水飞蓟素对雏鸭人工感染鸭肝炎病毒疗效的观察

目的为了探索水飞蓟素对鸭病毒性肝炎的治疗效果。方法100只雏鸭分为5组,于11日龄接种鸭肝炎病毒。第1、2、3组腿肌接种5×104倍稀释的病毒尿囊液,并分别每天口服0、30、10 mg·kg^-1的水飞蓟素;第4组仅每天口服10 mg·kg^-1的水飞蓟素;第5组为空白对照组。试验期内正常喂食及饮水,于攻毒后的第5天足背静脉采血,分离血浆,比色法测定血浆谷-草转氨酶和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性水平。结果雏鸭人工感染病毒后,在96 h内死亡严重,适当剂量的水飞蓟素具有良好的保护作用。雏鸭感染病毒后血浆GOT活性增强、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性下降,口服水飞蓟素可明显改善这些效应。结论适当剂量的水飞蓟素可有效防止人工感染型鸭肝炎病毒导致的死亡,其机制可能与水飞蓟素的护肝作用和免疫调节作用有关。     

猕猴不同组织器官中黄嘌呤脱氢酶 /氧化酶基因的mＲNA 表达的半定量 ＲT - PCＲ 检测方法的建立

摘要: 目的 建立半定量 ＲT-PCＲ 检测方法检测猕猴体内肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中黄嘌呤氧化脱氢酶( XDH /XO) 的 mＲNA 的表达。方法 分别提取健康猕猴新鲜肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中总 ＲNA,用 ＲT-PCＲ 二步法进行 XDH /XO 基因片段扩增,内参基因选用管家基因 GAPDH,对获得的目的片段进行序列测定以鉴定其特异性,在凝胶影像分析仪 Quantity one 软件得出其电泳条带的灰度值( IOD) ,计算目的基因与内参基因比值得到猕猴不同组织 XDH/XO 的 mＲNA 的相对表达量。结果 建立了半定量 ＲT-PCＲ 检测方法,猕猴不同组织 XDH /XO 的 mＲNA 表达在肝脏组织中表达水平最高,其次为心肌,肾脏,睾丸,皮肤。结论 本研究所建立的半定量 ＲT-PCＲ 检测方法可应用于检测猕猴各组织器官组中的 XDH /XO 的mＲNA 的表达差异。     

腺病毒载体介导GFP基因在鸭胚和雏鸭体内的表达

本试验旨在探讨腺病毒在鸭胚和雏鸭体内的感染情况,为腺病毒作为外源基因载体在活体上进行RNA干涉奠定基础．将GFP基因重组腺病毒（Adv-GFP）静脉注射15日龄鸭胚和10日龄雏鸭,在感染后不同时间采集组织器官,制作冰冻切片,荧光显微镜观察GFP基因在鸭胚和雏鸭组织器官中的表达．结果发现,GFP基因在Adv．GFP感染后24-72h能在鸭胚肝脏及心肌细胞中表达,在感染后1-5d,GFP基因可在雏鸭肝脏、脾脏、腔上囊中稳定表达．本试验首次证明腺病毒作为安全的外源载体,可介导外源基因在鸭胚和雏鸭体内的靶器官中持续稳定表达,为在鸭上进行病毒病的基因治疗提供了基础数据．     

腺病毒载体介导GFP基因在鸭胚和雏鸭体内的表达

本试验旨在探讨腺病毒在鸭胚和雏鸭体内的感染情况,为腺病毒作为外源基因载体在活体上进行RNA干涉奠定基础．将GFP基因重组腺病毒（Adv-GFP）静脉注射15日龄鸭胚和10日龄雏鸭,在感染后不N时间采集组织器官,制作冰冻切片,荧光显微镜观察GFP基因在鸭胚和雏鸭组织器官中的表达,结果发现,GFP基因在Adv-GFP感染后24-72h能在鸭胚肝脏及心肌细胞中表达,在感染后1-5d,GFP基因可在雏鸭肝脏、脾脏、腔上囊中稳定表达,本试验首次证明腺病毒作为安全的外源载体,可介导外源基因在鸭胚和雏鸭体内的靶器官中持续稳定表达,为在鸭上进行病毒病的基因治疗提供了基础数据．     

Ⅰ型鸭肝炎病毒(MY株)活疫苗毒种的纯粹及生产条件探索

将Ⅰ型鸭肝炎鸡胚化弱毒MY株进行纯粹检验；以100ELD50 0.2mL/枚(含病毒3.0×105个拷贝)剂量经鸡胚尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚,每隔12h观察并采集鸡胚胚体和尿囊液样本,运用自行建立的检测DHV-1的SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法检测MY株弱毒的鸡胚增殖规律.结果表明,该毒种符合...     

实验性鸭瘟的病原动态分布及病理组织学观察

针对30只DPV攻毒试验鸭及30只同居鸭的体内DPV-DNA动态分布及病理组织学变化,采用PCR技术和常规病理学方法进行研究、结果显示：（1）DPV攻毒后6h,用PCR方法在肝、脾、法氏囊、胸腺、血液、直肠粪便可检测到DPV-DNA（2）DPV经不同途径感染成年鸭后,病毒在体内的动态分布有一定的差异．（3）在自然感染的情况下,肝、肺、血液．胸腺、直肠粪便可作为鸭瘟病原DNA早期检测的首选取材样本．（4）DPV感染后,患鸭的肝脏、肾小管上皮细胞．脾脏、法氏囊及胸腺网状细胞可见核内包涵体．（5）组织病变与病原分布的时序性相关,试验组鸭在DPV攻毒后24h,同居感染组鸭在同居后72h,心、肝、肺、肾、大脑、脾脏、法氏囊、胸腺、十二指肠等组织均表现出程度轻微的实质细胞肿胀、变性;继而发展为细胞水肿、坏死,间质严重出血（6）免疫器官胸腺、脾、法氏囊、骨髓的病原检出及组织病变皆发生在DPV感染的早期,病变器官从组织水肿、充血、出血、淋巴细胞数量减少,迅速发展为坏死．上述结果为研究DPV的致病机理、鸭瘟的早期诊断和鸭瘟的防制提供了依据．     

鸭病毒性肝炎的诊断与治疗研究进展

鸭病毒性肝炎是雏鸭的一种高致死、高度传播的病毒性疾病,并常和其他病毒、细菌混合感染,雏鸭一旦感染,可在鸭群中迅速传播,且病死率高,使养殖户遭受严重的经济损失。文章简要概述了鸭病毒性肝炎综合诊断方法,包括流行病学,病原检测和治疗的研究情况。     

鸭病毒性肝炎的诊断与治疗研究进展

鸭病毒性肝炎是雏鸭的一种高致死、高度传播的病毒性疾病,并常和其他病毒、细菌混合感染,雏鸭一旦感染,可在鸭群中迅速传播,且病死率高,使养殖户遭受严重的经济损失.文章简要概述了鸭病毒性肝炎综合诊断方法,包括流行病学,病原检测和治疗的研究情况.     

Gln 对鸭瘟感染鸭十二指肠免疫调节相关基因表达量的影响

摘要: 目的 为谷氨酰胺( Glutamine,Gln) 在正常鸭及鸭瘟( Duck plague,DP) 模型中对肠道功能及作用途径的研究提供依据。方法 280 只无特定病原体( Specific pathogen free,SPF) 7 日龄雏鸭随机分为 8 组,四组梯度剂量每天灌喂 Gln( 0、0. 5、1、2 g / kg 饲 料) 6d,及另四组灌喂同等梯度剂量 Gln 6 d,于 第 一 天 灌 喂 30 min 后 攻 0. 2 mL2000TCID50 鸭瘟病毒,观察 Gln 对正常雏鸭的免疫促进作用及攻毒鸭免疫应激的缓解作用。测定 Toll 样受体 4( Toll-like receptor 4,TLＲ4) 通路基因表达量。结果 Gln 显著提高正常组 TLＲ4 通路 mＲNA 表达量( P ＜ 0. 05) ,显著降低攻毒组表达量( P ＜ 0. 05) 。结论 Gln 通过 TLＲ4 通路提高正常雏鸭肠道的免疫力,降低鸭瘟病毒( Duck plague virus,DPV) 造成的肠道免疫损伤。     

雏鸭混合感染基因A型和基因C型鸭甲肝病毒研究

研究了2013年四川地区某鸭场暴发的基因A型鸭甲肝病毒(DHAV-A)和基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)的混合感染病例.疾病发生于20~25日龄雏鸭,发病率25%~30%,死亡率为20%~30%,临死前出现明显的神经症状,病死雏鸭肝脏肿大,出血.利用双重RT-PCR从病死雏鸭的肝脏组织中同时检测出DHAV-A和DHAV-C.这是四川省养鸭密集区第一次发现雏鸭混合感染DHAV-A和DHAV-C的情况.此外,对2009~2012年四川省各养鸭密集区鸭甲肝炎流行情况做了调查.一共从四川省养鸭密集区采集312份疑似鸭肝炎样本中检测出120份鸭甲型肝病毒性肝炎.其中基因C型鸭肝炎阳性率为75%,基因A型鸭肝炎仅为25%,未发现基因A型和基因C型混合感染情况.结果说明2009~2012年我省鸭病毒性肝炎以基因C型鸭甲肝病毒为优势病原.2013年,开始出现DHAV-A和DHAV-C混合感染病例.因此如何采取有效措施应对其危害,这应该引起养鸭界及相关部门的高度重视.     

ＲAG2 /IL2ＲG 双基因缺陷小鼠杂交群体的建立

摘要: 目的建立ＲAG2 /IL2ＲG 双基因缺陷的CＲG 小鼠杂交群体。方法将ＲAG2 基因缺陷小鼠与IL2ＲG 基因缺陷小鼠分别进行繁殖,选取ＲAG2 基因缺陷雄鼠ＲAG2( － / － ) 与IL2ＲG 基因缺陷雌鼠IL2ＲG( － / － ) 进行配对,培育杂交后代,通过PCＲ 扩增基因组ＲAG2 和IL2ＲG 基因进行鉴定; 应用流式细胞仪分析检测ＲAG2 /IL2ＲG 双基因缺陷小鼠外周血T 细胞( CD3 + ) 、B 细胞( CD19 + ) 和NK 细胞( CD49b + ) 含量; 并测定8—12 周龄ＲAG2 /IL2ＲG 双基因缺陷小鼠血液生理生化及主要脏器重量指标。结果成功繁育ＲAG2 基因缺陷小鼠和IL2ＲG 基因缺陷小鼠,筛选获得稳定的ＲAG2 /IL2ＲG 双基因缺陷小鼠并成功保种和扩群; 该双基因缺陷小鼠外周血淋巴细胞中T 细胞、B 细胞,NK 细胞比例显著降低( P ＜ 0. 05) ; 与相同周龄野生型C57BL/6 相比9 项血清生化指标无明显变化( P ＞ 0. 05) ; 18 项血液生理指标中红细胞( ＲBC) 和血红蛋白( HGB) 含量显著降低( P ＜ 0. 05) ; 白细胞( WBC) 、淋巴细胞数( LYMPH) 、淋巴细胞比率( LYM) 、单核细胞、中性细胞数( NEUT) 降低极显著( P ＜ 0. 01) ; 脾脏重量显著均低于野生型C57BL/6 小鼠( P ＜ 0. 05) ; 人肝肿瘤传代细胞移植于ＲAG2 /IL2ＲG 双基因缺陷小鼠后,肿瘤移植成功率和生长速率均明显高于亲本单基因缺陷小鼠( P ＜ 0. 05) ,成功获得了临床肝癌病人肿瘤组织的异种移植模型。结论 成功构建筛选出ＲAG2 /IL2ＲG 双基因缺陷小鼠杂交群体。     

不同福利条件下ICＲ 小鼠肝细胞NF-κB 表达的比较

摘要: 目的比较不同福利水平下ICＲ 小鼠肝脏NF-κB 的表达。方法选取6 周龄雄性ICＲ 小鼠,交叉使用制动和丰富环境干预形成不同的福利环境,观测小鼠的体质量增重、饲料能效及脾脏系数,ELISA 法测定血清IL-2 和COＲT,实时定量PCＲ 和免疫印迹法分别检测小鼠肝细胞内NF-κB p65 的mＲNA 和蛋白表达水平。结果与对照组相比,丰富环境组小鼠的体质量增重显著提高( P ＜ 0. 05) ,其他指标无差异( P ＞ 0. 05) ; 丰富环境+ 制动组小鼠的体质量增重、脾脏系数显著低于对照组( P ＜ 0. 05) ,而COＲT、NF-κB p65 的基因和蛋白表达显著高于对照组( P ＜0. 05) ; 制动组的体质量增重、饲料能效、脾脏系数及血清IL-2 均显著低于对照组( P ＜ 0. 05) ,COＲT、NF-κB p65 的基因和蛋白表达均显著高于对照组( P ＜ 0. 05) 。其中制动组的体质量增重显著低于丰富环境+ 制动组( P ＜0. 05) ,COＲT、NF-κB p65 的基因和蛋白表达显著高于丰富环境+ 制动组( P ＜ 0. 05) 。结论不同组别小鼠存在福利水平差异,NF-κB 表达差异与福利差异相类似,福利水平与NF-κB 表达水平之间存在紧密关联。     

两株小鼠诺如病毒的分离与鉴定

摘要: 目的了解江苏地区常用实验小鼠诺如病毒( murine norovirus,MNV) 的感染情况及进化特征。方法在江苏地区抽取三个实验动物中心的实验小鼠,采集直肠及内容物样本,应用ＲT-PCＲ 方法检测MNV OＲF2 特异性基因( 547bp,MNV nt5104-5650) 。阳性样本经ＲAW264. 7 细胞分离病毒,对MNV 分离株的VP1 基因进行扩增,将其连接在pEASY-Blunt 载体上,转化至大肠杆菌Trans1-T1 感受态细胞,通过Kanamycin 抗性筛选,挑取菌落进行PCＲ鉴定,鉴定为阳性的克隆送检测定其VP1 基因序列,构建系统发生进化树。结果共检测小鼠直肠内容物30 份,检出MNV 阳性样本4 份,包括ICＲ 小鼠( 2 /8) 、BALB/c 小鼠( 1 /12) 和C57BL/6J 小鼠( 1 /10) ,感染率为13. 3%;ＲAW264. 7 细胞接毒盲传三代,两只ICＲ 小鼠样品接种的细胞产生明显细胞病变( CPE) ,表现为细胞圆缩聚集,大部分脱落死亡,而C57BL/6J 和BALB/c 小鼠样本接种ＲAW264. 7 细胞无CPE; 应用VP1 特异引物经ＲT-PCＲ 检测,表现CPE 的细胞样本出现特异条带,测序结果显示分离到的2 株MNVVP1 核酸序列均为1626bp,与引物设计参考毒株S7-P2( GenBank 登录号: AB435514) VP1 基因大小相同,进化树图表显示检测到的2 株MNV 属同一独立小分支与参考株BJ10-2062、CＲ4 最为相近。结论此次抽检的实验小鼠MNV 感染率为13. 3% ( 4 /30) ,考虑可能在同一设施内传播。常用实验小鼠携带病毒的生物学意义有待进一步研究。     

鼠痘病毒TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCＲ 快速检测方法的建立与应用研究

摘要: 目的建立快速、敏感、特异检测鼠痘病毒的TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCＲ 方法。方法针对鼠痘病毒血凝素HA 基因设计特异性引物和探针,构建含有HA 基因的标准质粒进行定量分析,建立TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCＲ 检测方法,评价其敏感性、特异性和稳定性。对临床标本中的鼠痘病毒进行检测。结果研究结果显示,建立的鼠痘病毒TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCＲ 检测方法特异性为100%,与其他正痘病毒属病毒、非正痘病毒属病毒、细菌、真菌、寄生虫和细胞均无交叉反应。该技术灵敏度高,能精确定量检测鼠痘病毒DAN 线性范围达10 个数量级( 100—109 拷贝) ,最低检测限度为4 拷贝。该方法重复性非常好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%。测试中相关系数、斜率和效率测量线性没有显著变化,表明该方法准确度高、精密度好。将其成功应用于临床标本中鼠痘病毒载量的定量检测,用普通PCＲ 和测序进行确证。整个检测过程可在2 h 内完成,可以用作快速诊断方法。结论本研究新建立的鼠痘病毒TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCＲ 方法,具有快速简便、特异性强、灵敏度高的特性,适用于动物源性产品中鼠痘病毒检测、食品和药品安全检查、环境监测、流行病毒调查,为临床标本中鼠痘病毒的快速定量检测提供了一种特异有效的评价工具,值得推广应用。     

小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCＲ 方法的建立

摘要: 目的为实验动物微生物检测提供一种简便、灵敏、快速,并且特异性强的小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌多重PCＲ 检测方法。方法根据小肠结肠炎耶尔森氏菌fox 基因、假结核耶尔森氏菌inv 基因、志贺氏菌ipaH 基因及空肠弯曲菌gyrA 基因设计并筛选出特异性引物; 优化退火温度等条件,分析多重PCＲ 的特异性、敏感性,使用该多重PCＲ 方法检测小鼠和豚鼠样品。结果多重PCＲ 扩增出了预计的PCＲ产物,即小肠结肠炎耶尔森氏菌( 511 bp) 、假结核耶尔森氏菌( 779 bp) 、志贺氏菌( 290 bp) 和空肠弯曲菌( 156 bp) 。该方法的灵敏度为1 × 10 － 3 ng /μL( 小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、志贺氏菌) 和1 × 10 － 2 ng /μL( 空肠弯曲菌) 。特异性检测未从其他菌中检测出阳性条带。使用该方法从样品中检测出不等的阳性样品数。结论该多重PCＲ 方法对实验动物微生物检测具有很好的应用和开发前景。     

病理学监测在实验动物质量评价中的地位

摘要: 目的从病理学角度评价啮齿类实验动物的健康情况,为实验动物质量评价提供依据。方法采集不同等级啮齿类实验动物的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠和小肠,经10% 中性福尔马林固定液固定,通过石蜡切片、HE 染色、PAS 染色、冰冻切片、油红O 染色后于显微镜下观察。结果虽然被检测动物的微生物学、寄生虫学和遗传学等指标都能达到或符合国家质量标准,但是病理学监测中都能观察到不同程度的组织病理学损伤,主要出现在肝脏、肺脏和肾脏,有时也发生在心脏、消化道和淋巴器官等。结论该结果说明,虽然啮齿类实验动物符合国家微生物学等标准,但仍有部分实验动物处于亚健康状态。病理学监测在实验动物质量评价中有着不可替代的重要作用。相关监管部门应该尽快制定实验动物病理学诊断的国家及地方标准,完善实验动物质量监测体系。     

H1N1 流感病毒感染小鼠在免疫学研究中的初步应用

摘要: 目的研究H1N1 流感病毒感染能力及机体免疫应答反应。方法利用0. 1LD50剂量A/PＲ/8 /34 ( H1N1) 病毒感染C57BL/6 小鼠,利用ELISA 和流式细胞术等方法检测IL-5、IL-6 水平和CD4 + 效应性T 淋巴细胞比例。结果3dpi 小鼠肺脏病毒复制达到高峰,为107EID50 /g,7dpi 肺脏组织病理学观察呈间质性肺炎、炎性细胞浸润; 5dpi 时IL-6 水平达到峰值,为122pg /mL; 7dpi 时IL-5 达到峰值,为680pg /mL; 与未感染组相比,感染组CD4 + CD44 +CD62L － 效应T 细胞比例显著升高。结论结果表明PＲ8 流感病毒感染小鼠,肺脏病毒复制水平高,机体免疫应答强,适合用于进一步的免疫学研究。     

HBK - SPF 鸭 MHC I 区域微卫星标记分析

摘要: 禽主要组织相容性复合体是一组紧密连锁高度多态的基因群,与免疫反应或敏感性密切相关,鸭 MHC I 区域全长 36. 8 kb,由 TAP1、TAP2 和 5 个 MHC I 拷贝基因( UAA-UEA) 组成。HBK-SPF 鸭是中国农业科学院哈尔滨兽医研究所培育的无特定病原体种鸭,分为 B 和 Q 2 个品系,已封闭繁育了 7 个世代。本文在鸭 MHC I 区域筛选了 4个微卫星位点,通过单链构象多态性分析和聚合酶链式反应直接测序,发现 A 位点具有多态性,为( GT) n 的重复结构,第 6 代 HBK-B 和 HBK-Q 的31 个个体和第 7 代 的140 个个体进行聚合酶链式反应,结果直接测序,在重复结构之前的 108bp 中,发现了 4 种纯合单倍型和 6 种杂合单倍型; B 位点未得到目的产物; C 位点位于 MHC I 拷贝基因UDA 和 UEA 之间,扩增结果与 UAA 和 UBA 之间序列高度同源,无法判断基因型; D 位点表现为单态,为( ATA) 15的固定重复结构。本研究为进一步研究鸭 MHC I 基因结构和建立家系提供了依据。