病毒诱导的基因沉默

病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)是近年发现的一种转录后基因沉默的现象,是快速鉴定植物基因功能的一种反向遗传学新技术,近年来成为植物基因功能研究的有力工具.文章从病毒诱导基因沉默的发现、作用机制、优势、病毒抑制子及其在植物基因功能研究和植物抗病毒的应用等方面进行了综述.     

病毒诱导的基因沉默及其在植物功能基因组学研究中的应用

病毒诱导的基因沉默(VIGS)是植物体中天然存在的一种抵御外源核酸入侵的防御系统,正常情况下保护植物免受病毒的侵染.植物的这种防御机制可被病毒RNA激活,属于转录后基因沉默现象.如果在病毒载体中插入目标基因片段,侵染寄主植物后,植物会表现出目标基因功能丧失或表达水平下降的表型.利用这种机制,可以确定基因功能.目前,这种技术有望发展成为一种简单、快速、高通量的分析已知序列基因功能的方法.文中综述了VIGS技术的原理与发展,并讨论该技术在植物功能基因组学研究中的应用前景.     

辣椒病毒诱导基因沉默体系的构建

采用RT-PCR方法克隆辣椒八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因部分序列,并构建病毒诱导基因沉默(VIGS)载体pYL156-PDS,经农杆菌介导侵染辣椒叶片,采用表型观察、半定量RT-PCR方法评价构建的VIGS体系的沉默效果.结果表明,辣椒新生叶片呈现明显的光漂白现象,且叶片内源PDS基因表达量明显低于对照.研究证明,辣椒VIGS体系已被成功构建,为规模化验证辣椒基因功能提供了技术平台.     

RNA干涉研究进展

RNA干涉(RNAi)是生物体内的一种通过双链RNA(dsRNA)来抵抗病毒入侵和抑制转座 子活动的自然机制.快速发展的RNAi技术为抑制特异性基因的表达提供了有利的工具.到目前为 止,在真菌、拟南芥、线虫、锥虫、水螅、涡虫、果蝇、斑马鱼、小鼠等真核生物中都发现存在基因沉默 机制.RNAi作为基因沉默的工具,为基因功能研究、基因治疗、药物研究与开发等许多领域开辟了 一条新路.     

病毒编码的RNA沉默抑制子的特征及其生物技术应用

RNA沉默是一种依赖核酸序列特异性的RNA降解过程,是动物、植物抵抗病毒等外源核酸的一种保守防御机制。而针对寄主的这种防御机制,许多病毒演化出RNA沉默抑制子以克服这种防御反应。本文综述了几种动物、植物病毒抑制子的结构和作用方式,讨论了病毒抑制子之间的交叉抑制功能,病毒运动和沉默抑制子之间的关系,病毒RNA和亚病毒寄生物通过沉默抑制子而进行的自我保护原理,抑制子对于miRNA（microRNA）途径的影响以及病毒抑制子在生物技术方面的应用。     

几种实用的植物化学诱导系统

已建成的多种化学诱导系统在植物中有广泛的应用,如基因功能分析、无标记植物转化、特定位点DNA切除、育性恢复和RNA沉默等方面的研究.本文所介绍的三种诱导系统GVG、pOp6/LhGR和alc各有利弊,并在多种植物种类中得以应用,具有很大的发展前景和潜力.     

李毅教授课题组在植物病毒方面的研究取得重要进展

北京大学生命科学学院李毅教授领导的课题组在水稻矮缩病毒入侵昆虫宿主机制方面的研究取得可喜进展,其研究成果发表在2007年12月4日出版的《美国科学院院刊》（PNAS）上。这是继该实验室在发现了水稻矮缩病毒侵染植物寄主如何导致矮化的分子机制、病毒如何克服植物细胞壁的屏障进行细胞问运动、克服植物寄主抵抗病毒侵染的RNA沉默系统和病毒如何在体内组装的基础上的又一可喜进展。     

VIGS技术初步鉴定RgMLO6和RlMLO7基因对白粉病的负调控功能

为了探讨蔷薇科植物MLO基因在抗白粉病中的作用,研究应用病毒诱导的基因沉默技术(virus induced gene silencing,VIGS)抑制了大花香水月季RgMLO6基因和长尖叶蔷薇RlMLO7基因的表达,随后接种白粉菌对这2个基因进行抗性鉴定. 研究发现在VIGS载体转化植株叶片20 d后,RgMLO6和RlMLO7基因的相对表达量显著下降了80%～90%,沉默效果明显. 分别对2个基因沉默后的嫩叶进行白粉病抗性鉴定,大花香水月季和长尖叶蔷薇的抗性水平较对照组均提高. 显微镜观察白粉菌接种2个基因沉默后植株叶片中菌丝体的生长情况,整体表现出沉默植株叶表皮细胞上的白粉菌生长较对照组生长缓慢. 结果表明RgMLO6与RlMLO7基因对蔷薇科植物的白粉病有负向调控作用.     

植物中RNA沉默机制的研究进展

近年来,人们对植物中RNA沉默机制的的认识日渐清晰,小RNAs在其中发挥重要作用.文章综述了植物中RNA沉默的机制、RNA沉默的主要途径及其在防御外源DNA序列入侵过程中的主要功能.并简要介绍了由DNA病毒编码的基因沉默抑制子在对抗宿主沉默反应的作用.文章最后阐述了对RNA沉默进行深入研究的必要性,对需要研究的问题进行了分析,为抗病毒作物育种提供了有力依据.     

从反义RNA到人工miRNA的植物基因沉默技术革新

植物基因沉默技术作为一个重要的遗传操作工具在植物分子生物学研究和遗传改良方面得到广泛应用．自20世纪90年代基因沉默现象发现以来,多种植物基因沉默技术相继建立,包括共抑制、反义RNA、hpRNAi和VIGS等．最近,两种新的植物基因沉默技术：人工Micro—RNA和人工trans—acting siRNA建立起来,在基因沉默的精确性和高效性等方面有了新突破．由于植物体具有多条基因沉默途径,不同的基因沉默技术具有独特的应用优势．本文对这些基因沉默技术进行了系统的介绍和总结,梳理了不同技术的优缺点和适用范围,并展望了植物基因沉默技术进一步发展的方向和应用前景．     

1个Avr／Cf介导的差异表达基因在番茄抗叶霉病中作用的基因沉默分析

Avr／Cf介导产生过敏性反应时特异表达的cDNA—AFLP片段，称为ACE（Avr／Cf—elicited）片段，从中挑选1个未知功能的基因（记为ACE5）（GeneBank登录号为CK348288），利用VIGS技术对该片段相应基因进行基因沉默分析，分析该基因在植株生长和发育以及番茄抗叶霉病中的作用。结果表明该差异表达片段相应基因对本氏烟的生长发育以及Avr／Cf介导的HR反应均无影响。     

RNA干涉研究进展

RNA干涉(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)引起的序列特异性基因沉默,这是目前研究的热点,具有广阔的应用前景.对RNAi的分子机制、生物功能、研究策略及RNAi技术在基因功能、基因治疗、植物品质改良等方面的应用进行了综述.     

基因沉默抑制子HC-Pro表达载体的构建

RNA沉默广泛存在于植物等大多数真核生物中,能够防御外源基因的入侵和调控基因表达等.然而,基因沉默抑制子HC-Pro蛋白的具体功能的研究并不十分清楚.本文重点介绍了基因沉默抑制子HC-Pro的表达载体pBI121-HC-Pro的构建及HC-Pro基因在烟草(Nicotiana benthamiana)中的稳定表达.并利用半定量RT-PCR技术检测了目的基因HC-Pro的表达,检测结果表明我们获得了HC-Pro基因稳定表达的转基因烟草株系,为进一步深入研究基因沉默抑制子HC-Pro的功能奠定了实验基础.     

1个Avr/Cf介导的差异表达基因在番茄抗叶霉病中作用的基因沉默分析

Avr/Cf介导产生过敏性反应时特异表达的cDNA-AFLP片段,称为ACE(Avr/Cf-elicited)片段,从中挑选1个未知功能的基因(记为ACE5)(GeneBank登录号为CK348288),利用VIGS技术对该片段相应基因进行基因沉默分析,分析该基因在植株生长和发育以及番茄抗叶霉病中的作用。结果表明该差异表达片段相应基因对本氏烟的生长发育以及Avr/Cf介导的HR反应均无影响。     

小麦SBEⅡb基因的克隆及其与PDS基因串联VIGS载体的构建

为探讨以PDS基因为指示基因利用VIGS技术研究小麦SBEⅡb基因的功能,本研究拟构建小麦SBEⅡb和PDS的双基因串联VIGS重组载体。根据GeneBank中公布的小麦SBEⅡb(AY740401.1)和PDS(FJ517553.1)基因序列分别设计搭桥引物,利用RT-PCR技术克隆SBEⅡb和PDS基因的特异片段,利用SOE-PCR技术获得双基因融合片段SBEⅡb:PDS。然后以BSMV:γ-PDS为原载体,通过酶切连接,用SBEⅡb:PDS基因片段将原载体中的PDS基因片段进行替换,从而构建BSMV:γ-SBEⅡb:PDS重组载体。结果显示克隆的SBEⅡb和PDS基因片段长分别是181和190 bp,SBEⅡb:PDS片段长是370 bp。序列分析表明:SBEⅡb基因片段与小麦SBEⅡb(AY740401.1)序列同源性为97%;小麦PDS基因片段与PDS(AF155217.2)序列同源性也为97%;酶切鉴定结果表明成功构建BSMV:γ-SBEⅡb:PDS重组载体。本研究构建的BSMV:γ-SBEⅡb:PDS重组载体将在PDS基因的指示下为下一步利用VIGS技术在小麦上研究SBEⅡb基因与小麦淀粉合成的关系奠定了基础。     

山桐子IpSAD基因家族分析及功能鉴定

【目的】硬脂酰-ACP Δ⁹脱氢酶(stearoyl-ACP Δ⁹ desaturase,SAD)是决定脂肪酸组成的关键酶,分离和鉴定木本油料植物山桐子(Idesia polycarpa)的SAD基因,可为遗传改良山桐子油的脂肪酸组成提供基因资源。【方法】 使用 HMM 和 Blastp 鉴定山桐子全基因组中的SAD家族成员;利用MEGA X、MEME和PlantCare等在线软件对其蛋白质理化性质、系统发育关系、基因结构、保守基序和启动子顺式调控元件等进行分析;使用MCSCANX分析山桐子和毛果杨SAD基因之间的共线性关系;基于RNA-seq数据,分析IpSAD各成员的表达模式,通过病毒诱导的基因沉默技术(virus induced gene silencing,VIGS)快速验证它们的生物学功能。【结果】 ①在山桐子基因组中共鉴定到7个IpSAD基因(IpSAD1~7),多重序列比对结果显示各成员间序列相似度较高且结构域保守;②系统发育分析表明,IpSAD成员可以分为3个亚组,与拟南芥SAD家族的分类结果一致,拟南芥单不饱和油酸合成关键基因AtSSI2与山桐子IpSAD2、IpSAD3、IpSAD4的亲缘关系较近;③启动子区域顺势调控元件预测结果显示IpSAD基因的启动子含有光反应、脱落酸响应等顺式调控元件;④IpSAD基因按其组织表达模式可分为3类,第1类和第2类成员在大部分组织中表达量较低,而第3类成员在所有组织中表达量均较高。⑤沉默IpSAD基因使叶片的油酸含量显著降低,其中IpSAD3的沉默可使油酸含量下降76%。【结论】 明确了IpSAD家族各成员的基本特征,确定了它们对于油酸合成的生物学功能,并为山桐子油脂生物合成调控机制研究奠定了基础。     

Modification of a viral satellite DNA-based gene silencing vector and its application to leaf or flower color change in Petunia hybrida

Gene silencing conserved in plants and animals is mediated by mechanisms that involve sequence- specific RNA degradation[1,2]. Gene silencing has been proven to play an important role in the study of gene function. Recently, a procedure known as virus ind…