溶菌酶结晶的研究进展

溶菌酶作为一种重要的模型蛋白被广泛应用于蛋白质结晶机理和方法的研究.概括了溶菌酶的结构、性质及应用,总结了溶菌酶的常用结晶方法,探讨了近年出现的新的结晶方法,介绍了结晶条件、结晶机理及主要的观测方法,展望了溶菌酶结晶过程的发展前景.     

PDMS-玻璃微流控芯片上HepG2细胞培养条件研究

对聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)-玻璃微流控芯片上HepG2细胞的培养条件进行了优化研究,包括细胞附着表面的修饰、细胞接种密度、培养基血清浓度以及更换频率4个方面,并与传统的孔板细胞培养进行了对比。研究结果表明,纤连蛋白(Fibronectin,FN)比聚赖氨酸(Polylysine,PLL)、胶原蛋白(Collagen)具有更好的促细胞附着生长能力,1.0×106～2.0×106个/ml为芯片上适宜的细胞接种密度,提高培养基中血清体积分数到20%有利于芯片上细胞的生长,芯片上细胞培养基更换时间间隔应控制在8～16 h之内;经过优化后,芯片上HepG2细胞呈现出与传统孔板中HepG2细胞相同的增殖趋势、增殖率。     

微流控芯片化学发光检测色氨酸

近年来,微流控芯片化学发光检测作为一种新型联用分析技术,发展非常迅速[1～3].以鲁米诺作为衍生试剂,戊二醛作交联剂,建立了微流控芯片化学发光检测色氨酸的新方法.优化了电泳分离条件(缓冲溶液种类、进样时间及分离电压)、化学发光检测条件(H2O2的浓度、K3Fe(CN)6的浓度及NaOH的浓度)和衍生反应条件.     

神舟八号飞船空间蛋白质结晶实验

 利用德国空间生物实验装置和自主研制的结晶室,在中国神舟八号飞船上进行了14种蛋白质的结晶实验,实验持续16.5d;同时使用相同结晶室在地面开展比对实验.结果表明：12种蛋白质在空间析出晶体,地面有11种;空间析出的6种蛋白质晶体可用于X-射线衍射实验,收得4种晶体的8套同步辐射衍射数据;地面有5种蛋白质晶体可用于X-射线衍射,收得3种晶体的5套同步辐射衍射数据,其中1套不完整.鸡蛋清溶菌酶空间晶体的初步衍射最高分辨率为1.16Å,地面晶体的为1.23Å.痢疾杆菌二磷酸四腺苷空间晶体初步衍射最高分辨率为1.75Å,地面晶体的为1.49Å,但是1颗空间晶体的晶型发生改变.衣原体蛋白酶样活化因子空间晶体的初步衍射最高分辨率为2.31Å,地面晶体未得到衍射数据.加拿大的17β-羟化类固醇脱氢酶复合物空间晶体的初步衍射最高分辨率为2.30Å,地面晶体未得到完整衍射数据.自主研制的结晶室的浸入式毛细管结构为国际上首次采用,具有无源和通用的优点,对汽相扩散结晶法具有良好的自然对流抑制效果.     

基于物理性质捕获循环肿瘤细胞的微流控芯片

为满足利用微流控技术实现芯片上循环肿瘤细胞捕获日益增长的需求,研制出基于肿瘤细胞尺寸和变形性进行分离的微流控芯片。基于细胞尺寸和变形性差异原理设计芯片,利用半导体加工技术制备出以玻璃和聚二甲基硅氧烷(PDMS)为材料的微流控芯片,使用8μm间隔的微柱作为捕获单元,应用于乳腺癌细胞系MCF-7肿瘤细胞的捕获;并以MCF-7细胞为模型,考查了芯片的分选条件和分选效果。在1 mL/h流速下,MCF-7细胞捕获率可达到68%;多次实验结果表明该芯片捕获的最佳流速为1 mL/h。Calcein-AM和Hoechst对MCF-7细胞进行染色,可方便对捕获后细胞进行识别和拍照。结果基于细胞尺寸和变形性原理所设计的捕获循环肿瘤细胞微流控芯片操作简单、成本低、通量高,有望逐步用于临床循环肿瘤细胞检测。     

胚胎单个定位及三维共培养微流控装置的构建

胚胎体外发育是临床人工辅助生殖技术中的关键环节,对着床后胚胎发育状况有重要作用。该研究利用细胞三维培养技术和微流控芯片技术构建了一种新型的小鼠胚胎体外共培养装置,用于实现自动化的小鼠胚胎定位与共培养操作,并对胚胎在体内的发育环境进行模拟。利用该微流控装置成功进行了小鼠胚胎的单个定位、三维细胞共培养以及发育追踪观察,并对装置中胚胎发育状况做出评价。统计结果表明:共培养芯片中小鼠胚胎发育囊胚率(87.3%±3.1%)显著高于对照组的囊胚率(76.8%±2.7%,P0.01);并且共培养芯片中小鼠囊胚的平均细胞总数(102±4)也显著高于对照组中的平均细胞总数(68±3,P0.01)。因此该胚胎共培养微流控芯片有助于在体外实现自动化的胚胎定位和培养过程,并且对小鼠胚胎发育具有更好的促进作用。     

利用光谱技术定量研究蛋清溶菌酶结构与功能关系

通过对蛋清溶菌酶(hen egg white lysozyme,HEWL)热处理过程中圆二色谱(CD)和紫外差谱(UV diff.)信号测定,利用蛋白质去折叠二态转变模型,对CD和UV diff.信号进行最小二乘法非线性拟合,定量获取蛋白质稳定性热力学数据.实验结果表明:随pH下降,蛋白质构象稳定性降低.功能性质分析发现:随pH下降,HEWL的酶活性降低,但表面活性(乳化性和乳化稳定性)升高.进一步,将蛋白质构象稳定性(ΔG_(25℃,water))数据和酶活性、乳化性和乳化稳定性数据进行相关性分析发现:蛋白构象稳定性与酶活性、乳化活性和乳化稳定性呈较好的相关性.这些结果说明:蛋白质构象稳定性降低引起蛋白质柔性增加,使其铺展到油水两相界面能力提高.该研究为从分子水平定量研究食品蛋白结构和功能关系奠定了基础.     

降膜结晶分离提纯对二甲苯

降膜结晶是一种重要的对二甲苯提纯方式。以含有75%(质量分数)对二甲苯的混二甲苯为原料,研究降膜结晶分离提纯对二甲苯过程,考察挂膜、进料速率、预冷温度、结晶温度、降温速率等工艺条件对结晶过程的影响,以及发汗终温、升温速率对发汗过程的影响。研究结果表明:当结晶条件为挂膜、进料线性喷淋密度360.53 mL/(m·min)、预冷温度25℃、结晶温度15℃、降温速率0.15℃/min时,以及发汗条件为升温速率1℃/min、发汗终温10℃时,可获得纯度高于99.50%的对二甲苯产品。     

铵光卤石过饱和溶液低温结晶动力学研究

研究了10℃、20℃铵光卤石过饱和溶液的结晶动力学规律.利用10℃、20℃的溶解度和动力学参数建立了铵光卤石结晶动力学方程.10℃、20℃结晶的动力学方程分别-dc/dt dc=0.045(3.276-c)~(4/3)(c-2.457),-dc/dt=0.028(4.736-c)~(4/3)(c-3.552),动力学方程证明铵光卤石的低温结晶受单核结晶生长控制.     

浮萍培养方法的筛选

在实验室条件下,以青萍为研究对象,比较了3种较为常见的室内浮萍培养方法——六孔板培养法,培养皿培养法,烧杯培养法.该研究采用序批式培养方式培养青萍,利用单种种群增长的Logistic模型对生物量的增长曲线进行了分析,同时测定了青萍的生物量、蛋白质含量、叶绿素含量、PSII最大光化学效率(F_v/F_m)等生理指标.结果表明:(1)青萍的生物量随时间变化的增长曲线呈典型的"S"型,在特定的环境和营养条件下,单位面积上青萍生物量的增长受密度的制约.其中,烧杯培养的青萍的r值和K值六孔板培养皿.(2)烧杯培养的青萍的F_v/F_m值六孔板培养皿.(3)烧杯培养的青萍叶绿素含量六孔板培养皿.(4)烧杯培养的青萍的蛋白质含量六孔板培养皿.因此烧杯培养法室内培养浮萍效果最好.上述培养方式的筛选为实验室条件下培养浮萍提供了可行方法.     

酶法水解大豆分离蛋白的研究

研究了大豆分离蛋白水解的最佳预处理条件.研究了不同微生物蛋白酶对大豆分离蛋白的水解效果,并筛选出效果最好的Alcalase蛋白酶进行正交试验.结果表明最佳工艺条件是:温度60℃,pH=8,w(S)=9%,w(E)/w(S)=4%,时间120min,水解度为0.2796.     

PMMA微流控芯片注射成型多目标优化实验研究

随着微流控技术的不断发展和聚合物材料的广泛应用,注射成型技术因其快速、低成本、大批量的生产等优势而成为聚合物微流控芯片成型制造的主要方式之一,但也存在微结构成型难、残余应力与宏观变形等问题。为表征聚合物微流控芯片成型能力、研究工艺参数对成型质量的影响,采用正交实验研究熔体温度、注射压力、注射速度、保压压力和保压时间对聚甲基丙烯酸酯(PMMA)微流控芯片微通道复制度、残余应力、宏观翘曲变形三种指标的影响规律,并利用灰色关联分析法对三种指标进行多目标优化得到最优工艺参数。研究结果表明：影响微通道复制度最主要的因素是注射速度和熔体温度,影响残余应力与翘曲变形最主要的因素是熔体温度;利用正交实验对三种指标优化得到的最优参数存在差异,而利用灰色关联分析方法进行多目标优化得到了微通道复制度高、残余应力小和翘曲变形小的高质量芯片。最优注射成型工艺参数如下：熔体温度为245℃、注射压力为160 MPa、注射速度为50 cm³/s、保压压力为70 MPa和保压时间为5 s。     

深海芽孢杆菌Bacillus sp. LM-24对结晶紫的吸附研究

利用深海微生物中筛选出的对结晶紫具有优势吸附能力的菌株Bacillus sp. LM-24从废水中分离结晶紫。采用单因素实验优化其反应条件，选用无机载体硅胶和有机载体树脂对其进行固定，分析无机盐对吸附作用的影响及其吸附动力学与吸附等温线。结果表明游离菌株在最适吸附剂浓度1.216 g/L、pH=9.0、温度30℃时，反应10 min对30 mg/L结晶紫去除率可达86%;在不同pH和浓度时，固定化微生物吸附作用较游离微生物更加稳定。动力学测定显示3种吸附剂均存在物理和化学吸附，等温线测定显示游离菌株和硅胶固定化菌株与Langmuir模型拟合度更高，而大孔树脂固定化菌株与Freundlich拟合度更高。Bacillus sp. LM-24对结晶紫具有快速且高效的吸附作用，且固定化技术能有效提高其对外界环境的稳定性，可作为结晶紫染料脱色的潜力开发菌株。     

微流控芯片上全自动单细胞电动操控技术

发明了一种基于尺寸差异的单细胞全自动操控微流控芯片装置,可全自动检测细胞的大小,并对目标细胞进行全自动的电动操控。本装置主要由微流控芯片、差分放大器、继电器、数据采集卡以及计算机等组成。当细胞通过微流控芯片的电阻脉冲检测(RPS)的检测区时,会产生一个一定幅值的脉冲信号,计算机会根据设定的信号幅值自动识别出目标细胞,并控制继电器的通断电,继电器通电后,继电器所在通道内会产生电渗流,从而将目标细胞输运至该收集通道。系统具有全自动操控和分选精度高等突出优点,非常适合于操控样品中少量的目标细胞,如循环肿瘤细胞等。     

纳他霉素浸提和结晶工艺的研究

通过优化纳他霉素浸提和结晶工艺,提高提取收率,提升产品质量。结果表明:浸提最佳条件是浸提温度为20℃、溶媒的添加量为4倍量(v/m)、浸提的时间为2 h,浸提得率可达到92%;结晶的最佳条件是搅拌频率10 Hz,结晶温度30℃,加水倍数为1.5倍(v/v),加水的时间控制在1.5 h,结晶得率可达到87.7%。     

~(13)C_6-酪氨酸标记的蛋清溶菌酶的表达及NMR测定

针对蛋白质核磁共振(NMR)信号复杂难以解析的问题,选用选择性标记方法可简化蛋白质NMR谱图.本实验以蛋清溶菌酶(HEL)为目标蛋白,构建了p ET-HEL蛋白表达载体,转入到大肠杆菌Ε. coli BL21(DE3)中,得到重组菌株.然后通过改变诱导温度、诱导浓度以及诱导时间等条件来优化HEL在大肠杆菌Ε. coli BL21(DE3)中的表达条件,通过SDS-PAGE电泳分析,确定了最佳表达条件:37℃、0. 4 mmol/L IPTG诱导8 h.按最佳条件于诱导前加入13C6-酪氨酸进行选择性标记,扩大表达,经过变复性处理与Ni柱纯化后,获得选择性标记的HEL.进一步制备标记蛋白核磁样品进行测定,得到简化的NMR谱.本研究为采用NMR简化分析蛋白质的结构奠定了基础.     

酶法制备玉米胚芽蛋白饮料基料的工艺研究

本文以干法玉米胚芽为原料，对酶法制备玉米胚芽蛋白饮料基料的工艺条件进行了研究。结果表明，Alalase蛋白酶能显著提高玉米胚芽蛋白质及其水解物提取率，提取的较优工艺条件是：料液比1：6，碱性蛋白酶加量0．2％(蛋白质)，pH7．0，浸提温度60℃，浸提时间5h。     

一种溶菌酶的提取方法

溶菌酶是一种用途较为广泛的生化物质,强碱性蛋白酶,等电点高,分子量低。由于能催化格兰氏阳性细菌细胞壁粘多糖的水解,因而在医学上是一种有效的抗菌剂。鸡蛋的蛋清中含有丰富的上述物质,本文以鸡蛋清为原料,用一种简单方法提取溶菌酶。一、提取原理溶菌酶是一种强碱性蛋白,与氯化物、碘化物及碳酸盐等容易形成结晶盐。在蛋清中加入一定量的上述化合物,并调节溶液的PH值到其等电点(PH=10.5),在     

pH渐变条件下双酶协同水解大豆蛋白

研究了在没有外加碱的pH渐变条件下．用枯草杆菌碱性蛋白酶(Alcalase 2．4L,酶活力2．4AU/g)和黑曲霉酸性蛋白酶(酶活力3000u／g)双酶协同水解从大豆蛋白制备寡肽(10个氨基酸以下的肽)水解物的可行性．考察了单酶单因素水解条件、双酶加入方式对大豆蛋白降解率和蛋白质水解度的影响,并在此基础上通过正交试验进一步优化出双酶一次性投料方案下水解大豆蛋白的最佳条件：水解温度为60℃．碱性蛋白酶加入量为每g蛋白15μL,酸性蛋白酶加入量为6％,底物浓度为40g／L,水解时间为18h．在上述最佳条件下,大豆蛋白的降解率可达76％,蛋白质的水解度可达26％,水解物中相对分子质量小于1350的寡肽达到了66％．结果表明,在不外加碱的条件下,采用双酶协同水解方法能够显著提高大豆蛋白降解率以及蛋白质水解度．     

牛胰核糖核酸酶结晶的制备

牛胰核糖核酸酶(E.C 2.7.7.16)首先由Kunitz用硫酸铵分级盐析的方法获得结晶,然而在多次重结晶后仍含有微量蛋白水解酶的活性。McDonald利用加热的方法除去这些掺杂的蛋白质后,得到了无蛋白水解酶活力的纯牛胰核糖核酸酶结晶。随后,Hirs等将结晶RNase在IRC-50(XE-64)的树脂上层析分离,分出A及B二个组分,比例为10:1。Taborsky将结晶RNase在CM-纤维素上层析,得到一个主峰和三个小峰,都具有酶活力,主峰相当于RNase A。