木糖还原酶定点突变设计的生物信息学分析

木糖代谢过程中,木糖还原酶（XR）和木糖醇脱氢酶（XDH）的氧化还原不平衡是利用纤维素生成酒精的关键问题之一.文中借助生物信息学手段（同源建模、酶和辅酶分子对接）,通过分析数据库资源,找到了一些影响XR活性或辅酶依赖性的关键氨基酸.结果表明：树干毕赤氏酵母XR与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）之间形成氢键的氨基酸有Lys21、Val222、Glu223、Phe236和Thr273,与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）之间形成氢键的氨基酸有Val222、Glu223、Phe236、Glu237和Thr273;突变Lys21（完全保守）使树干毕赤氏酵母XR只与辅酶NAD结合,突变Glu237（不完全保守）使树干毕赤氏酵母XR只与辅酶NADP结合;热带假丝酵母XR与NADP之间形成氢键的氨基酸有Asn278和Arg282（两者都不完全保守）,要改变其NADP依赖性,可以替代Asn278和/或Arg282.     

树干毕赤氏酵母木糖还原酶Lysine270突变的理性设计

木糖代谢过程中木糖还原酶（XR）和木糖醇脱氢酶（XDH）的氧化还原不平衡是利用纤维素生成酒精的关键问题之一.前期研究发现Lysine270是形成树干毕赤氏酵母木糖还原酶（P. stipitis XR）与NAD(P)结合口袋的关键氨基酸之一.为研究Lysine270对P. stipitis XR辅酶偏好性的影响,本研究将Lysine270用其它19种氨基酸替代,构建19种不同的XR突变子,利用同源建模和分子对接的方法评价不同突变子与NAD(P)之间的相互作用,并从中选择两个突变子K270R和K270N进行试验验证.树干毕赤氏酵母木糖还原酶K270R、K270N突变基因及野生基因WT-XYL1分别在大肠杆菌中进行了表达,表达后的蛋白经His-Tag纯化柱纯化后再进行辅酶偏好性及酶学性质研究.结果发现,Lysine270突变直接影响XR与NAD(P)的Km值,通过理性选择得到的K270N突变子的辅酶依赖性由NADPH完全逆转为NADH.     

氨基酸对锯缘青蟹N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的效应

研究Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met、Asn、Cys、Ser、Thr、Asp、Glu、His、Lys、Arg等17种氨基酸对锯缘青蟹(Scylla serrata)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响.结果表明:非极性氨基酸中Gly、Ala、Leu、Phe对酶活力几乎没有作用,而Val、Ile对酶略有激活,20 mmol/L的Val可以使酶活力提高7.5%,40 mmol/L的Ile可以使酶活力提高10.5%;Pro、Met对该酶略有抑制作用,当浓度为40 mmol/L时,分别可以使酶活力下降15.2%和9.8%;极性氨基酸Asn、Cys、Ser、Thr对酶的活力没有影响;带负电荷的酸性氨基酸Asp和Glu对酶有抑制作用;带正电荷的碱性氨基酸His对该酶略有抑制,Lys和Arg对该酶抑制作用较强.研究Lys和Arg对酶催化pNP-NAG水解反应的抑制机理,并测定其抑制常数,结果表明:Lys和Arg的抑制作用均表现为可逆效应,抑制类型均为反竞争性抑制,其K.分别为5.29mmol/L和3.76 mmol/L.     

树干毕赤酵母木糖还原酶Lysine270定点突变的理性设计

Lysine270是树干毕赤酵母木糖还原酶(PsXR)与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)形成结合口袋的关键氨基酸之一.为研究该位点对PsXR辅酶偏好性的影响,用其它19种氨基酸替代Lysine270,构建19种不同的木糖还原酶(XR)突变子,利用同源建模和分子对接的方法评价不同突变子与NAD+或NADP+之间的相互作用,并从中选择突变子K270R和K270N进行实验验证.突变基因及野生基因用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)在大肠杆菌内进行诱导表达,经纯化后进行酶学性质研究.结果发现:K270R突变使得XR与NADP+的结合能力降低,米氏常数Km由0.025mmol/L升高到0.050mmol/L;K270N突变使得XR与NADP+不能结合.实验结果亦证实,通过理性选择得到的K270N突变子的辅酶依赖性由NADPH完全逆转为NADH.     

降纤酶的分离纯化及其性质

蛇毒蛋白对抑制血栓形成和溶解血栓具有较好的疗效 ,但由于得不到性质稳定、组分单一的酶蛋白 ,影响了其临床效果。该研究通过亲和层析方法 ,从长白山白眉蝮蛇乌苏里种蛇毒中分离提纯到 SDS- PAGE图谱为单一组分糖蛋白——降纤酶 ,相对分子质量约 3.6× 10 4。该酶具有体外凝血、体内抗凝作用。等电点约为 4 .2 5。HPL C分析结果表明其纯度为 99%。最适温度为 70℃ ,最适 p H =8.0。动力学研究表明该酶为一 Michaelis- Menten酶 ,Michaelis常数为0 .32 0 mm ol/ L,最大反应速度为 0 .117μm ol/ m in。EDTA,Mg2 + ,Cu2 + 对其有抑制作用。测定该酶 N端 2 0个氨基酸的序列是 Val Ile Glu Glu Asp Glu Cys Asn Ile Asn Glu His Arg Phe L eu,与其他的蛇毒类凝血酶有高度同源性。     

热带假丝酵母XYL1基因的克隆及序列分析

木糖还原酶(XR)是D-木糖代谢途径中的关键酶,催化还原D-木糖成木糖醇.已报道的热带假丝酵母(Candida tropicalisIF0 0618)木糖还原酶只能利用NADPH,而本研究中的热带假丝酵母(C.tropicalisAY92045)木糖还原酶能够同时利用NADH和NADPH作为辅因子,有利于细胞内的辅酶平衡和木糖醇的产生.经克隆测序与Blast X比较其与已报道C.tropicalis木糖还原酶基因XYRA和XYRB的差异,分析改变的氨基酸位点对结合辅酶的影响,并为下一步研究该酶性质及构建高     

长毛对虾必需氨基酸的研究

分析了不同体长组的长毛对虾生化组成和必需氨基酸(EAA)的可能种类。结果表明:(1)长毛对虾的最主要生化物质蛋白质的含量似有随体长增长(40 mm至 104 mm)而升高。但糖类含量较稳定;(2)注射~3H-葡萄糖后测得 Glu,Asp,Ser,Pro,Gly,(Cys)_2和 Ala等带有较强的放射性,长毛对虾可能从葡萄糖合成这些氨基酸。而极少或甚至没有~3H 参入到Met,Thr,He,Leu,Val,Arg,His,Lys,Phe,Tyr和Trp中。这些可能是长毛对虾的EAA。     

饲料用灌木中氨基酸含量的快速定量分析方法

用日立L-8800型氨基酸自动分析仪对饲料灌木中Asp(天冬氨酸)、Thr(苏氨酸)、Ser(丝氨酸)、Glu(谷氨酸)、Pro(脯氨酸)、Gly(甘氨酸)、Ala(丙氨酸)、Cys(半胱氨酸)、Val(缬氨酸)、Met(蛋氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Lys(赖氨酸)、NH3(氨)、His(组氨酸)、Arg(精氨酸)等18种主要氨基酸作了定量分析,提出了一种同时测定饲料用灌木中多种氨基酸含量的自动分析方法.结果表明,灌木样品18种氨基酸测定的变异系数在2.02～3.96%之间,标准回收率在99.90～101.47%之间,该方法快速、简便、灵敏度高、重现性好、人为因素影响少,结果令人满意.     

珍珠薏米乳酸发酵饮料的研究

研究了以珍珠和薏米为主要原料制作乳酸发酵饮料的工艺。通过正交试验,确定最佳调配组合为:蔗糖10%,香精0.1%,薏米发酵液与珍珠水解液的体积比为2∶1。对饮料的可溶性固形物、酸度、还原糖、金属元素、氨基酸含量等指标进行了测定。结果表明,还原糖质量浓度为11.9 mg.mL-1;可溶性固形物为4.6%;pH值为4.97(16.5℃时);Zn、Mg、Fe、Mn、Na、Ca、K的质量浓度分别为0.1672,5.14340,.23260,.2933,241.76,136.093,4.87μg.mL-1;Cd、Pb、Cr、Cu和Co等均未测出;且含有Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Val、MetI、le、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg和Pro等16种氨基酸。     

血清胸腺因子(FTS)的合成和活性测定

采用芴甲氧羰基（Fmoc）固相肽合成法（Fmoc～SPPS）合成了血清胸腺因子（FTS）,用中压液相阴离子柱一步纯化,经HPLC分析纯度,通过质谱和氨基酸序列测定鉴定合成产物。根据FTS恢复胸腺切除小鼠的脾细胞对免疫抑制荆AZ敏感的特性测定合成FTS的活性。结果表明：化学合成血清胸腺因子的产率为94．7％;纯化后其纯度达到93．7％;质谱测定其相对分子质量为876．6,与理论分子量相符。氨基酸序列测定为NH2／Glu—Ala—Lys—Ser—Gin—Gly—Gly—Ser—Asn,与设计序列一致。实验显示在合成FTS的浓度为10^-14mol／L时尚有部分活力,在10^-13mol／L时能够完全恢复胸腺切除小鼠的脾细胞对AZ的敏感性。     

Redesign of the coenzyme specificity of a dehydrogenase by protein engineering

Directed mutagenesis and molecular modelling have been used to identify a set of amino-acid side chains in glutathione reductase that confer specificity for the coenzyme NADP+. Systematic replacement of these amino acids, all of which occur in a 'fingerprint' structural motif in the NADP+-binding domain, leaves the substrate specificity unchanged but converts the enzyme into one displaying a marked preference for the coenzyme NAD+.     

发酵抑制物对树干毕赤酵母戊糖发酵的影响

研究了常见发酵抑制物(甲酸、醋酸和乙醇)对树干毕赤酵母(Pichia stipitis)P2生长和发酵木糖的影响.结果表明:树干毕赤酵母P2具有良好的抗发酵抑制物能力.当发酵液中含有4.0 g/L的醋酸时,树干毕赤酵母P2生长和发酵木糖情况良好;当发酵液中含有5.0g/L的甲酸时,树干毕赤酵母P2对木糖的利用率降低,但对酵母生长的影响并不明显;另外,树干毕赤酵母P2耐受乙醇的浓度约为40.0 g/L.     

茶树体内游离氨—基酸对儿茶素代谢的影响

茶树体内儿茶素代谢受C/N 代谢平衡状态所制约.通过氨基酸对~(14)CO_2掺入儿茶素的影响,发现Glu、Lys 有正效应,而Ala、phe 有负效应.分析不同施氮量茶梢中的游离氨基酸,结果表明,体内Glu、Ala、phe、Thr 等含量及代谢活性的不同,至少是影响儿茶素含量的原因之一.     

Glutamate stimulates inositol phosphate formation in striatal neurones

The major excitatory amino acids, glutamate (Glu) and aspartate (Asp), are thought to act at three receptor subtypes in the mammalian central nervous system (CNS). These are termed quisqualate (QA), N-methyl-D-aspartate (NMDA) and kainate (KA) receptors according to the specific agonist properties of these compounds revealed by electrophysiological studies. Although Glu has been shown to stimulate cyclic GMP formation in brain slices, direct regulation of second messenger systems (cyclic AMP, Ca2+ or inositol phosphates) subsequent to activation of excitatory amino-acid receptors, has not been extensively studied. Here we demonstrate that in striatal neurones, excitatory amino acids, but not inhibitory or non-neuroactive amino acids, induce a three- to fourfold increase in inositol mono-, di- and triphosphate (IP, IP, IP) formation with the relative potency QA greater than Glu greater than NMDA, KA. The Glu-evoked formation of inositol phosphates appears to result principally from actions at QA as well as NMDA receptors on striatal neurones. Our results suggest that excitatory amino acids stimulate inositol phosphate formation directly, rather than indirectly by the evoked release and subsequent actions of adenosine or acetylcholine.     

Ca2+ -CaM与乙烯调节草莓果实NAD激酶和NADP磷酸酶活性的关系

用外源乙烯单独以及乙烯分别与钙离子通道阻塞剂异博定(Verapamil,Vp)、钙调素拮抗剂氯丙嗪(Chloropromaize,CPZ)、三氟拉嗪(Trifluoperazine,TFP)处理乳白期草莓果实12 h,移去乙烯之后在空气中继续放置24h,测定果实乙烯释放率、NAD激酶活性及NADP磷酸酶活性的变化.结果表明,外源乙烯能诱导草莓果实乙烯大量合成,比对照(未经任何处理)提高420%和73%,抑制NAD激酶活性约20%和40%,对NADP磷酸酶影响不明显.Vp、CPZ和TFP均能逆转外源乙烯诱导的乙烯合成以及对NAD激酶活性的抑制作用,表明乙烯可能通过抑制草莓果实中NAD激酶活性从而促进和加快果实成熟衰老,Ca2 、CaM可能介导草莓果实的乙烯信号转导.     

两种木质纤维水解渣的热解特性分析

对木粉酸水解残渣(WAHR)和木糖渣(XR)两种木质纤维水解残渣进行了基本物性分析,采用热重分析仪和自制的管式高温裂解炉探讨了这两种水解残渣及其母料的热解特性.结果表明:两种水解残渣较其母料有更高的碳含量,且WAHR的碳含量比XR高;两种水解残渣的组成和热解特性存在较大差异;XR的气相产物和液相产物产率在整个研究温度区间均高于WAHR,并且H2、CO、CO2、CH4、C2H4和C2H6的产率随温度变化的规律不同;两种水解残渣的液相产物种类相似,但相对含量存在差别;半焦样品的CO2气化反应活性随温度的升高而降低;原料的木质素含量越高,所得半焦样品的反应活性越低.     

力竭运动前后大鼠脑皮质运动区递质性氨基酸含量的动态变化

通过观察脑递质性氨基酸的变化,进一步探索运动性疲劳的中枢机制,30只雄性SD大鼠进行了一次性力竭跑台运动,用高效液相色谱法检测了运动前后及恢复期：0．5h、1h、3h和24h大鼠脑皮质运动区Glu、Asp、GABA、Gly含量,结果发现：力竭运动后即刻Glu含量有所下降,GABA含量显著性上升至最高点;Gly含量在力竭运动后即刻、恢复0．5、1h均显著性高于安静值,恢复期0．5h达到最高点,同GABA含量变化相比具有时相差异性;Glu／GABA比值在恢复期有所增高,而Glu＋Asp／GABA＋Gly比值始终低于安静值。提示：大鼠脑皮质运动区Glu含量下降和GABA含量增高与运动中枢抑制过程有关;Gly对中枢机能的调控存在复杂的机制;观察大鼠脑中Glu＋Asp／GABA＋Gly比值,反映运动性疲劳时脑的机能状态,较Glu／GABA比值更有意义。     

高产木糖醇酵母菌的筛选鉴定及两级法发酵特性

从300多种土壤样品中进行筛选,最终得到10株可耐受300 g/L木糖的酵母菌株,且其木糖醇转化率超过64.0%.其中酵母菌株SB18在150 g/L木糖下的木糖醇转化率为68.5%,为相同条件下转化率最大的菌株,并经18SrDNA测序鉴定为热带假丝酵母.酶活测定结果显示SB18木糖还原酶主要依赖辅因子还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH),其酶活性远大于木糖醇脱氢酶活性.对SB18进行两级法发酵条件研究,确定补充氮源为尿素和酵母提取物,接种量为0.5 g/L,转速转换时间为36 h.在此条件下由250 g/L木糖摇瓶发酵252 h得到207.65 g/L木糖醇,转化率为83.1%,达到理论值的91.8%.本研究表明酵母菌SB18在高浓度木糖醇的工业生产中具有很大的应用潜力.