 + ) 、B 细胞( CD19 + ) 和NK 细胞( CD49b + ) 含量; 并测定8—12 周龄ＲAG2 /IL2ＲG 双基因缺陷小鼠血液生理生化及主要脏器重量指标。结果成功繁育ＲAG2 基因缺陷小鼠和IL2ＲG 基因缺陷小鼠,筛选获得稳定的ＲAG2 /IL2ＲG 双基因缺陷小鼠并成功保种和扩群; 该双基因缺陷小鼠外周血淋巴细胞中T 细胞、B 细胞,NK 细胞比例显著降低( P ＜ 0. 05) ; 与相同周龄野生型C57BL/6 相比9 项血清生化指标无明显变化( P ＞ 0. 05) ; 18 项血液生理指标中红细胞( ＲBC) 和血红蛋白( HGB) 含量显著降低( P ＜ 0. 05) ; 白细胞( WBC) 、淋巴细胞数( LYMPH) 、淋巴细胞比率( LYM) 、单核细胞、中性细胞数( NEUT) 降低极显著( P ＜ 0. 01) ; 脾脏重量显著均低于野生型C57BL/6 小鼠( P ＜ 0. 05) ; 人肝肿瘤传代细胞移植于ＲAG2 /IL2ＲG 双基因缺陷小鼠后,肿瘤移植成功率和生长速率均明显高于亲本单基因缺陷小鼠( P ＜ 0. 05) ,成功获得了临床肝癌病人肿瘤组织的异种移植模型。结论 成功构建筛选出ＲAG2 /IL2ＲG 双基因缺陷小鼠杂交群体。     

穴位埋线联合东莨菪碱治疗对吗啡依赖大鼠十二指肠表达5-羟色胺的影响

摘要: 目的探讨穴位埋线加东莨菪碱治疗对吗啡依赖大鼠十二指肠5-羟色胺( 5-HT) 免疫反应( IＲ) 细胞的影响。方法本试验将大鼠随机分为正常组、自然戒断组( 简称戒断组) 、东莨菪碱治疗组( 简称西药组) 、穴位埋线治疗组( 简称穴位埋线组) 及穴位埋线加东莨菪碱治疗组( 简称穴位埋线加西药组) 。腹腔注射吗啡建立吗啡依赖大鼠模型,经不同的方法干预后,观察戒断症状,并于干预后7d 和14d 分别取材。观察十二指肠5-HT-IＲ 细胞形态特点,并比较各组十二指肠组织匀浆中5-HT 的含量。结果吗啡依赖大鼠戒断症状明显,其十二指肠黏膜5-HT-IＲ细胞数和组织匀浆中5-HT 含量均明显增加( P ＜ 0. 01) ; 治疗7d,与自然戒断组比较,各治疗组均有明显效果( P ＜0. 05) ,并以穴位埋线加西药组改善最为显著( P ＜ 0. 01) ,几乎恢复到正常水平; 治疗时间延长至14d,除自然戒断组外,各治疗组的检测指标均接近正常组( P ＞ 0. 05) 。结论西药治疗与穴位埋线治疗对吗啡依赖所致大鼠的戒断症状及十二指肠分泌5-HT 的功能均有逆转作用,两种方法结合可缩短治疗时间,治疗效果更佳。     

病理学监测在实验动物质量评价中的地位

摘要: 目的从病理学角度评价啮齿类实验动物的健康情况,为实验动物质量评价提供依据。方法采集不同等级啮齿类实验动物的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠和小肠,经10% 中性福尔马林固定液固定,通过石蜡切片、HE 染色、PAS 染色、冰冻切片、油红O 染色后于显微镜下观察。结果虽然被检测动物的微生物学、寄生虫学和遗传学等指标都能达到或符合国家质量标准,但是病理学监测中都能观察到不同程度的组织病理学损伤,主要出现在肝脏、肺脏和肾脏,有时也发生在心脏、消化道和淋巴器官等。结论该结果说明,虽然啮齿类实验动物符合国家微生物学等标准,但仍有部分实验动物处于亚健康状态。病理学监测在实验动物质量评价中有着不可替代的重要作用。相关监管部门应该尽快制定实验动物病理学诊断的国家及地方标准,完善实验动物质量监测体系。     

小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCＲ 方法的建立

摘要: 目的为实验动物微生物检测提供一种简便、灵敏、快速,并且特异性强的小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCＲ 检测方法。方法根据小肠结肠炎耶尔森氏菌fox 基因、假结核耶尔森氏菌inv 基因、志贺氏菌ipaH 基因及空肠弯曲菌gyrA 基因设计并筛选出特异性引物; 优化退火温度等条件,分析多重PCＲ 的特异性、敏感性,使用该多重PCＲ 方法检测小鼠和豚鼠样品。结果多重PCＲ 扩增出了预计的PCＲ产物,即小肠结肠炎耶尔森氏菌( 511 bp) 、假结核耶尔森氏菌( 779 bp) 、志贺氏菌( 290 bp) 和空肠弯曲菌( 156 bp) 。该方法的灵敏度为1 × 10 － 3 ng /μL( 小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌) 和1 × 10 － 2 ng /μL( 空肠弯曲菌) 。特异性检测未从其他菌中检测出阳性条带。使用该方法从样品中检测出不等的阳性样品数。结论该多重PCＲ 方法对实验动物微生物检测具有很好的应用和开发前景。