表皮生长因子受体Ⅲ型变异体(EGFRvⅢ) 多克隆抗体的制备及特异性

为了制备针对EGFRvⅢ的特异性多克隆抗体,在实验中利用耦联了血蓝蛋白的EGFRvⅢ特异性的PEP3合成短肽进行动物免疫,制备抗血清;构建了pET30a/E33XI原核表达载体,表达和纯化了融合蛋白His-E33(EGFRvⅢ的部分胞外区);以此融合蛋白作为抗原制备了抗体纯化柱,通过柱上纯化的方法从抗血清中提取针对EGFRvⅢ的特异性抗体.利用U87、U251、HeLa和HEK-293细胞进行免疫组化实验来检验抗体的特异性.     

噬菌体筛选技术筛选与联萘酚(BINOL)相结合的抗体

利用噬菌体展示技术筛选只结合1种对应体的BINOL抗体,建立人类单链抗体(scFv)噬菌体文库--Griffin.1文库,以固相化抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体.从经过4轮富集的次级抗体库中挑选到噬菌体克隆,用该克隆制备的单链抗体阳性克隆,经ELISA证实具有良好的抗原特异性.从人类scFv噬菌体文库中获得抗BINOL的特异性抗体.     

GGPPS多克隆抗体的制备与鉴定

构建人香叶基香叶基二磷酸合成酶基因(GGPPS)原核表达载体,制备兔抗人GGPPS多克隆抗体.利用DNA重组技术构建原核表达载体pGEX-4T-GGPPS,诱导表达GGPPS融合蛋白,分离纯化该融合蛋白后,作为免疫原免疫家兔制备多克隆抗体.成功构建了pGEX-4T-1-GGPPS原核表达载体,转化Rosetta菌株后可高效表达GGPPS融合蛋白,成功制备GGPPS多克隆抗体,间接ELISA法测定抗体效价为1∶32000,并且抗体具有良好特异性.成功克隆GGPPS基因并制备了特异性的兔抗人GGPPS多克隆抗体,为进一步研究GGPPS的功能奠定了基础.     

BIG-3的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

原核表达、纯化骨形态发生蛋白诱导基因（BIG-3,BMP-2-induced gene 3kb）所编码的融合蛋白并制备其多克隆抗体。将BIG-3基因插入原核表达载体PGEX-4T-2的多克隆位点获得pGEX-4T-2-BIG-3重组表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达情况及Sepharose4B层析柱亲和层析法纯化的融合蛋白;用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备其多克隆抗体,并以Western blot鉴定其特异性。结果在大肠杆菌中获得BIG-3-GST融合蛋白高水平的诱导表达,经Sepharose4B层析柱亲和层析,GST-BIG-3融合蛋白在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,所制备的多克隆抗体具有较高的特异性。说明在大肠杆菌中成功表达且以亲和层析法纯化得到了BIG-3-GST融合蛋白,并制备了特异性较高的多克隆抗体。     

展示p53蛋白表位噬菌体phage-SD的制备及应用

[目的]利用噬菌体展示技术制备一种可用于检测血清p53抗体的噬菌体.[方法]利用基因工程手段将编码p53蛋白N端20～31位的多肽SD的基因克隆到丝状噬菌体载体fADL-le的pIII蛋白基因中，制备展示该外源肽的噬菌体phage-SD并进行了Western blot鉴定.在此基础上，分别以phage-SD和重组p53蛋白为检测抗原，利用ELISA方法对乳腺癌患者血清p53抗体进行检测.[结果]成功制备出能特异性识别血清p53抗体的噬菌体phage-SD.ELISA检测结果表明，60例乳腺癌患者中phage-SD检测到13例p53抗体阳性患者，检出率为21.67%,与重组p53蛋白检测效率(21.67%)一致.[结论]成功制备一种灵敏度高、特异性强的可用于血清p53抗体检测的噬菌体phage-SD,为新型血清p53抗体检测试剂的开发及临床应用奠定基础.     

Rab39A多克隆抗体的制备与鉴定

制备抗人Rab39A多克隆抗体并进行纯化检测,以用于Rab39A功能的研究.选取免疫原性强且特异性高的羧基端42个氨基酸(176～217aa)作为目的片段.PCR法扩增并构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rab39C42.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化GST-Rab39C42融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体.然后以亲和层析法纯化抗体,利用Western blot和免疫荧光检测抗体的特异性.结果表明,构建的原核表达载体经IPTG诱导后高效表达GST-Rab39C42蛋白,纯化后抗体质量浓度为1μg/μL;Western blot实验显示,抗体可以识别外源Rab39A蛋白和多个细胞系的内源Rab39A蛋白;抗体中和实验和RNA干扰实验证明了该抗体具有特异性.本研究成功构建了pGEX-4T-1-Rab39C42原核表达载体,并制备了特异性的抗人Rab39A兔多克隆抗体,为进一步研究Rab39A的功能提供了有力的支持.     

基于AhsA蛋白的嗜水气单胞菌特异性抗体的制备与鉴定

选取嗜水气单胞菌表面特异性抗原蛋白AhsA,构建了pET-28a(+)-AhsA表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行表达,利用Ni-NTA亲和层析、凝胶过滤层析等蛋白纯化方法进行纯化。重组蛋白表达效果较好,浓度可达10 mg·mL^-1,纯度可达90%以上,符合制备多克隆抗体的免疫原标准。利用Western Blot技术将AhsA抗体特定识别免疫原蛋白,结果表明该抗体能够特异性识别免疫原蛋白AhsA,而对于牛血清蛋白却不能发生免疫应答,表明该抗体具有一定的特异性且AhsA蛋白具有很好的免疫原性。同时通过检测验证了AhsA蛋白抗体能够特异性检测嗜水气单胞菌,将为水产品质量控制及临床检测嗜水气单胞菌可提供新的技术。     

抗多巴胺-BSA抗体的制备及质量鉴定

本文以Mannich反应改良法连接多巴胺与载体BSA,以此结合物免疫家兔制备多巴胺抗体,此抗体特异性强,效价可达1:64,用于免疫学检测很可行。     

长型肌球蛋白轻链激酶4Ig结构域的表达及单克隆抗体的制备

长型肌球蛋白轻链激酶(long myosin light chain kinase,L-MLCK)及其分子内结构域的功能还不清楚.在研究其功能时,特异性抗体是一基本工具,但目前国际上还没有制备成功特异性较好的抗体.为此,我们先在大肠杆菌E.coliBL21中重组表达了鸡L-MLCK的4Ig蛋白片段(MLCK4Ig),蛋白经纯化后作为抗原免疫小鼠.在小鼠血清中检测到特异性抗体的基础上,建立了2株杂交瘤细胞株,获得抗鸡MLCK4Ig的单克隆抗体.该抗体可以特异与鸡L-MLCK和鸡MLCK4Ig反应.本文并对该抗体的特性及应用进行了讨论.结果表明,我们部分解决了L-MLCK的抗体缺乏问题,为研究L-MLCK及MLCK4Ig片段的功能提供了重要工具.     

核糖体蛋白RPL15多克隆抗体的制备与细胞内定位

为了解核糖体大亚基蛋白RPL15在细胞中的定位和功能,设计并合成了RPL15蛋白的多肽,作用于抗原免疫兔子,使其产生特异性多克隆抗体,利用蛋白免疫印迹和免疫荧光方法检测RPL15抗体的特异性.结果证实本研究成功制备并纯化了RPL15的多克隆抗体,且该抗体可以特异性识别RPL15蛋白.免疫荧光实验表明RPL15定位于细胞质和细胞核中,主要定位于核仁并呈点状分布,且与UBF、FBL和C23存在部分共定位.