南日鲍β-葡萄糖苷酶分离纯化及表征

采用硫酸铵分段盐析、透析、DEAE-纤维素离子交换层析和葡聚糖Sephadex G-100凝胶层析,从南日鲍内脏中分离纯化得到一种β-葡萄糖苷酶.SDS-PAGE分析表明,所纯化的β-葡萄糖苷酶为单聚体,分子量约为90 kDa,N-端8个氨基酸残基序列为AGMLYPRV.β-葡萄糖苷酶的最适温度为50℃,最适pH值为5.0,Mn2+、Cu2+、Ba2+和Zn2+对酶活力有显著的促进作用,而Al3+对酶有明显的抑制作用,SDS则使酶变性失活;pNPG与β-葡萄糖苷酶之间的亲和程度最高,纤维二糖和京尼平苷次之,水杨苷最差.     

麻疯树过氧化氢酶的分离纯化

麻疯树种仁经抽提、硫酸铵盐析、Phenyl Sepharose CL-4B层析、DEAE-Sepharose F.F.层析,获得了纯化的麻疯树过氧化氢酶(CAT).该酶比活力为69.23 U/mg,纯化倍数为37.63倍.经Sephacryl S-300 HR测定,该酶表观分子量为232 kD,SDS-PAGE显示为一条分子量为59 kD的条带,表明该酶是由四个相同的分子量为59 kD的亚基组成.经等电聚焦测定该酶的等电点为4.7.经过温度和pH考察,该酶最适温度为30℃,最适pH为7.0.Mn~(2+)对酶活有促进作用,Zn~(2+)、Cd~(2+)、Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)、Co~(2+)有抑制作用.6×10~(-3)mmol/L NaN_3以及0.9 mmol/L KCN能使酶活丧失.该酶的V_(max)和K_m分别为5 U/mL·min,1.5 mmol/L.     

红酵母苯丙氨酸解氨酶的分离纯化及性质研究

采用玻珠破壁 ,硫酸铵分级沉淀 ,凝胶过滤和离子交换等方法 ,从L 苯丙氨酸工业生产菌株红酵母中分离纯化苯丙氨酸解氨酶 (PAL) ,纯化倍数为 1 39,收率为 1 2 6%,纯化到的酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳均为单一蛋白带 ,其亚基分子量约为79.4kD该酶最适反应温度为 40℃ ,最适反应pH为 8.5 ,以L Phe为底物 ,40℃ ,pH 8.5的Km值为 3 87× 1 0 - 4 mol/L 除了Mg2 +和Na+,其它金属离子如Fe3+,Cu2 +,Co2 +,Hg2 +等对其都有明显的抑制作用 .     

瑞氏木霉β-内切葡聚糖酶的纯化及其部分酶学性质研究

 利用盐析、SephadexG-75和DEAE-SephadexA50层析,从瑞氏木霉TrichodermareeseiQM9414发酵液中纯化了2个具有β-内切葡聚糖酶活性的组分Eg1和Eg2,分子质量分别为65.47ku和57.04ku.其最适温度分别为50℃和55℃,最适pH分别为4.8和5.0,米氏常数Km分别为3.76×10^-2g/L和4.20×10^-2g/L.根据其酶学性质,这是一类不同于已有的β-内切葡聚糖酶,为瑞氏木霉T.reeseiQM9414所产β-内切葡聚糖酶的进一步研究奠定了基础.     

固定化β-葡萄糖苷酶的酶学性质

以壳聚糖微球为载体构建了固定化β-葡萄糖苷酶,研究了固定化和游离β-葡萄糖苷酶的酶学性质.结果表明:固定化和游离β-葡萄糖苷酶的最适pH均为4.5;固定化β-葡萄糖苷酶的最适温度为60℃,比游离酶低5℃;固定化β-葡萄糖苷酶的pH稳定性和贮存稳定性明显高于游离酶,但热稳定性略低于游离酶;固定化和游离β-葡萄糖苷酶的表观米氏常数和米氏常数分别为0.52 mmol/L和2.4 mmol/L;固定化β-葡萄糖苷酶重复分批酶解10 g/L的纤维二糖,其操作半衰期为31 d左右.     

黑曲霉胞外β-葡萄糖苷酶的纯化及酶学性质的研究

利用硫酸铵盐析、Superdex 200凝胶柱层析等步骤,从黑曲霉发酵液中纯化得到两种β–葡萄糖苷酶蛋白,其相对分子质量分别为1.15×105和7.0×104左右,比活力分别为62.1,U/mg(相对分子质量约为1.15×105)和53.0,U/mg(相对分子质量约为7.0×104),纯化倍数分别为1.54和1.31,回收率分别为19.6%,和19.1%,β–葡萄糖苷酶最适水解p H为4.6,最适反应温度为50~55,℃.在p H 4.2~4.8、温度40~60,℃下均能保持稳定.Mn2+、Mg2+和K+对β–葡萄糖苷酶有不同程度的激活作用,而Ca2+、Fe3+、Zn2+、Cu2+和Fe2+会抑制β–葡萄糖苷酶的酶活,Na+和Ba2+对β–葡萄糖苷酶活力影响不明显.以p NPG为底物时,该酶的Km和vmax分别为2.33,mmol/L与3.14,mmol/(L·min).     

云芝漆酶理化性质及动力学研究

主要研究pH值、金属离子、温度对云芝漆酶活性和稳定性的影响,以及该酶底物浓度效应和Km值测定.实验结果表明:Cu2+、Co2+对漆酶有激活作用,而Ag+则有抑制作用;该酶最适pH为4.8,在pH4~4.8表现出较强的稳定性;最适反应温度为40℃,低于50℃时有较好的热稳定性;Km值为4.2×10-3mol/L.     

海洋来源褐藻胶裂解酶分离纯化及酶学性质研究

以假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.zb7-4)发酵制备褐藻胶裂解酶粗酶液,采用弱阴离子DEAE交换层析分离褐藻胶裂解酶,分析纯化褐藻胶裂解酶Alg L的酶学特性.结果表明:Alg L的表观分子质量约为32 ku,比活力为(208.26±5.87)U·mg-1;其最适反应pH为7.0,在pH为6.0~10.0范围内稳定性较好,保温1 h仍能保持80%以上的相对酶活力;最适反应温度50℃,在40℃保温30 min,其残余酶活力高于80%;Cu2+、Cr3+、Co2+、Ba2+、Sr2+、Hg2+对该酶具有不同程度的抑制作用,Hg2+抑制作用最为明显;该酶具有较好的盐耐受性,在3 mol·L-1Na Cl反应体系中保温2 h,仍残余66%酶活力.动力学参数Km、Vmax、Kcat测定表明,该酶对聚古罗糖醛酸钠(PG)亲和力较高,为偏好聚甘露糖醛酸钠(PM)裂解作用的双功能酶.     

椰果内生枯草芽孢杆菌YZ-21产β-甘露聚糖酶的纯化及酶学性质研究

[目的]分离纯化来源于内生枯草芽孢杆菌YZ-21的β-甘露聚糖酶,并研究其酶学性质.[方法]采用乙醇沉淀法、硫酸铵盐析法、聚乙二醇(PEG)/硫酸铵[(NH_4)_2SO_4]双水相体系进行分离与纯化,在此基础研究它的酶学性质.[结果]比较3种纯化方法,最优方法为双水相萃取法,在双水相体系为16%(NH_4)_2SO_4、18%PEG2000、2%NaCl条件下,纯化倍数最高可以达到3.06,酶回收率达到99.26%;酶学性质研究表明,β-甘露聚糖酶的最适反应pH为7.0,最适的反应温度是40℃,pH稳定性在3.0～7.0,热稳定范围在35～55℃之间;Ca~(2+),Ba~(2+),Mg~(2+),K~+,Co~(2+)对酶都有激活作用,而Ca~(2+)激活作用最强,Cu~(2+),Na~+,Zn~(2+),Mn~(2+),EDTA对酶有抑制作用.[结论]利用双水相萃取法较好纯化了β-甘露聚糖酶,酶学性质良好,可以广泛应用于饲料添加剂、纸浆漂白和食品加工等领域.     

枯草芽孢杆菌WD-23 β-甘露聚糖酶的纯化及其酶学性质

利用硫酸铵盐析缓冲液透析、聚乙二醇浓缩、DEAE-Sepharose FF窝子交换层析等方法,纯化了枯草芽孢杆菌WD-23 β-甘露聚糖酶,并研究了其酶学性质。结果表明:纯化的枯草芽孢杆菌WD-23 β-甘露聚糖酶的分子质量约为40 ku,酶的纯化倍数为14.1倍; 最适反应pH和pH稳定范围分别为5.6和5.0～7.0; 最适反应温度和温度稳定范围分别为55 ℃和40～70 ℃; Ca²⁺对该酶的促进作用最为明显,Li⁺的抑制作用最明显。     

地衣芽胞杆菌产纤溶酶的分离、纯化及其酶学性质研究

以地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WBL-3进行固体发酵生产纤溶酶.通过生理盐水浸提、离心去除菌体、硫酸铵分级盐析、透析、离子交换层析和凝胶过滤层析对酶进行分离纯化,SDS-PAGE电泳检测酶的分子量大小,并对该纤溶酶的酶学性质进行研究.结果表明:经凝胶过滤层析后,纯化倍数为33.19,回收率12.39％;SDS-PAGE电泳检测为单一蛋白条带;酶学性质分析表明:酶的最适反应温度为55℃,稳定性随着温度的升高而降低;最适反应pH为8.5,pH7-10范围内酶活稳定性较高;Mg2+对该酶有微弱的激活作用,Cu2+、Ag+、Fe3+、Hg2+、Pb2+对酶有较强的抑制作用.本研究为开发新的溶栓药物提供了新的选择.     

水稻土壤宏基因组中的β-葡萄糖苷酶基因克隆、表达及酶活的研究

β-葡萄糖苷酶(Ec3.2.1.21)属于糖苷水解酶家族3,它能够水解非还原性末端的β-D葡萄糖苷键,释放出游离的葡萄糖及相应的配基。β-葡萄糖苷酶是纤维素降解中的关键酶,对于可再生资源纤维素的利用具有十分重要的意义。本研究从水稻土壤中分离得到β-葡萄糖苷酶基因pds5,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,转化BL21大肠杆菌中,并诱导表达该基因。重组BL21大肠杆菌用IPTG诱导后,所提取的酶蛋白具有β-葡萄糖苷酶的活性,经SDS-PAGE分析,确定其相对分子质量为83 kD。通过控制pH和温度的方法,测得该酶酶活最适pH为7.0,最适温度为37.5℃。     

产朊假丝酵母细胞壁33kD蛋白的酶学特性研究

培养产朊假丝酵母菌收获菌体,经裂解酶处理细胞壁,离心后得到上清粒酶液,粗酶波经DEAE-纤维素层析、Sepharose4B凝胶过滤纯化。对33kD蛋白的酶学性质研究表明,反应最适pH为5．5,反应的最适温度为45℃。热稳定性较差,50℃温度下放置1h活力下降50％。主要水解β-1,3-倍苦键,具有较强的专一性,是一种典型的葡聚糖内切酶（对pNPG无作用）。     

灰绿曲霉产纤维素酶的研究

灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)发酵液通过硫酸铵盐析、Sephadex G-100分子筛、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱和Phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析,分离纯化一种外切葡聚糖酶(CBH)和一种内切葡聚糖酶(EG).通过SDS-PAGE和凝胶柱层析法测定分子质量表明:CBH全酶分子质量为71 ku,由两个分子质量为35 ku的同型亚基组成;EG为单体蛋白,全酶分子质量为32 ku.酶学性质研究表明:CBH催化pNPC的最适pH为6.0,最适温度为55 ℃,酶活在pH 5.0～8.0 区间和温度低于55 ℃时稳定;EG催化CMC-Na的最适pH为4.0,最适温度为50 ℃,酶活在pH 3.5～7.5区间和温度低于65 ℃时稳定.Na+、K+、Ba2+、Mg2+以及NO-3和SO2-4对CBH和EG酶活均无影响;Ca2+和Mn2+对CBH有激活作用,Fe2+和Mn2+对EG有激活作用,而Zn2+、Cd2+和Cu2+对CBH和EG均有不同程度的抑制效应.酶动力学分析表明:CBH催化pNPC水解的米氏常数Km值为1.4 mmol/L(pH 6.0,55 ℃),EG催化CMC-Na水解的米氏常数Km值为5.0 mg/mL(pH 4.0,50 ℃).     

常现青霉(Penicillium frequentans)β-半乳糖苷酶的纯化及其性质

从常现青霉麸曲中抽提的β-半乳糖苷酶(E.C.32。1.23,亦称乳糖酶)粗制品,经两次硫酸铵盐析沉淀和DEAE纤维素柱层析,纯度提高了近55倍,纯化酶的最适反应温度为62～65℃,最适反应pH为4.0。于pH2.2～8.0放置过夜,酶活性基本稳定。以邻硝基苯酚β-半乳糖苷(ONPG)为底物时该酶的K_m为2.06 mmol/L。Cu~(++),Fe~(++)和N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)对酶活性有明显的抑制作用,Mn~(++)为该酶的激活剂。     

酿酒酵母中D-(-)-扁桃酸脱氢酶性质研究

采用DEAE Sepharose离子交换层析、Butyl Sepharose疏水层析和Blue Sepharose亲和层析等分离方法,从高产D-(-)-扁桃酸的酵母菌株BY1.1b中纯化得到电泳纯的D-(-)-扁桃酸脱氢酶.采用Sephacryl S-200分子筛层析柱测得该酶的相对分子质量约60 kDa,用SDS-PAGE电泳测得该酶亚基分子量为32 kDa,表明该酶属于同型二聚体.该酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH为6.0.该酶在低于30℃,pH5.5~8.0较为稳定.以NADH和苯乙酮酸为底物,其Km值分别为Km(NADH)=99.2μmol/L和Km(苯乙酮酸)=263.3μmol/L.     

短乳杆菌来源重组β-半乳糖苷酶初步分离纯化与酶学特性研究

将实验室克隆得到的E. coli BL21/pET28a-bga B-18重组菌株在IPTG的诱导下进行表达,对其表达的β-半乳糖苷酶性质进行研究.首先,通过离心收取重组菌菌体;其次,通过超声破碎菌体细胞,再用镍柱对重组蛋白质进行亲和层析;最后,收集层析液,再利用紫外分光光度计测定重组β-半乳糖苷酶活性,并研究其酶学性质.结果表明:该酶的最适反应温度为37℃,最适pH值为7.5;在温度30～50℃、pH 6.0～8.0范围内酶稳定性较好; Mg~(2+)、Mn~(2+)为其激活剂,Cu~(2+)为其抑制剂;测得K_m=0.816 mmol/L,V_(max)=45.87 mmol/(L·min).     

大肠杆菌谷氨酸脱羧酶的纯化及其性质的研究

大肠杆菌菌体经机械研磨,硫酸铵分级,sephadex G-100层析,再用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳进行纯化,得到电泳均一的 L-谷氨酸脱羧酶纯品.酶作用的最适pH 为4.4,在 pH3.6～5.8稳定;最适温度50℃,50℃以下稳定;于60℃保温30min,酶活力保留65%.此酶作用于 L-谷氨酸的 K_m 值为1.39×10~(-2)mol/L,金属离子 Zn~(2+),Cu~(2+),Mg~(2+),Fe~(2+)分别不同程度的抑制此酶,EDTA 无抑制作用.该酶在280nm 处有最大光吸收,与蛋白质在280nm 处有最大光吸收值的普遍性质相一致.     

蝾螺β-葡萄糖苷酶性质的初步研究

以海洋蝾螺(TurboPetholatusLinnaeus)内脏为原料,经匀浆、缓冲液抽提、硫酸铵沉淀初步抽提,再经DEAE cellulose(DE 32)、SephadexG 200等柱层析纯化,获得较纯的β 葡萄糖苷酶.本文对β 葡萄糖苷酶的基本性质进行初步研究,结果表明:β 葡萄糖苷酶催化底物pNP G水解的最适pH及最适温度分别为pH5.5和45℃.β 葡萄糖苷酶在pH为4.5～6.5之间稳定.温度30℃以上则逐渐失活.其反应Km为0.076mmol/L(37℃).活化能Ea为15.4kJ/mol.金属离子对酶的作用表明,Cu2 ,Hg2 ,Pb2 有强烈的抑制作用,Fe3 ,Cd2 ,Zn2 浓度小于1.0mmol/L时,抑制较弱,但在浓度大于1.0mmol/L时,抑制明显;Mn2 ,Ca2 在低浓度下对酶活力无明显影响,但在高浓度条件下有较强抑制作用,Mg2 略有激活效应.     

β-琼脂糖酶(AgaA7)在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质研究

为研究重组β-琼脂糖酶(AgaA7)基因的表达产物及其酶学性质,根据GeneBank中β-琼脂糖酶(AgaA7)基因的编码序列合成此基因后,将其克隆到表达载体pET-22b( )中,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达.纯化后的表达产物经SDS-PAGE检测其相对分子质量并测定其酶学性质.结果表明:重组酶的相对分子质量为~5.0×104,与预期相符.此酶最适反应pH是7.0,在pH58的缓冲液中最稳定;最适反应温度为50℃,在低于50℃时比较稳定.Na ,K ,Ca2 ,Mg2 对重组酶活性影响不大,而Zn2 ,Hg2 ,Pb2 则对酶活性具有不可逆抑制作用.