P38α对人血管内皮一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的影响

目的:研究P38α对人血管内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的影响.方法:利用硝酸还原酶法检测不同浓度氯化钴作用下人脐静脉血管内皮细胞-12(HUVEC-12)上清中的一氧化氮(NO)的含量.以pRL-TK为内参照,将已经构建好的pGL2-eNOS-p质粒分别与pGL3-BASIC、pcDNA3、p38a、及p38a(AF)共转染HUVEC-12细胞,利用双荧光素酶报告基因技术检测eNOS基因启动子转录活性,并在共转染的基础上加氯化钴刺激,并检测eNOS基因启动子转录活性.结果:氯化钴刺激下HUVEC-12细胞培养上清的NO含量随氯化钴作用浓度增加而提高,成功建立化学缺氧模型;p38a在正常和缺氧条件下均明显降低eNOS基因启动子的活性,可被无活性诱变体p38a(AF)逆转.结论:P38et下调人血eNOS基因启动子转录活性.     

氯化钴对人eNOS基因启动子转录活性的影响

目的:建立氯化钴诱导的人脐静脉血管内皮细胞-12(HUVEC-12)缺氧模型,研究人血管内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)基因的启动子活性变化.方法:用含不同浓度氯化钴的培养基培养细胞,检测细胞培养上清中的乳酸脱氢酶(LDH)含量;将已构建的pGL2-eNOS-p质粒转染HUVEC-12细胞,利用双荧光素酶报告基因技术检测在不同浓度氯化钴和不同作用时间下的eNOS启动子转录活性.结果:氯化钴刺激下HUVEC-12细胞培养上清的LDH含量随氯化钴作用浓度增加而提高;氯化钴刺激后转染细胞的eNOS启动子活性呈现随氯化钴剂量增加而升高的趋势,随作用时间的延长而上升的趋势.结论:成功建立氯化钴诱导HUVEC-12细胞缺氧的体外模型.     

p38丝裂原活化蛋白激酶在小鼠T细胞增殖中的作用

目的:了解p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在ConA刺激下小鼠T细胞增殖中的作用。方法:以活体染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯染色,建立了在多克隆刺激剂刀豆蛋白A(ConA)刺激下评价小鼠T细胞增殖的模型,通过流式细胞术分析p38丝裂原活化蛋白激酶的特异性抑制剂SB203580在不同剂量、不同时间对T细胞增殖的作用,并应用CellQuest和SPSS10.0 forW indows软件分析增殖细胞各代所占比例和增殖指数(PI)。结果:羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯染色分析显示,随着SB203580浓度从0.5μmol/L逐渐增至15.0μmol/L,T细胞增殖逐渐减弱,以15.0μmol/L SB203580的抑制作用最为明显,呈剂量依赖关系(r=-0.97,P<0.01);SB203580浓度增加至20.0μmol/L时,细胞大量死亡。选用SB203580最佳浓度(15.0μmol/L),随时间从24 h至72 h递增,SB203580对T细胞增殖的抑制作用逐渐增强,以72 h抑制作用最为明显,84~96 h后,抑制作用逐渐减弱。结论:p38 MAPK在ConA刺激的T细胞增殖中起着重要的作用。     

p38丝裂原活化蛋白激酶和核因子-κB促进创面血管化的机制探讨

目的:探讨p38丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路和核因子-κB(NF-κB)/抑制因子(IκB)通路在调控血管内皮细胞生长因子(VEGF)产生及血管化等方面的作用及其相互关系.方法:将32只Wistar大鼠完全随机分为4组各8只:假烫组、烫伤组、烫伤+p38MAPK抑制剂组和烫伤+NF-κB抑制剂组.除假烫组以外,其余各组均制作深Ⅱ°烫伤模型,其中烫伤+p38MAPK抑制剂组和烫伤+NF-κB抑制剂组于烫伤后15 min和12 h分别静脉注射SB203580和PDTC;各组大鼠均于伤后48 h处死并取材.酶联免疫吸附法(ELISA)测定创面组织中VEGF的含量和血管微密度(MVD),蛋白印迹(Western blotting)法检测p38MAPK和IκBα的表达.结果:和假烫组相比,伤后48 h,烫伤组创面组织中VEGF的质量浓度明显上升,为(0.81±0.19)ng/m L和(2.88±0.32)ng/m L,(P0.05);MVD值明显增加,为(3.12±0.72)和(8.08±2.10),(P0.05);p38 MAPK含量升高,为(966±176)和(4778±332),(P0.05);IκBα含量下降,为(2 327±310)和(1 278±149),(P0.05).使用SB203580和PDTC均能抑制烧伤后创面组织中VEGF含量的上升和血管化.预先给予SB203580能抑制烧伤后创面组织中p38MAPK含量升高,但对IκBα含量无显著影响;预先给予PDTC可以防止烧伤后创面组织中IκBα含量的下降,而对p38MAPK表达无影响.结论:在烧伤后创面愈合过程中,p38 MAPK信号转导通路和NF-κB/IκB通路是两个平行和独立的信号转导通路,两者间无直接的联系,但共同调节着烧伤后VEGF的产生与创面血管化.