麻疹病毒绒猴细胞受体基因的克隆及功能鉴定

血凝素基因（ha)突变的麻疹病毒株失去了感染其敏感宿主Vero细胞的能力，但可以感染绒猴－B类淋巴母细胞系B95a，推测在B95a细胞上有这类麻疹病毒毒株的新的受体分子，为此，采用酵母双杂交系统，从B95a细胞cDNA文库中筛选，克隆了一个上述麻疹病毒血凝素蛋白（Ha蛋白）的相互作用蛋白基因－bip(b-lymphoblastoid interaction protein of marmoset)，该基因cDNA全长1540个碱基对，包含1101个碱基对的可读框，推测编码337个氨基酸组成的蛋白（Bip)，推导的氨基酸一级结构表明；Bip蛋白含有一个疏水跨膜区和一个疏水引导压，缺失突变体研究表明,Bip蛋白跨膜区缺失不影响Bip蛋白与Ha蛋白的相互作用，在麻疹病毒非允许细胞CHO（中国仓鼠卵巢细胞）中表达 bip基因，结果证明CHO／Bip 由非允许细胞变成了对上述麻疹病毒敏感的允许细胞，即表达有Bip蛋白的CHO细胞可以被麻疹病毒吸附，感染，证明bip是位于绒猴－B类淋巴母细胞中的麻疹病毒新的细胞受体基因。     

DNA改组在腺相关病毒定向进化中的发展及其应用

DNA改组(DNA shuffling)是一种高通量的突变、筛选技术, 自1994年提出以来, 经过了几十年的发展, 其在DNA、酶和药物蛋白等的改造上都有突出的表现. 腺相关病毒(adeno- associated virus, AAV)是一种细小病毒, 由于其无致病性和能有效呈递基因而成为一种非常理想的基因表达载体. 但是AAV筛除存在一些不足, 如对某些重要靶细胞感染效率不高、存在机体的免疫反应等限制了其临床研究的进展. 应用DNA 改组技术对AAV的衣壳蛋白进行定向进化, 有望解决这些问题. 本文重点综述DNA改组在AAV衣壳定向进化上的技术发展和应用, 并结合本课题组在AAV衣壳DNA改组上的研究工作展开讨论.     

乙型肝炎表面抗原cDNA在大肠杆菌中的表达

乙型肝炎病毒DNA是环状的,长度为3.2kbp。在克隆化并搞清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)及核心抗原(HBcAg)的编码顺序后,许多实验室分别进行了表达的实验。HBcAg在大肠杆菌中的表达一直较顺利,但HBsAg则相反,即使用很强的启动子也很难得到满意的表达。HBsAg的分子量为24000左右。但     

DNA改组在腺相关病毒定向进化中的发展及其应用

DNA改组(DNA shuffling)是一种高通量的突变、筛选技术,自1994年提出以来,经过了几十年的发展,其在DNA、酶和药物蛋白等的改造上都有突出的表现.腺相关病毒(adenoassociated virus,AAV)是一种细小病毒,由于其无致病性和能有效呈递基因而成为一种非常理想的基因表达载体.但是AAV筛除存在一些不足,如对某些重要靶细胞感染效率不高、存在机体的免疫反应等限制了其临床研究的进展.应用DNA改组技术对AAV的衣壳蛋白进行定向进化,有望解决这些问题.本文重点综述DNA改组在AAV衣壳定向进化上的技术发展和应用,并结合本课题组在AAV衣壳DNA改组上的研究工作展开讨论.     

乙型肝炎表面抗原基因在啤酒酵母中的表达

用基因工程的方法研制乙型肝炎疫苗已引起广泛注意。我们在HBsAg互补脱氧核糖核酸(cDNA)及乙型肝炎病毒DNA克隆成功的基础上使HBsAg在啤酒酵母中得到表达。实验用启动子是从一含酵母磷酸葡萄糖酸激酶(PGK)基因的质粒pSBP-1加工得来的,该质粒所含的PGK基因长度为3.0kbp左右,内外各有一个限制性内切酶EcoR I切点。为     

“克隆猴”的前世今生

正进化和生理上最接近于人类的灵长类动物——猕猴(Macaca mulatta)被复制出来了,你相信吗?科幻电影中克隆人的脚步似乎离我们越来越近了.2018年1月24日,国际顶级生物学期刊Cell以封面文章的形式报道了一项振奋人心的重大成果:中国科学院神经科学研究所孙强研究组[1]采用体细胞核移植技术(somatic cell nuclear transfer,SCNT)成功克隆出两只食蟹猴"中中"和"华华"."中中"、"华华"的诞生远非仅为克隆动物家族多添一位成员那么简     

一个竹类植物MADS盒基因的克隆及其在拟南芥中的表达

采用RACE方法, 从竹类植物麻竹(Dendrocalamus latiflorus)幼穗中克隆到一个含完整编码区及3′端非翻译区的cDNA, 命名为 DlMADS18. 该cDNA全长1039 bp; 编码区共编码249个氨基酸, 具有典型的植物MADS盒基因结构, 由MADS区、I区、K区和C末端组成. 序列相似性分析结果表明, DlMADS18属于AGL6亚家族, 其氨基酸序列与水稻(Oryza sativa L)的MADS盒基因OsMADS6同源性最高, 序列一致性为88%, 与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AGL6一致性为59%. 将DlMADS18置于CaMV 35S启动子控制下在拟南芥中异位表达, 转基因拟南芥表现出叶卷曲、植株矮小、开花时间提前、花聚生于花序顶端等性状, 表明DlMADS18很可能参与麻竹开花时间的调控.     

sTRAIL在大肠杆菌中的表达及其诱导细胞凋亡活性的研究

TRAIL(TNF relatedapoptosis inducingligand ,简称TRAIL或Apo 2L)是肿瘤坏死因子家族的新成员 ,体外研究表明其具有特异性杀伤肿瘤细胞的功能 .为了进一步探索TRAIL的生物学功能及其临床应用前景 ,首次从中国正常人外周血淋巴细胞中扩增了TRAIL胞外功能区(sTRAIL) ,并将其插入原核表达载体 ,转化大肠杆菌后 ,可溶型重组蛋白 (rsTRAIL)获得了高效稳定表达 ,其产量达到菌体总蛋白的 30 %左右 .体外研究表明 ,亲和层析纯化后的重组蛋白在 0 .1～ 1 μg/mL的浓度范围内 ,能显著诱导所试全部 7种肿瘤细胞株细胞凋亡 ,但不能诱导正常鼠成纤维细胞株细胞凋亡 ;进一步研究表明 ,rsTRAIL对贲门癌、乳腺癌和恶性胸腺瘤等原代细胞也具有强烈的杀伤作用 ,但不能杀伤正常人外周血淋巴细胞 .此实验结果为rsTRAIL特异性地诱导肿瘤细胞凋亡的生物学作用提供了新的实验证据 ,具有重要的临床应用价值 .     

孤儿受体TR2 mRNA在大鼠和恒河猴隐睾内生精细胞凋亡过程中的表达

采用原位杂交方法,研究了弧儿受体ＴＲ２ｍＲＮＡ在大鼠睾丸内的表达和细胞定位及其在大鼠和恒河猴隐睾中的表达变化;并利用原位３’末端标记法,了ＴＲ２基因在精子发生及生精细胞凋亡中的作用。结果表明,在大鼠睾丸中,ＴＲ２ｍＲＮＡ特异定位于生精细胞,主要在减数分裂期的精母细胞和减数分裂后的圆形和长型精子细胞表达。     

水稻条纹叶枯病毒基因组含vRNA_2 ORF片段的克隆、序列分析及其在原核中的表达

水稻条纹叶枯病毒(rice stripe virus,RSV)是柔丝病毒组的典型代表,其基因组由4种ss-RNA及相应低含量的4种dsRNA组成,其中,RNA1为负链性质,编码RNA多聚酶;RNA2～4均为双义编码性质(ambisense-coding strategy)。为研究该病毒RNA非编码区等调控元件在病毒基因组双义表达过程中的功能,采用反转录-聚合酶链式反应方法(RT-PCR),扩增出覆盖RSV RNA2 5′末端非编码区、vRNA2OrFT区、基因间非编码区及vcRNA2 ORF部分区域的REPI片段(1 159bp)。将此扩增产物克隆于载体pGEM-7Zf( )的Sma Ⅰ位点上并进行了核苷酸序列测定。结果表明,中国分离物与日本分离物的REPI片段具极高的序列同源性。将REPI片段克隆到原核高效表达载体pJW2的P_RP_L启动子下游,经温度诱导,获得了高效     

水稻条纹叶枯病毒基因组含vRNA2 ORF片段的克隆、序列分析及其在原核中的表达

<正>水稻条纹叶枯病毒(rice stripe virus,RSV)是柔丝病毒组的典型代表,其基因组由4种ss-RNA及相应低含量的4种dsRNA组成,其中,RNA1为负链性质,编码RNA多聚酶;RNA2～4均为双义编码性质(ambisense-coding strategy)。为研究该病毒RNA非编码区等调控元件在病毒基因组双义表达过程中的功能,采用反转录-聚合酶链式反应方法(RT-PCR),扩增出覆盖RSV RNA2 5′末端非编码区、vRNA2OrFT区、基因间非编码区及vcRNA2 ORF部分区域的REPI片段(1 159bp)。将此扩增产物克隆于载体pGEM-7Zf(+)的Sma Ⅰ位点上并进行了核苷酸序列测定。     

人类巨细胞病毒启动子控制的人Ⅸ因子cDNA在人体细胞中的高效表达

凝血因子Ⅸ(简称Ⅸ因子)是人体内凝系统的重要成分之一,它的缺乏或功能缺陷可导致血友病B.在血友病B基因治疗的研究中,如何提高Ⅸ因子蛋白的产量是关键问题之一。在以前的研究中,我们比较了SV40早期启动子、小鼠金属硫基因蛋白启动子和Moloney小鼠白血病病毒LTR启动子的作用。为进一步提高Ⅸ因子基因在培养细胞特别是人     

基质金属蛋白酶-2,-9及其组织抑制因子在恒河猴黄体中的表达

基质金属蛋白酶（MMPs)及其组织抑制因子（TIMPs)在黄体形成和退化过程中发挥着重作用。实验目的在于研究MMP家族成员中的明胶酶及TIMPs在恒河猴月经周期新生和退化黄体以及妊娠早期黄体中的表达。收集排卵后第5,15天及妊姑第12,18和26天的卵巢,原位杂交显示,MMP-2mRNA在黄体形成和退化时均有表达,而MMP-9mRNA主要出现在黄体晚期。妊娠时MMP-2,-9mRNA的水平显著降低。妊娠第26天黄体中已检测不到MMP-2mRNA的表达。TIMP-1mRNA在黄体早期和晚期都有较高水平的表达,并持续于早期妊娠的各阶段。TIMP-2mRNA在黄体早期和晚期均表达,随着妊娠时间的进展,其表达呈逐渐增强趋势。在恒河猴黄体中未能检测到TIMP-3mRNA的杂交信号。结果提示,MMP-2,-9和TIMP-1,-2可能在恒河猴黄体功能调控中具有重要作用。MMP-2,-9与TIMP-2可能通过其协同表达而共同参与妊娠早期黄体功能的维持。TIMP-1mRNA稳定的表达模式提示其可能在灵长类黄体中发挥着抑制MMPs以外的其他功能。     

高粱叶绿体psbD基因的克隆及其高效表达

近年来光合作用基因工程的研究进展十分迅速,许多重要的编码光合作用反应中心的蛋白质及酶的基因,已在多种植物叶绿体基因组及核基因组上定位并测定了其碱基序列,杉浦昌弘等先后完成了烟草、水稻等高等植物叶绿体基因组全序列分析,但是C_4植物除玉米外,叶绿体基因的研究较少,高粱是主要的C_4植物,其叶绿体光系统基因的研究国内外均     

鸡感染乙型肝炎病毒的研究

1964年Bluomberg发现乙型肝炎病毒。1970年国际肝炎会议予以公认。1972年我们分离到该病毒,继之进行了人胚肝器官培养增殖病毒的研究。从发现至今20多年过去了,寻找培养肝炎病毒的细胞株和动物模型,仍是世     

AA98靶分子在恒河猴胎盘发生过程中的表达及功能

用Western blot和免疫组织化学方法研究了一种新血管内皮因子—— AA98的靶分子在恒河猴早期胎盘发生过程中的表达. AA98靶分子主要在血管内皮细胞和部分胎盘细胞滋养层细胞(CTC)上表达, 在新生小血管内皮细胞上的表达高于成熟血管内皮细胞; AA98靶分子的表达与CTC的侵入活动具有相关性. 胎盘发育过程中, AA98靶分子在基板区CTC上的表达有明显降低趋势; 在CTC从细胞柱顶端迁移到胎盘基板区的过程中, AA98靶分子的表达逐渐增加, 在侵入以及基本完成螺旋动脉改造的CTC上有AA98强阳性染色. AA98靶分子在灵长类胎盘发生过程中的时空特异性表达说明, 它可能在血管发生、CTC迁移和扩展以及对螺旋动脉的改造过程中有重要作用.     

重组慢病毒介导的人凝血因子Ⅸ cDNA在培养细胞和血友病B小鼠中的表达

为探索慢病毒载体介导的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ) cDNA在培养细胞中的表达水平, 及重组慢病毒应用于血友病B基因治疗的可行性, 分别构建由肝特异性启动子ABP调控的hFⅨ的慢病毒载体FAXW, 以及由泛肽-C调控的hFⅨ慢病毒载体FUXW; 用磷酸钙法, 将慢病毒载体与包装质粒CMVΔR8.2和包膜质粒VSV-G共转染产毒细胞293 T, 以制备重组慢病毒. 重组FUXW病毒分别感染293 T, BHK和L-02细胞, 经检测皆有hFⅨ蛋白表达. 重组FAXW病毒感染细胞48 h后, 仅在L-02细胞检测到hFⅨ高表达(630 ng/10⁶细胞), 而在其他感染细胞中hFⅨ表达较低. 将重组FAXW病毒经尾静脉途径注射入血友病B小鼠体内, 小鼠血浆中可检测到接近治疗水平的hFⅨ抗原(45 ng/mL), 且持续时间超过60 d. 上述结果表明, 慢病毒载体介导的基因转移为血友病B基因治疗提供了极有潜力的方法.     

EB病毒诱导DNA酶的检定用于鼻咽癌早期发现的初步研究

通过检查病人血清以达到早期发现癌瘤的目的,是目前肿瘤防治研究中的重要方向之一。由于Epstein-Barr病毒(EBV)经常伴随于鼻咽癌(NPC)中,通过检测血清中抗EBV某些抗体,可以作为NPC早期诊断的重要参考,目前测定抗病毒壳抗原(Virus capsid antigen)的免疫球蛋白A抗体(VCA-IgA)已较广泛地用于NPC的早期发现,然而,酶学测定法用