Therapeutic induction of angiogenesis by direct myocardial administration of an adenovirus vector encoding human hepatocyte growth factor gene and its safety

After the study in vitro and in rats, we assessed further the effects and safety of local angiogen therapy using intramyocardial delivery of an adenovirus carrying hepatocyte growth factor gene (Ad-HGF) in a canine ischemia model. The angiogenic activity of Ad-HGF was evaluated from three aspects. First, the augmentation of collateral vessel development was assessed by angiography 30 d after surgery. The results showed that the density of collateral vessels in treated group was higher than that of control group. Secondly, infarct size was evaluated by TTC staining and image analysis. The results showed that the infarct size of treated group was smaller than that of control group. Thirdly, the myocardial regional blood flow was determined by the method of colored microspheres. The results showed that the blood flow recovered to the level before ligation in treated group, but that of the control group was lower than normal level. In addition, during the study of chronic toxicity, we tested the anti-adenovirus antibodies by neutralization method. The antibodies yielded after the fourth injection decreased slowly from peak level and disappeared 12 weeks after drug withdrawal. Overall, Ad-HGF can promote angiogenesis in ischemic myocardium and reduce infarct size. So this method may be considered as a therapeutic angiogenesis induction strategy for ischemic disease including myocardial infarction and peripheral artery disease. At the same time, Ad-HGF could induce the yield of anti-adenovirus antibodies to neutralize adenovirus, which may be the mechanism of adenovirus clearance.     

重组Nkx2．5腺病毒的构建及心肌细胞感染实验

利用AdEasy腺病毒表达系统构建了Nkx2．5重组腺病毒．Nkx2．5基因克隆入pAdTrackcmv质粒,pAdTtrackcmv—Nkx2．5经Pme I线性化后转化含pAdEasy-1的BJ5183菌进行同源重组,以构建pAdEsay-Nkx2．5重组质粒．pAdEsay—Nkx2．5转染293A细胞进行病毒包装．以Ad-Nkx2．5重组腺病毒感染Hela及乳鼠心肌细胞,检测了Nkx2．5蛋白表达及对下游ANF和β-MHC基因的表达调控;并采用感染病毒的H9c2心肌细胞经H2O2处理建立细胞凋亡模型,采用噻唑蓝法和荧光染色法检测了细胞存活率和凋亡细胞的形态变化．结果显示,Nkx2．5过表达能抑制H2O2诱导的H9c2细胞凋亡．     

单纯疱疾病毒胸苷激酶基因的脑肿瘤基因治疗研究

单纯疱疾病毒胸苷激酶基因（HerpesSimplexVirus－ThymidineKinase,HSV－tk）,配合核苷酸类似物（NAS）GCV或ACV的基因治疗是目前肿瘤基因治疗领域中一种较有希望的治疗方法．反转录病毒和腺病毒介导的HSV－tk／NAS肿瘤基因治疗系统的建立,并运用该系统进行脑胶质瘤、垂体瘤、黑色素瘤的基因治疗离体细胞和动物试验,取得了显著的肿瘤杀伤作用,特别是腺病毒介导的脑胶质瘤基因治疗动物试验效果很显著,能够完全消除肿瘤．同时,还建立了反转录病毒以及腺病毒HSV－tk基因治疗的安全性检测体系,为基因治疗的临床试验提供了安全性保证．     

Construction and in vitro Study of an E1B-Defective Adenovirus

0　IntroductionTheconceptofvirotherapy ,anapproachtocurecancerwithviruses,wasinspiredlateofthelastcenturybytheobser vationofoccasionaltumorregressionsincancerpatientssufferingfromvirusinfectionsorreceivingvaccinations[1 ] .Conditionalin tratumoralreplicationofaviralagentmayleadtoimprovedeffica cyovernon replicatingagentsbecauseoftheinherentnatureofthetreatmentwithvirusmultiplication ,lysisoftheinfectedcan cercellandspreadtoadjacentcells.SincetheleadingeffortsofOnyxPharmaceuticals (Richmond ,…     

Construction and<Emphasis Type="Italic">in vitro</Emphasis> study of an E1B-defective adenovirus

An E1B-defective adenovirus named rl/Ad was constructed by homologous recombination.The construction,selection and propagation of recombinant virus was done in the human embryonic kidney 293 cells (HEK293).The in vitro study demonstrated that the recombinant virus has the ability to replicate in and lyse some p53-deficient human tumor cells such as the human glioblastoma tumor cells (U251) and human bladder tumer cells (EJ) but not in the normal cells with functional p53 such as the human fibroblast cells (MRC-5).Also,based on the cytopathic effect (CPE),it was demonstrated that the U251 cells were more sensitive to the infection of rl/Ad than that of EJ cells under identical conditions.In this paper,it was found that rl/Ad could be very useful in studying the in vitro selective replication of E1B-defective adenovirus.This may help to determine the safety of using any E1B-defective adenoviruses in cancer gene therapy.     

汉滩病毒囊膜糖蛋白g2基因重组腺病毒的构建与表达

获得汉滩病毒G2 基因 ,构建其重组腺病毒并在HEK2 93细胞中包装表达 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础。设计引物采用PCR从含汉滩病毒 \|76 1 1 8株M基因的M5 6质粒扩增出糖蛋白G2 基因片段 ,并将其克隆入腺病毒载体Adeno XviralDNA ,筛选获得重组腺病毒DNA ,转染HEK2 93细胞 ,包装、扩增后得到汉滩病毒G2 基因重组腺病毒原种 ;并在感染细胞内初步表达 ,用ELISA检测表达产物。得到了含汉滩病毒G2 基因的重组腺病毒 ,其滴度约为 1 0 10 pfu/mL ,同时在感染的HEK2 93细胞中检测到汉滩病毒糖蛋白G2 的表达。含汉滩病毒糖蛋白G2 基因重组腺病毒的成功构建 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础     

弹性蛋白酶保护因子--Elafin结构基因腺病毒载体穿梭质粒的构建、鉴定及表达

构建能表达弹性蛋白酶保护因子———elafin基因腺病毒表达载体的穿梭质粒,为进一步包装能高效表达结构蛋白的腺病毒载体做准备.以含有elafin基因的真核质粒pEGFP-N1-Elafin为模板,PCR扩增elafin基因,PCR产物以SalⅠ、EcoRⅤ双酶切,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中CMV启动子下游SalⅠ与EcoRⅤ位点之间,获得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-Elafin,通过SalⅠ及EcoRⅤ双酶切、PCR及插入片段序列测定对该质粒进行鉴定,将pAdTrack-CMV-Elafin转染293细胞,以RT-PCR及Western-Blot检测其在293细胞中的瞬时表达.结果表明:双酶切、PCR及测序鉴定证实,pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒的插入片段为elafin基因,用pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒转染293细胞后可见绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR和Western-blotting表明其可在293细胞中瞬时表达.     

hPNAS-4腺病毒载体的构建及其体外抗肿瘤作用

[摘要] 目的：构建携带人的凋亡相关新基因PNAS-4(hPNAS-4)的重组腺病毒,并观察其感染人肺癌A549细胞所引起的hPNAS-4过表达对体外肿瘤细胞凋亡的影响。方法：用RT-PCR从293A细胞中克隆hPNAS-4编码区cDNA,将其酶切后连接至pENTR11载体上,再通过pENTR11与腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST之间的同源重组作用将hPNAS-4基因片段重组至pAd/CMV/V5-DEST上,最后经293细胞的包装扩增后得到携带hPNAS-4基因的重组腺病毒;将重组腺病毒体外感染人肺癌A549细胞;用RT-PCR检测感染细胞中hPNAS-4的过表达情况;通过MTT、流式细胞术及DNA Ladder分别检测感染细胞的增殖与凋亡情况。结果：从293A细胞中中克隆到hPNAS-4全长cDNA并成功构建腺病毒表达载体Ad-hPNAS-4,经测定其滴度为：2.4×108 pfu/ml,感染人肺癌A549细胞后：经RT-PCR测得其mRNA表达明显上调,MTT检测结果为细胞增殖受到明显抑制,流式细胞术测得细胞凋亡率明显升高,琼脂糖凝胶电泳显示其基因组DNA有明显的梯状条带（DNA ladder）;结论：hPNAS-4腺病毒载体感染人肺癌A549细胞后,发现hPNAS-4过表达对肿瘤细胞的生长有明显的抑制和诱导凋亡作用,为今后研究其分子机制以及hPNAS-4腺病毒载体应用于肿瘤动物实验和肿瘤基因治疗提供实验资料。     

重组腺相关病毒的小量制备与体内体外感染研究

 重组腺相关病毒(rAAV)是近年来发展的较为成熟的一种病毒基因载体, 常用于过表达或者敲低等动物模型的建立与基因治疗等。本研究使用三质粒共转染的方法, 在HEK293细胞中包装出含绿色荧光蛋白(EGFP)基因的rAAV, 通过一系列实验, 确定纯化方法为脱氧胆酸钠裂解, 高浓度NaCl去除杂蛋白, 最后通过肝素层析柱纯化, 经超滤管浓缩后其滴度可达10¹³ gene copys/mL以上。将纯化后的rAAV 感染HEK293 细胞, 通过实验确定使用感染复数为10⁶、感染3 d 的细胞能够表达出高水平的EGFP。将rAAV注射入大鼠中脑黑质致密部, 经过3周的感染发现, rAAV可以特异性地感染多巴胺能神经元, 表达出EGFP。通过以上实验, 建立了一个在实验室小量制备rAAV的方法, 且此方法制备的rAAV完全满足体内与体外实验的要求。     

用大鼠心肌条件培养基建立来源于C57BL/6J小鼠的ES细胞系

报道一种新的建立C57BL/6J小鼠ES细胞系的方法。采用大鼠心肌条件培养基,在不使用饲养层细胞和白血病抑制因子(LIF)的情况下,从C57BL/6J品系小鼠中建成1个ES细胞系即MESPU 41,成系率为1.0%。MESPU 41细胞为XX型,核型正常率高达89%,表现出XX型ES细胞系少有的稳定性。进行体内分化实验时MESPU 41细胞能发生广泛分化形成畸胎瘤。嵌合体制作实验证实MESPU 41细胞具有嵌合能力,能参与胚胎的发育。采用RT-PCR方法,检测出大鼠心肌细胞有LIF mRNA的表达,这可能与其条件培养基保持ES细胞未分化状态并使X染色体稳定有关。同时,还对大鼠心肌细胞进行了永生化的尝试,共得到了4个永生化克隆,这将进一步简化ES细胞建系和培养工作,为进一步研究ES细胞在体外培养过程中的稳定性开创了新的起点。     

重组腺病毒Canstatin对人肝癌HepG2细胞增殖影响的研究

为研究重组腺病毒Canstatin感染人肝癌HepG2细胞及细胞转染后Canstatin在HepG2细胞中的表达,探讨Canstatin基因对人肝癌HepG2细胞生长增殖的影响。采用不同感染复数(MOI=10、40、80)的腺病毒Ad-Canstatin-GFP感染HepG2细胞,倒置荧光显微镜下观察细胞形态,流式检测感染效率,Real-Time PCR和Western blot法检测HepG2细胞中Canstatin mRNA和蛋白表达。CCK-8法检测细胞增殖能力的变化,Western blot法检测细胞中PCNA蛋白的表达。结果显示MOI为40时,72 h感染率可达到98.9%,HepG2细胞中Canstatin mRNA和蛋白表达均高于对照组和空载体组(P0.05)。HepG2细胞感染Ad-Canstatin腺病毒后生长增殖受到抑制(P0.05),且PCNA的表达低于对照组(P0.05)。由此可知,Canstatin抑制人肝癌HepG2细胞的生长增殖有作用可能与影响PCNA的表达有关。     

贴壁及悬浮培养的Trex-293细胞生长及其重组腺病毒制备产率的比较分析

为了提高病毒产率并避免制备的重组腺病毒产物中残留的动物血清,将贴壁生长的Trex-293细胞用无动物血清的CD293培养基在搅拌式培养瓶中悬浮培养。分析比较其生长特征及不同条件下的病毒产率。结果表明悬浮培养的细胞生长为稳定状态的时间比贴壁培养时稍长,但每次以(4—6)×105cells/mL密度传代。(3—4)d后基本达到2×106cells/mL,21 d达3×106cells/mL以上,比贴壁细胞密度约高3倍。培养初期,悬浮细胞存活率稍低,培养14 d开始维持90%以上,细胞倍增时间约32 h。而贴壁细胞存活率是基本维持在95%以上。重组腺病毒以200,500和1 000 VP/cell的比例感染悬浮细胞所获产率均值各为18 000,14 000和990 VP/cell,而1 000 VP/cell的比例感染贴壁细胞所获产率均值为10 500 VP/cell。结论为Trex-293细胞用无动物血清的培养基在搅拌式培养瓶中可悬浮培养,当重组腺病毒感染比例为200 VP/cell,感染后48 h,细胞存活率50%时收获有利于提高病毒产率,且高于感染贴壁细胞所获产率。     

腺病毒介导ERK-2基因在生长板软骨细胞中的表达

目的:构建ERK-2基因重组腺病毒载体,检测构建的腺病毒感染原代大鼠生长板软骨细胞的效率以及目的基因的表达。方法:将ERK-2 cDNA亚克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转染E.Col.i B J5183,将筛选、鉴定的重组腺病毒质粒线性化后转染HEK293细胞进行病毒颗粒的包装;流式细胞术检测不同感染复数(MO I)ERK-2重组腺病毒感染原代培养的大鼠肋生长板软骨细胞的效率,W estern b lot检测腺病毒感染的生长板软骨细胞中ERK-2蛋白的表达。结果:成功构建ERK-2重组腺病毒,MO I 50的腺病毒感染原代生长板软骨细胞的效率大于90%,感染的生长板软骨细胞中ERK-2表达显著增加。结论:构建的重组腺病毒可介导ERK-2基因在原代大鼠生长板软骨细胞中高表达。     

汉坦病毒CTL多表位重组腺病毒的构建及免疫学分析

目的：构建含汉坦病毒M基因（编码糖蛋白G1）和部分S基因（编码核蛋白主要抗原区段）以及S基因的多个 CTL表位的多种重组腺病毒表达载体,并对这些重组腺病毒的免疫学特性进行研究。方法：构建含目的基因的重组腺病毒载体,并对其表达产物进行鉴定。利用纯化后的重组腺病毒免疫BALB/C小鼠,通过多种免疫学方法检测其免疫反应。结果：成功表达出可被汉坦病毒核蛋白特异性单抗(mAb)及糖蛋白G1 的特异性单抗所识别的融合蛋白;重组的腺病毒可以有效刺激针对汉坦病毒NP及GP的免疫应答;同时结果表明在CTL多表位间加入间隔序列AAY的重组腺病毒免疫小鼠能产生更高的细胞免疫应答。结论： 构建的含CTL多表位的重组腺病毒可以有效的提高嵌合基因刺激细胞免疫应答的能力。间隔序列AAY对于各CTL表位的分隔有效地提高了重组腺病毒的免疫效果。     

携带p53基因重组腺病毒载体的构建

将pCMVp53重组转移载体经BamHI和NheI酶切,得到p53基因cDNA,然后将cDNA片段克隆到转移载体pCMV5GFP,使其受CMV5启动子的调控,获得pCMV5p53重组转移载体.用该线状重组转移载体与腺病毒右臂DNA经磷酸钙共转染293细胞获得重组腺病毒,经酶联免疫吸附法(ELISA)测定p53蛋白含量,证明外源p53基因在含重组腺病毒的293细胞中得到表达.     

乙型肝炎病毒聚合酶基因在重组腺病毒系统中的表达

乙型肝炎病毒是一种重要的人类病原,乙肝病毒聚合酶在病毒的复制中具有关键作用．拼接了HBV56的聚合酶全长基因,利用重组腺病毒系统,在HEK293细胞中表达乙肝病毒聚合酶．通过一种半定量PCR方法,检测到所表达的蛋白具有逆转录酶活性．这一研究对深入认识该酶结构与功能的关系,研制抑制病毒复制的药物,有一定的意义．     

CRISPR/Cas9基因转录激活技术的建立及其应用

建立基于CRISPR/Cas9的基因转录激活技术,实现在HEK293细胞中激活cGAS基因的转录。首先利用慢病毒载体构建稳定表达Cas9的HEK293细胞;并采用Real-time PCR和western blot方法鉴定Cas9蛋白质表达效果。再选取不同靶序列,分别构建用于激活cGAS基因转录的sgRNA载体,将构建好的序列载体与CRISPR体系工具质粒共转染至稳定表达Cas9的HEK293细胞中。采用Real-time PCR方法检测细胞中内源cGAS的转录激活效果。成功建立了基于CRISPR/Cas9的基因转录激活技术,并在c GAS基因阴性表达的细胞中激活基因的转录。     

磷酸化壳聚糖-季铵化壳聚糖载体提高体内外基因转染功效

本研究通过磷酸化壳聚糖(PC)包被季铵化壳聚糖(TMC)/质粒(pDNA)纳米复合物,制备PC/TMC/pDNA三元复合物(PTC),用于提高体内外基因转染功效.PTC粒径为100~200nm,Zeta电势为-16~-34mV,可有效缩合pDNA,保护pDNA免遭核酶降解.PC降低PTC中pDNA结合力,增加体外释放量.表面荷负电的PTC抗非特异性蛋白吸附能力强,经小窝蛋白介导的细胞内吞途径入胞后逃避溶酶体降解,细胞核内分布比例高.HEK293细胞体外转染试验结果显示,PTC体外转染效率是TMC/pDNA纳米复合物(TC)的1.5~3.1倍;小鼠胫前肌注射给药试验结果表明,PTC可显著提高基因体内转染效率.因此,合适质量比的PTC有望作为功能性基因药物的递送载体,用于基因治疗.