蚕豆气孔保卫细胞中的NOS类蛋白定位及其功能分析

利用免疫荧光显微镜技术和免疫胶体金标记技术确定蚕豆气孔保卫细胞中存在一氧化氮合酶(NOS)类似蛋白, NOS主要分布在气孔保卫细胞的细胞核、细胞质、叶绿体、线粒体以及细胞壁上. 局部灼伤和外源茉莉酸(JA)都能提高蚕豆叶片和表皮NOS活性和一氧化氮(NO)水平, NOS的活性变化与叶片中的NO的变化趋势基本一致; NOS抑制剂L-NAME可抑制JA诱导的NO水平的增加. 由此推测, NOS途径是伤胁迫和JA诱导形成NO的主要途径. 药理学实验表明适当增加Ca²⁺浓度能够提高叶片NOS的活性和NO的水平, 说明蚕豆叶片NOS活性和NO的分布具有一定的钙依赖性. 保卫细胞中NOS及其催化形成的NO可能通过对气孔运动的调节参与植物对逆境的响应.     

蚕豆保卫细胞中类整合蛋白的鉴定

整合蛋白（integrins)是一类广泛存在于动物细胞表面的蛋白质。它介导细胞和胞外基质、细胞和细胞之间的黏连,也参与细胞内外的信息传递。以前的研究表明,微管和微丝参与调节气孔的运动。利用人整合蛋白（αvβ3/β5)的多克隆抗体证明类整合蛋白存在于蚕豆保卫细胞,并对其进行了定位。Western免疫印迹结果表明在纯化的蚕豆保卫细胞原生质体的膜碎片中存在类整合蛋白,其分子量分别为47．3,43．7和41．1ku。共聚焦激光扫描显微镜观察表明,类整合蛋白存在于蚕豆保卫细胞质膜上,且主要分布在背壁的细胞膜上,这与保卫细胞和表皮细胞之间的信号转导是一致的。因此,这项研究结果证明类整合蛋白存在于蚕豆保卫细胞的质膜上。     

一氧化氮参与水杨酸对蚕豆气孔运动的调控

研究了一氧化氮(NO)在水杨酸(SA)诱导蚕豆气孔运动中的作用. 结果表明, 在一定范围内, SA和NO都可诱导气孔关闭. 100 mmol/L SA能够提高保卫细胞胞质中NO的水平, NO清除剂和一氧化氮合酶(NOS)抑制剂都能够降低SA引起的胞质NO的增加. 同时, NO的清除剂PTIO和NOS的抑制剂L-NAME几乎能够完全抵消SA诱导气孔关闭的效应. 推测SA通过NOS途径诱导形成NO, 进而诱导气孔关闭. 鸟氨酸环化酶的抑制剂ODQ和 cADPR的拮抗剂烟碱能够减弱SA和NO诱导气孔关闭的作用. 表明在SA和NO诱导气孔关闭的过程中可能需要有cGMP和cADPR介导.     

气孔运动中pH 对保卫细胞壁弹性模量的影响

保卫细胞壁的特性对气孔运动有重要的影响. 以前的研究多集中于保卫细胞壁的解剖结构, 对气孔运动中保卫细胞壁物理性质的改变了解很少. 本研究以蚕豆叶片表皮条为材料,运用细胞压力探针技术, 对气孔运动中不同pH下的保卫细胞壁弹性模量(ε)进行了测量. 研究发现, 当pH 从8.60 降至6.50 时, 保卫细胞壁的弹性模量从7.098 Pa 降至5.690 Pa. 气孔运动中, 较低的保卫细胞壁弹性模量有利于保卫细胞改变体积, 进而有助于气孔运动的完成. 从保卫细胞通过调控细胞壁pH 改变细胞壁弹性模量的角度来分析气孔运动机理, 对于完善气孔运动机理假说, 进而深刻理解气孔运动, 具有重要的意义.     

一氧化氮参与茉莉酸诱导蚕豆气孔关闭的信号转导

用一氧化氮(NO)特异性荧光探针DAF-2DA结合激光共聚焦显微技术证明蚕豆气孔保卫细胞中存在NO. 从以下几个方面证明NO可能参与JA调控气孔运动的信号转导过程: (ⅰ) 外源JA促进叶片气孔保卫细胞NO的合成; (ⅱ) JA和NO都能够诱导气孔关闭, 并具有浓度效应; (ⅲ) 低浓度的NO和JA之间在诱导气孔关闭上存在一定的加合效应; (ⅳ) NO的清除剂PTIO可大大减弱JA诱导蚕豆气孔关闭的作用, 一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME能够抑制JA 诱导的蚕豆气孔关闭效应, 也可以抑制JA诱导保卫细胞中NO的产生. 推测JA处理诱导保卫细胞中NO的产生主要来源于NOS合成途径.     

气孔开放时保卫细胞液泡中某些高聚物解聚对渗透调节的作用

电子显微镜观察显示: 蚕豆(V. faba L)叶片气孔开放前后, 保卫细胞液泡(GCV)中颗粒的平均体积下降了约3个数量级, 而分布密度增加了约2个数量级. 同时用激光共聚焦显微术的荧光比值法对气孔开放过程的跟踪测定说明, 在第1个可分辨的气孔开放动作前10 ~ 30 s时GCV的pH有一个约-0.5单位的变化, 一个快速的气孔开放过程紧随其后, 在约100 ~ 200 s的时间内达到稳定的约12 μm的开度. 提出了一个由-ΔpH变化诱导的与GCV 内某些高聚物解聚有关的渗透调节模式. 该模式所描述的渗透调节过程避免了传统“化学渗透”假说所依赖的耗能巨大的逆浓度梯度的跨膜运输, 是对气孔运动的多元调控假说的补充, 同时也为植物中其他快速运动机理的研究拓宽了思路.     

血红素加氧酶催化产生的CO参与ABA诱导的蚕豆气孔关闭及其信号转导

一氧化碳(CO)是哺乳动物中新发现的一种重要的生物活性/信号分子, 其生物学效应往往通过一氧化氮(NO)和环鸟苷酸(cGMP)信号介导. 本研究发现, 可引起蚕豆叶片气孔关闭的ABA处理能诱导蚕豆叶片CO释放的增加以及CO合成酶血红素加氧酶(HO)活性的提高; 同时, ABA诱导的蚕豆气孔关闭也可以被CO合成酶抑制剂ZnPP和CO/NO清除剂血红蛋白(Hb)部分阻断. 进一步的研究表明, 外源添加CO供体高铁血红素(Hematin)和CO水溶液不仅能促进CO的释放, 还能以依赖于时间进程的形式诱导蚕豆气孔的关闭, 后者与NO供体SNP处理的结果相类似; NO合成酶硝酸还原酶(NR)的抑制剂钨酸钠(Tungstate), NO专一性清除剂cPTIO, ZnPP和Hb不同程度地逆转了这一过程. 在4 h的处理过程中, SNP, 0.01%饱和度的CO水溶液以及Hematin明显地激发了NO的产生; 反之, 结合cPTIO或Tungstate处理后, NO的荧光信号几乎被完全抑制. 此外, 鸟苷酸环化酶(GC)的抑制剂ODQ阻断了CO诱导的气孔关闭, 而ODQ的作用又被cGMP的类似物8-Br-cGMP所逆转. 上述结果暗示, HO产生的CO可能参与了ABA诱导的蚕豆气孔关闭, NO和cGMP则是CO信号通路的下游分子.     

植物细胞50ku类角蛋白与β微管蛋白共存

用选择性抽是法从悬浮培养的烟草原生质体中得到类中间纤维蛋白,免疫印迹反应显示其主要成分是分子量分别为６４,５８,５５,５４,５０,４５ｋｕ的６种类角蛋白,其中５０ｋｕ蛋白与微管蛋白多抗亦有免疫交叉反应。     

Ca2+参与蚕豆保卫细胞中毒蕈碱型受体介导的乙酰胆碱信号转导

动物神经递质乙酰胆碱(ACh)也存在于植物体内, 并发挥多种重要生理功能. 一定浓度的ACh可诱导气孔开放. 以Ca²⁺荧光指示剂Fluo-3AM为探针, 利用激光共聚焦扫描显微镜观察ACh调控气孔运动中保卫细胞胞质Ca²⁺的动态变化. 结果证明, 外加ACh促使保卫细胞胞质Ca²⁺的瞬时增加. 毒蕈碱型乙酰胆碱受体(mAChR)的激活剂毒蕈碱与ACh的作用类似, 也能激活胞质Ca²⁺的瞬时增加; 反之, 毒蕈碱型受体的抑制剂阿托品预处理则抑制ACh诱导的Ca²⁺增加, 这与动物中mAChR的作用机制类似. 用EGTA螯合胞外Ca2+或用钌红阻断液泡Ca²⁺的释放, 结果表明ACh诱导的保卫细胞胞质Ca²⁺增加主要来源于胞内Ca²⁺库的Ca²⁺释放. 研究表明, 经过mAChR介导, Ca²⁺参与保卫细胞响应ACh刺激的信号转导.     

ATHK1位于过氧化氢下游并通过调节钙通道介导保卫细胞ABA信号转导

植物通过不断进化增强对环境中水分缺乏的抵抗能力.脱落酸在植物干旱和渗透胁迫反应中起到重要的作用.组氨酸激酶也被认为是作为感受子和调节子对水分亏缺作出反应.本研究结果显示,组氨酸激酶1介入了拟南芥脱落酸诱导的气孔信号转导,该酶此前被认为是一种渗透调节因子.ATHK1基因缺失突变体不能表现保卫细胞中正常的脱落酸反应,包括气孔关闭、过氧化氢产生以及钙内流.膜片钳及激光共聚焦结果显示,ATHK1在脱落酸诱导的气孔关闭过程中可能位于过氧化氢下游,并通过调节钙通道和保卫细胞钙震荡来起作用.     

类DnaJ蛋白基因sll1384参与集胞藻PCC 6803的趋光反应

在集胞藻PCC 6803中, 基因sll1384编码的蛋白在N端含有一个DnaJ结构域, C端含有一个TPR结构域. sll1384突变株对不同温度的适应能力同野生型没有区别, 但其趋光运动能力几乎丧失. 将野生型sll1384基因导入突变株后, 可恢复其向光运动. 电子显微镜观察发现, 突变株细胞表面的纤毛与野生型没有明显区别. 突变株的转化效率也与野生型相同, 推测Sll1384通过与其他蛋白相互作用调节集胞藻的趋光反应. 这是在蓝藻中发现的第一个影响趋光反应的类DnaJ蛋白基因.     

肺鱼干扰素调节因子 1 基因(irf-1)的克隆及其在肉鳍类中的分子进化

肉鳍类是脊椎动物的重要类群, 分为总鳍鱼类和四足类. 其中总鳍鱼类现生的物种包括腔棘鱼和肺鱼. 四足动物则包括两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类. 为了比较肉鳍类irf-1 基因的结构特点和系统发育意义, 本研究克隆了肺鱼irf-1 基因cDNA 全序列, 并与肉鳍类中其他物种的irf-1 基因进行了比对分析. IRF 是与自然免疫相关的蛋白质, 目前已发现了11 个家族成员, 其中irf-1 和irf-2 是最先被发现的2 个成员, 在天然免疫中起着重要的作用. 但有关IRF-1 的报道主要集中在哺乳动物, 其他类群中鲜有报道. 与已报道的irf-1 基因一样, 肺鱼的irf-1 基因可读框的前345 核苷酸非常保守, 在其C 端也含有1 个反式激活区(transactivationdomain)和1 个IRF 结合域2 (IAD2)的模体. 虽然肺鱼与四足动物最近的共同祖先距今有417个百万年之久, 但跨肉鳍类的序列分析显示, IRF-1 氨基酸及其基因序列在肉鳍类中都具有较强的保守性和显著的系统发育意义. 用IRF-1 氨基酸序列所构建的肉鳍类系统发育与已有报道的结果也是一致的.     

强光照处理菠菜叶片产生的交联聚合物中D1蛋白部分发生磷酸化

利用D1蛋白特异性抗体, 在强光照(800~2500 μmol photons·m^-2·s^-1)处理3 h的菠菜叶片类囊体膜中检测到4种D1蛋白聚合物, 它们的相对含量与处理时光照强度相关. 进一步分析表明, 70 kD聚合物为D1蛋白与CP43交联产物, 65和60 kD聚合物是D1蛋白与D2蛋白交联产物, 41 kD聚合物是D1蛋白与细胞色素b₅₅₉ α亚基交联物. 1000 μmol photons·m^-2·s^-1光照处理生成的D1/Cyt b₅₅₉聚合物最多, 光强增加时其含量下降. 磷酸化苏氨酸抗体Western blot分析结果显示, D1/Cyt b₅₅₉和D1/CP43聚合物中存在磷酸化蛋白; 外加磷酸酯酶处理后, 磷酸化的D1/Cyt b₅₅₉和D1/CP43聚合物减少. 上述结果表明, 强光照处理叶片引起D1蛋白与其他PSⅡ核心蛋白交联, 所生成的聚合物中部分D1蛋白以磷酸化形式存在.