东亚钳蝎神经毒素的研究进展

蝎毒中的神经毒素是一类具有特异生物活性的多肽物质。开展对蝎神经毒素的研究是近几年国内外较关注的课题之一。东亚马氏钳蝎（ＢｕｔｈｕｓｍａｒｔｅｎｓｉＫａｒｓｃｈ，ＢｍＫ）是中国分布最广的一种。本文综述了近几年来Ｂｍｋ神经毒素的一级结构研究的一些进展概况     

t-PA在昆虫细胞中的表达

将含完整阅读框架的人ｔ－ＰＡ（ｔｉｓｓｕｅ－ｙｔｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ,ｔ－ＰＡ）ｃＤＮＡ克隆至昆虫细胞表达转移载体ｐＢａｃＰＡＫ８中,获得重组质粒ｐＢａｃ－ｔＰＡ。应用脂质体共转染法,将ｐＢａｃ－ｔＰＡ和线性化杆状病毒ＢａｃＰＡＫ６ ＤＮＡ共转染Ｔｎ－５Ｂ－１昆虫细胞。经空斑筛选获得１１株重组病毒。经ＰＣＲ鉴定与生物活性测定,获得一株高效表达ｔ－ＰＡ的重且病毒ＢａｃｔＰ     

两个东亚钳蝎神经毒素cDNA的克隆和序列分析

构建了东亚钳蝎毒腺组织ｃＤＮＡ库，用ＰＣＲ筛选到两个新的神经毒素全长ｃＤＮＡ，其开放阅读框（ＯＲＦ）包括：信号肽、成熟毒素和／或额外氨基酸序列，它们编码的成熟毒分别命名为ＢｍａＴＸ９和ＢｍＩＴ（ｃｐ）２。序列分析表明，ＢｍａＴＸ９为抗哺乳动物神经毒素；ＢｍＩＴ（ｃｐ）２为痉挛型昆虫毒素。章还对东亚钳蝎神经毒素的命名，分类以及进化等问题进行了初步的探讨。     

人粒细胞集落刺激因子在昆虫细胞中的表达

利用苜蓿尺核型多角 体病带β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ基因标志的非融合蛋白基因转移载体ｐＢＢ成功地构了重组杆状病毒ＡｃＮＰＶ－Ｇ－ＣＳＦ．在感染重组病毒的草地夜蛾细胞中ｈＧ－ＣＳＦ得到了高效表达。表达产物由ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检出，其分子量约为１９ＫＤａ。     

重组人神经生长因子昆虫表达载体的构建及表达

目的:构建重组人神经生长因子(rh-NGF)杆状病毒表达载体,转染昆虫细胞从而获得目的蛋白的大量表达.方法:从人胎盘组织中提取细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增-NGF基因片段,经BamHI、HindⅢ双酶切后插入杆状病毒表达载体pFastBacTMDual的多克隆位点处,构建出重组载体pFastBacTM-Dual+[rh-NGF].对构建的载体进行PCR和酶切鉴定并测序.采用脂质体转染方法将表达载体转入昆虫细胞系Sf9中,通过双抗夹心ELISA对rh-NGF的表达进行检测.结果:构建的rh-NGF基因插入正确且序列与GenBank一致.ELISA检测结果显示病毒感染的Sf9细胞可表达rh-NGF.结论:成功构建出杆状病毒表达载体pFastBacTMDual+[rh-NGF],并在昆虫细胞系Sf9中得到表达,为大量制备重组人神经生长因子奠定了基础.     

抗昆虫蝎毒素多肽的重组表达研究

蝎毒素是蝎子自我防御和捕食的有力工具,属于活性短肽。抗昆虫蝎毒素多肽作用于昆虫细胞膜离子通道,调控通道动力学特性,是潜在的生物杀虫剂,具很高的研究价值。序列比对分析发现,抗昆虫蝎毒素多肽有高保守性,序列同源性达67%,其中有4个保守的半胱氨酸残基,这可能与其抗昆虫作用的结构有关。但天然蝎毒素蛋白获取较困难,致使抗昆虫毒素多肽的结构与功能研究受限,因此,利用基因重组技术获得高纯度高活性重组蝎毒素是有效途径之一。本文综述了抗昆虫蝎毒素多肽外源重组表达的研究现状,旨在更深入全面理解其结构及抗昆虫机理等,以助推后续相关研究。     

具全期启动子盒的杆状病毒高效表达载体的组建与应用

通过ＰＣＲ扩增，得到苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａＮｕｃｌｅａｒＰｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓＶｉｒｕｓ，ＡｃＮＰＶ）具早晚期启动子元件的ｐ３５基因启动子，将其插入到杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３多克隆位点上游，使之与ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３质粒中的人工合成后期启动子（ＰＳｙｎ）、多角体ＸＩＶ启动子（ＰＸＩＶ）串联构成早期、晚期、极晚期能持续启动外源基因表达的转移载体质粒ｐＳＸ３５．将ｐＳＸ３５用于组建含ＨＢｓＡｇ基因并形成多角体的重组ＴｎＮＰＶ，ＨＢ－ｓＡｇ基因的表达量显著提高，表达时间亦明显提前，从而实现了外源基因在杆状病毒表达系统的全期、高效表达．ｍＲＮＡ引物延伸试验结果显示，Ｐｐ３５在重组病毒中可产生２套转录本，分别于病毒感染的早期和晚期起始ＨＢｓＡｇ基因的表达．     

Biosynthesis of Polyhydroxyalkanoates Consisting of Short-chain-length Monomers and Medium-chain-length Monomers by Pseudomonas YS1

ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎＰｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ(ＰＨＡｓ)ａｒｅａｆａｍｉｌｙｏｆｂｉｏｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｂｙｍａｎｙｂａｃｔｅｒｉａ[1,2 ] .ＡｍｏｎｇＰＨＡｓ ,ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅｏｒＰＨＢｉｓｔｈｅｍｏｓｔｃｏｍｍｏｎｍｅｍｂｅｒ[3] .ＡｔｔｅｍｐｔｓｈａｖｅｂｅｅｎｍａｄｅｔｏｄｅｖｅｌｏｐｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｅｓｆｏｒｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＰＨＡｓ[4 7] .Ｂｉｏｐｏｌ,ａｃｏｍｍｅｒｃｉ…     

BR促进滇紫草培养细胞生长和色素形成的研究

Ｂｒａｓｓｉｎｏｌｉｄｅ (ＢＲ)ｃａｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｔｈｅｃｅｌｌｅｌｏｎｇａｔｉｏｎａｎｄｄｉｖｉｓｉｏｎａｔｎａｎｏｍｏｌａｒｌｅｖｅｌｓｗｈｅｎａｐｐｌｉｅｄｔｏａｐｌａｎｔ .Ｉｔｃａｎｐｒｏｍｏｔｅｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｏｆｅｐｉｃｏｔｙｌｄ ,ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓ ,ｍｅｓｏｃｏｔｙｌｓａｎｄｃｏｌｅｏｐ ｔｉｌｅｓ .Ｔｈｉｓｅｆｆｅｃｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｏｂｅａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄｂｙａｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｏｎｅｘｔｒｕｓｉｏｎｆｒｏｍｔｈｅｃｅｌｌ[1] ,ｗｈｉｃｈｉｓｓｉ…     

抗人脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体的制备

Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ (ＦＡＢＰｓ)ａｒｅｎｏｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｌｏｗｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ ( 1 4～ 1 5ｋＤ)ｗｈｉｃｈｃａｎｂｅｆｏｕｎｄｉｎａｗｉｄｅｖａｒｉｅｔｙｏｆｍａｍｍａｌｉａｎｔｉｓｓｕｅｓ[1] .Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ,ｔｈｅＦＡＢＰｆａｍｉｌｙｉｓｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆａｔｌｅａｓｔｎｉｎｅｄｉｓｔｉｎｃｔｔｙｐｅｓｏｆＦＡＢＰ ,ｅａｃｈｔｙｐｅｓｈｏｗｉｎｇａｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｐａｔｔｅｒｎｏｆｔｉ…     

重组阳离子抗菌肽体外抗菌生物活性的初步研究

天然抗菌肽是生物体自身产生的拮抗物质。本实验利用实验室构建的基因工程菌Chjch1诱导表达了阳离子抗菌肽。表达蛋白经Tricine-SDS PAGE凝胶电泳分析确定了重组蛋白单体分子质量的正确性。经凝胶成像系统分析确定表达量为29.67mg/L。摇瓶发酵菌体最大生物量达20.8g/L。活性实验表明，重组蛋白发酵上清液对微黄色八叠球菌和大肠杆菌具有毒杀力，30μL，96h的发酵上清液对微黄色八叠球菌抑菌直径2.6cm，对大肠杆菌抑菌直径为2.36cm。     

大黄欧文菌中蔗糖异构酶基因的克隆表达及应用

以大黄欧文菌(Erwinia rhapontici)NX-5基因组DNA为模板,PCR扩增得到编码蔗糖异构酶(SIase)的基因palⅠ,构建克隆载体pUC18-palⅠ。经测序正确后,将palⅠ亚克隆至表达载体pET-22b(+)上,并在E.coliBL21(DE3)中成功表达相对分子质量约为66 000的可溶性蛋白。通过Ni-NTA柱对表达产物进行纯化,纯酶的比活为40 U/mg。转化条件研究表明:重组菌能够高效转化质量分数为50%的蔗糖溶液,转化液中异麦芽酮糖得率为85%。     

人溶菌酶N端与Exendin-4嵌合蛋白的基因克隆及原核表达

目的:克隆嵌合多肽人溶菌酶N端-Exendin-4基因并进行原核表达和纯化.方法:通过重组PCR技术将人溶菌酶N端74个氨基酸的基因序列与Exendin-4多肽基因序列相连接,其间引入一段由凝血酶和二肽基肽酶识别位点组成的连接序列.以嵌合基因hLYZ(N74)-Ex4与质粒pET-32a(+)构建原核表达体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达.表达蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化、Western blotting鉴定;透析复性后,以肠激酶切割并回收目的多肽.结果:重组质粒pET-32a/hLYZ(N74)-Ex4构建正确,目的蛋白主要以包涵体形式存在,37℃诱导4h、IPTG浓度为0.6 mmol/L时表达量最高,约占菌体蛋白总量的30%.Western blotting检测显示重组蛋白为单一清晰条带.重组蛋白经肠激酶切割后,回收得到高纯度的嵌合多肽.结论:成功构建hLYZ(N74)-Ex4嵌合基因的原核表达质粒,高效原核表达并获得高纯度目的蛋白.     

内切菊粉酶基因在毕赤酵母中的高水平表达研究

低聚果糖(Fructooligosaccharides,FOS)具有改善胃肠道环境、刺激和加强机体免疫反应、抑制肠道特定肿瘤的发生等生物活性.内切菊粉酶能够水解菊粉获得低聚果糖.为了实现内切菊粉酶的高表达,从无花果曲霉(Aspergillus ficuum ATCC16882)中克隆了内切菊粉酶编码基因INU2,并实现了在毕赤氏酵母中的重组分泌表达,摇瓶表达的酶活力为570.4U/mL.去除内切菊粉酶的内源性信号肽序列后,其重组表达水平显著提高,摇瓶表达的酶活力为1013.8U/mL,提高幅度77.7%.TLC分析表明:毕赤酵母重组表达的内切菊粉酶(不含内源性信号肽序列)能将2%长链菊粉水解为2～3个聚合度的低聚果糖.     

绿色木霉EG III基因的克隆及其在工业酿酒酵母中的整合表达

 通过RT PCR从绿色木霉AS33711中克隆得到EG III基因,序列分析显示该基因编码序列全长为1 257 bp,编码418个aa,且自身带有21个aa的信号肽序列,与里氏木霉 eg3 的同源性为99.6%。将该基因连入酿酒酵母多拷贝整合型表达载体pScIKP中获得重组质粒,线性化后电转化酿酒酵母工业菌株AS2489,通过SDS PAGE蛋白电泳、刚果红染色和酶活测定对转化子进行了分析。结果表明：转化子有明显的重组EG III表达带,能够产生CMC水解圈,说明 eg3 基因已在酿酒酵母中获得了正确的分泌表达,表达EG III的重组菌产酶高峰出现时间为60 h,最高酶活接近120 U/mL,重组酶EG III的最适温度为60 ℃,最适pH为6.0,转化子的遗传稳定性达到99.17%,实现了绿色木霉 eg3 基因在工业酿酒酵母中的稳定高效表达。     

绿色木霉EG Ⅲ基因的克隆及其在工业酿酒酵母中的整合表达

通过RT-PCR从绿色木霉AS3.3711中克隆得到EG Ⅲ基因,序列分析显示该基因编码序列全长为1 257 bp,编码418个aa,且自身带有21个aa的信号肽序列,与里氏木霉eg3的同源性为99.6%.将该基因连入酿酒酵母多拷贝整合型表达载体pScIKP中获得重组质粒,线性化后电转化酿酒酵母工业菌株AS2.489,通过SDS-PAGE蛋白电泳、刚果红染色和酶活测定对转化子进行了分析.结果表明:转化子有明显的重组EG Ⅲ表达带,能够产生CMC水解圈,说明eg3基因已在酿酒酵母中获得了正确的分泌表达,表达EG Ⅲ的重组菌产酶高峰出现时间为60 h,最高酶活接近120 U/mL,重组酶EG Ⅲ的最适温度为60 ℃,最适pH为6.0,转化子的遗传稳定性达到99.17%,实现了绿色木霉eg3基因在工业酿酒酵母中的稳定高效表达.     

一种具有抗肿瘤活性的新型尿激酶原Kringle结构域变体蛋白的研究

利用PCR技术获得人尿激酶原Kringle结构域基因,将其克隆至具有T7启动子的表达质粒pET29a中,并进而插入plasminogen Kringle 5一段16肽片段构建了其变体,重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达,其产物以包涵体形式存在．通过体外复性,得到可溶性的prourokinase Kringle及其变体．所得蛋白质经过动物肿瘤模型测活,确定变体蛋白具有抑制肿瘤生长作用．     

检测CyPA自身抗体滴金免疫测定法的建立

建立一更快速、简便的检测人血清抗ＣｙＰＡ自身抗体的方法．用重组人ＣｙＰＡ和胶体金标记的蛋白Ａ建立了检测抗ＣｙＰＡ自身抗体的滴金免疫测定法．将ｒｈＣｙＰＡ点样包被于硝酸纤维素膜,抗体在血清渗滤过程中与膜上抗原反应而固定,通过胶体金标记的蛋白Ａ直接显色,阳性结果在膜中央出现一红色斑点．整个测定过程在５ｍｉｎ内完成．与ＥＬＩＳＡ法对比检测了４５份ＳＬＥ病人血清,两法均阳性２０份,均阴性２３份,总符合率为９５．６％．本法简便易行,耗时短,试剂安全、灵敏、特异,便于常规应用     

重组人胰岛素及C肽的分离纯化

对基因工程构建的含重组人胰岛素和C肽基因的毕赤酵母工程菌进行诱导表达，工程菌用甲醇诱导72 h后，离心去除菌体，上清液经中空纤维膜超滤后SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱层析，0~400 mmol/L NaCl梯度洗脱，得到纯度大于92％的重组人胰岛素原。经Lys-C酶和羧肽酶B酶切后，Sephadex G-25柱分离，得到了重组人胰岛素和C肽。     

耐热α-淀粉酶的筛选、基因克隆和酶学性质分析

【目的】筛选耐热α-淀粉酶并实现异源表达,同时分析其酶学性质特征。【方法】以M9培养基加上可溶性淀粉作为选择性分离培养基,从腾冲火山温泉土壤中筛选到产淀粉酶的菌株Anoxybacillus sp.GXS-3。根据淀粉酶氨基酸保守序列,设计引物进行PCR扩增,然后对目标序列进行步移扩增,获得淀粉酶基因AmyGX。将AmyGX与表达载体pQE30连接,导入大肠杆菌M15中表达,对重组酶进行分离纯化和酶学性质分析。【结果】AmyGX基因长1 515 bp,编码505个氨基酸残基,前23个氨基酸残基为信号肽序列;重组质粒pQE30-AmyGX编码的蛋白分子量为58.04kDa,对可溶性淀粉催化水解反应的最适温度为60℃,最适pH值为8.0,V_(max)、K_m值分别为0.19U/mg、3.14mg/mL,热半失活温度T_(50)~(30)值为65.2℃;Zn~(2+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Fe~(3+)、Ba~(2+)对该酶具有明显的抑制作用,Na~+、K~+对该酶有激活作用,Mg~(2+)、Ca~(2+)的影响则不明显。【结论】AmyGX是一种中等耐温碱性酶,在造纸、洗涤剂生产和有毒废弃物去除等方面具有潜在的应用前景。