拟南芥profilin2启动子5′端缺失对维管束特异表达的影响

用 ＰＣＲ法扩增并克隆了 ｐｒｏｆｉｌｉｎ２全长启动子（１６６７ ｂｐ）,经 ５’端不同长度缺失,与 ｇｕｓ（ｕｉｄＡ）基因连接,构建植物表达载体,转化伽蓝菜,证实在转基因植株中全长启动子Ｐｆｎ１．７呈维管束特异表达．５’端缺失分析显示,可将该启动子分为 ３个区段：区段 １,－１６６７—１３８０ ｂｐ,缺失该区段后 ｇｕｓ基因由维管束特异表达变为组成型表达,推测在该区段中存在维管束特异表达元件;区段 ２,－１１５３～－５９７ ｂｐ,强烈抑制 ｇｕｓ基因的表达;区段 ３,－５９７～－１ｂｐ,可认为是ｐｒｏｆｉｌｉｎ２的基本启动子．     

胚乳特异sbeⅡa启动子在小麦中的评价及特性分析

淀粉的合成是一个复杂的生化过程. sbeⅡa基因是淀粉合成过程中的关键酶基因之一, 在小麦籽粒成熟过程中对淀粉, 尤其对支链淀粉的生物合成调控起重要作用. 为了解sbeⅡa基因的调控机理及其胚乳特异表达特性, 利用APCR方法克隆了sbeⅡa启动子3094 bp片段, 并对该片段进行测序, 同时利用GUS瞬间表达体系对sbeⅡa启动子序列进行不同片段的功能缺失研究. 研究结果表明, 3094 bp序列(存在于sbe.g融合体中)具有稳定的启动子活性, 而5′或3′缺失体的启动子活性明显降低. 在sbeⅡa启动子中间缺失体中, 一些缺失体仅有微弱活性, 但sbe.e在缺失–1579~–1210 bp片段情况下, 却具有比sbe.g(含启动子全长序列)还要高的启动子活性. 研究初步证明, 一些固定序列(motifs), 如 –300 bp因子、G盒以及醇溶蛋白盒(Prolamin box)等作为正调控因子在决定启动子胚乳特异表达模式中是必需的, 而且在–1579~–1210 bp片段中也存在一些负调控因子或固定序列. 在瞬间表达检测体系中, 小麦胚乳组织年龄对检测结果有着重要影响.     

牛泡沫病毒内部启动子上顺式作用元件具有增强子特性

以牛泡沫病毒（bovine foamy virus,BFV)中国毒株BFV3026为材料，研究env基因内部启动子（internal promoter,IP)上顺式作用元件的功能特点，用PCT方法进行系列缺失，将IP中BFV反式激活因子Tas 应答元件（TRE^IP）精确定位于TATA盒近上游的72bp区段中（9205－9276）。发现此段可激活同源及异源启动子，具有典型增强子特性；此区段与已知SFV－1 TRE^IP近启动子区和SFV－3TRE^IP近启动子区和SFV－3TRE^IP序列同源性高，都具有核因子NF－1（nuclear factor1）的结合位点, 位置相同，推测此类顺式作用元件具有相似功能特点。     

利用修饰的T7 RNA聚合酶基因建立一种植物耦联表达系统

通过基因修饰，在T7RNA聚合酶基因的5′端添加了SV40大T抗原的核定位信号编码序列，利用CaMV35S启动子和修饰的T7RNA聚合酶基因构建了植物表达载体pBBT7。同时，利用T7启动子和β－葡糖醛酸酶基因（gusA）构建了另一个植物表达载体pBTG。通过农杆菌介导法将上述两个植物表达载体共转化烟草，共转化植株表现出较强的β－葡糖醛酸酶基因（β－glucuronidase，GUS）活性，上述结果表明T7RNA聚合酶－T7启动子耦联表达系统在植物中是有效的，说明已成功构建了一种植物耦联表达系统。     

一个编码玉米转译起始因子新基因的克隆

采用DD PCR方法比较玉米杂种一代及其亲本苗期基因表达产物mRNA的差异 ,分离并鉴定出一个玉米杂种一代超亲表达的cDNA .以该cDNA为探针从cDNA文库中筛选到一个全长的cDNA克隆 (ZH0 1) .ZH0 1长 1780bp ,5′端非编码区 112bp ,3′端非编码区 395bp ,开放阅读框共编码 4 14个氨基酸 .序列同源比较表明 ,ZH0 1为一个亲的玉米转译起始因子eIF4A基因家族成员 .     

果实专一性启动子驱动ipt基因在番茄中的表达及其对番茄果实发育的影响

用PCR方法获得了番茄果实性启动子（2A12）和农杆菌（C58）Ti质粒上的ipt基因。分别构建由2A12驱动下的gus和ipt基因的植物表达载体，并使中嵌合基因经农杆菌介导转入番茄品种“中蔬4号”的基因组中，GUS组织化学活性分析表明，2A12启动子具有严格的果实表达专一性。2A12驱动ipt基因在番茄中表达，使得果实中细胞分裂素的含量增加，最终导致果实中种子发育的停滞和胎座组织的增厚，并形成无籽番茄果实，同时转基因番茄果实成熟进程受阻且果实采用的储藏保鲜时间延长了1－2周，进一步分析发现，转基因番茄坐果率和产量均有不同程度的增加，虽然可溶性糖含量略有降低，但果实中干物质和粗蛋白含量有所增高。     

中国小麦花叶病毒RNA2外壳蛋白通读区及19 ku 富半胱氨酸基因的克隆、表达及其编码蛋白定位表达及其编码蛋白定位

应用RT－PCR扩增中国小麦花叶病毒（CWMV）外壳蛋白通读区（readthrough，RT）5′端（RTn）和3′端（RTc）及19ku的富含半胱氨酸蛋白基因，分别克隆并在E.coli中表达，表达蛋白粗提纯后免疫小鼠，制备相应的抗血清和单克隆抗体，用各种抗体检测小麦病叶汁液中RTn,RTc和19ku蛋白。结果表明，RTn和RTc分布在病叶细胞中的CWMV病毒粒子表面，而19ku蛋白则均匀分布于细胞质中。     

山羊 β-酪蛋白基因启动区指导人血清白蛋白在转基因小鼠乳汁中的高效表达

构建了包含山羊β－酪蛋白基因启动区５′端上游调控序列和外显子１,２及内含子１在内的乳腺表达载体,并与人血清白蛋白（ｈＡＬＢ）小基因（含全长ｃＤＮＡ序列及其内含子１）构建成融合基因,鼠尾静脉注射实验表明,该融合基因能在小鼠乳腺中特异表达,应用显微注射方法交该融合基因导入小鼠受精卵,并将受精卵移植于假孕母鼠,共获得３３只Ｆ０代小鼠,经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交证实,有８只小鼠基因组中整合有ｈＡＬ     

豌豆EF-1α的cDNA克隆、全序列及结构特征分析

以赤霉素 (GA)处理后的G2豌豆为材料 ,构建了一个 2 .0× 1 0 6的cDNA文库 ,用随机筛选法从该文库中得到一个 1 6 6 7bp的cDNA ,其 5′端非编码区长 1 0 0bp ,3′端非编码区长 2 2 3bp ,拥有一个 1 34 4bp的开放读码框 ,共编码 447个氨基酸 .DNA及报道的蛋白质序列同源性分析表明 ,它编码了豌豆延伸因子 1α(elongationfactor 1 alpha ,EF 1α) ,其功能区段具有很高的保守性 ,可应用于分子进化研究     

拟南芥动蛋白基因AtKP1的克隆、表达及生物化学特性分析

动蛋白(kinesin)种类很多, 在真核细胞中行使多种功能. 利用3′-RACE 技术从拟南芥中克隆了动蛋白-14B 亚家族中的一个成员, 命名为AtKP1 (拟南芥动蛋白1). 其最大可读框为3.3 kb, 编码1087个氨基酸. 结构域分析表明,AtKP1多肽链中部有一个马达结构域, 氨基端有一个CH结构域, 羧基端一个含有202个氨基酸残基的序列表现出很强的特异性. Northern印迹表明, AtKP1基因在各种器官中广泛表达, 但在幼苗中表达量最大. 将克隆的长度为2808 bp的AtKP1启动子区域与GUS 基因进行了融合, 转基因分析显示, AtKP1主要在幼嫩器官维管束和幼叶表皮毛中表达, 表明AtKP1可能参与了维管束和叶表皮毛的分化或发育. 对AtKP1的马达结构域进行了原核表达和亲和纯化, 生物化学特性研究表明这个马达结构域可以核苷酸依赖的方式与微管结合, 且具有微管激活的ATP酶活性.     

根特异性表达顺式激活序列在转基因烟草中的功能分析

高等植物基因在各组织中的特异性表达需通过组织特异性启动子的调控。根是植物体的重要器官，其特异性基因的表达和调控对研究植物的生长和发育具有重要意义。通过对烟草根特异性表达基因TobRB7启动子的分析，成功分离了包含顺式激活序列 的不同长度的片段RSF1和RSF2。将RSF1和RSF2以不同方向与含有GUS编码基因的表达型载体进行重组后，以农杆菌介导转化烟草获得相应 的转基因植株。在对转基因烟草的GUS表达特性进行组织化学鉴定和荧光定量分析后发现，TobRB7启动子具有双向启动子功能，并均表现出根组织特异性。结果表明，在－823至＋70bp区域存在正反不同方向的根组织特异性调控元件，该启动子片段在反向插入和较短区域内有较强的根组织特异性表达调控功能。     

几个重组蛇毒金属蛋白酶的表达、重折叠及其生物学活性

皖南尖吻蝮蛇毒出血金属蛋白酶acutolysin A除了具有引起动物皮下出血的活性外, 还具有降解纤维蛋白原和纤黏连蛋白的活性. 将acutolysin A以及非出血金属蛋白酶BR的cDNA分别克隆到原核表达载体pET-22b中, 并在大肠杆菌中以包涵体的形式表达了这两个重组蛇毒金属蛋白酶, 即A-22b和BR-22b. 经变性和复性处理后, A-22b具有明显的出血活性, 但没有对纤维蛋白原和纤黏连蛋白的水解活性; 而BR-22b没有出血活性, 却具有降解纤维蛋白原的活性. 此外, 通过PCR方法构建了两个嵌合体基因C1和C2. C1是由BR基因的5′端330 bp和acutolysin A的3′端285 bp构成的嵌合体基因; C2是由acutolysin A基因的5′端324 bp和BR的3′端336 bp构成的嵌合体基因. 将它们克隆进表达载体pET-22b中得到两个表达质粒, 即pC1-22b和pC2-22b. 并以包涵体的形式表达了相应的两个重组蛋白, 即C1-22b和C2-22b. 经同样的变性和复性处理后, C1-22b与BR-22b类似, 具有较强的纤维蛋白原水解活性, 但没有出血活性. 与A-22b相似, C2-22b具有出血活性但没有对这些蛋白的水解活性. 这些结果暗示, 蛇毒金属蛋白酶的N端主亚结构域在出血活性上很可能起关键作用并极大地影响酶对底物的选择性.     

春化相关基因ver203FcDNA3′末端的克隆及序列分析

以差异筛选技术克隆到的春化相关基因cDNAverc2 0 3为基础 ,设计 5′端引物 ,利用RACE克隆策略 ,通过RT PCR扩增得到cDNA的 3′未端序列ver2 0 3F(1197bp) .Northernblot分析表明其全长约为 2 .0kb ,且其表达具有春化处理的特异性 .检索表明该基因序列(AB0 12 10 3)与一大麦茉莉酸诱导基因有部分同源性 .推测该基因在调控开花过程中可能参与茉莉酸介导的信号传导途径 .     

豌豆乙酰羟酸还原异构酶基因的cDNA克隆及其表达

用cDNA差示分析法从G2豌豆总RNA中筛选到一个GA3特异诱导表达的基因片段,用该片段作探针进一步筛选G2豌豆cDNA文库,得到一个全长2036bp的cDNA序列。经分析,该cDNA含有一个1746bp的可读框,编码的蛋白质含有581个氨基酸,理论分子量为64ku,cDNA及推导的氨基酸序列分别与不同来源的乙酰羟酸还原异构酶相应序列有较高的同源性。将该基因转入表达载体中并在大肠杆菌中表达,获得了具有显著酶活性的外源蛋白。     

山羊β-酪蛋白基因启动区指导人血清白蛋白在转基因小鼠乳汁中的高效表达

构建了包含山羊β-酪蛋白基因启动区5′端上游调控序列和外显子1, 2及内含子1在内的乳腺表达载体, 并与人血清白蛋白(hALB)小基因(含全长cDNA序列及其内含子1)构建成融合基因. 鼠尾静脉注射实验表明, 该融合基因能在小鼠乳腺中特异表达. 应用显微注射方法将该融合基因导入小鼠受精卵, 并将受精卵移植于假孕母鼠, 共获得33只F0代小鼠, 经PCR和Southern印迹杂交证实, 有8只小鼠(5♀, 3 ♂ )基因组中整合有hALB基因, 整合率为24.2%(8/33). Western blot分析表明, 在5只雌性整合小鼠中有3只表达了hALB蛋白, 放射免疫法测定其乳汁中hALB含量分别为3.54, 0.21和3.03 g/L.     

白芷细胞外ECBP21全长cDNA克隆

ECBP21是从白芷悬浮培养细胞外检测并纯化的一种依赖钙的钙调素结合蛋白。利用RT－PCR和5‘-RACE方法，获得其cDNA全长。ECBP21 cDNA全长947bp，编码216个氨基酸，其中N端1－25氨基酸为信号肽，26－216氨基酸为成熟蛋白肽段，而且26－45氨基酸序列与纯化ECBP21N末端测序结果完全一致。将此cDNA成熟蛋白编码区核苷酸片段导入pET-28b( )表达载体中，并在大肠杆菌表达系统中诱导表达，经CaM-Gel overlay检测证实表达蛋白具有Ca^2 依赖的钙调素结合特征，从而进一步证实了cDNA克隆的正确性。这为进一步用分子生物学方法研究植物细胞外多肽ECBP21的生物学功能奠定了基础。     

水稻bZIP蛋白REB与水稻中sbe1和waxy基因5′上游区的相互作用

水稻淀粉分支酶（SBE1）和结合淀粉粒的淀粉合成酶（GBSS）分别负责水稻胚乳中支链淀粉与直链淀粉的合成,编码这两个酶的sbel和waxy基因主要都在胚乳中表达,在水稻sbel基因5′上游区中找到了一个能与水稻胚乳核蛋白结合的53bp片段C53,而且这种结合受到水稻waxy基因5′上游区的Ha-2片段竞争,进一步的实验证明水稻bZIP蛋白REB可以结合sbel基因中C53片段中的2个ACGT元件G－box和Hex,并且REB也能结合waxy基因中Ha-2片段的3个ACGT元件：WG1,WG2和WG3,其中WG1元件能强烈地竞争Hex元件与REB蛋白的结合,这提示水稻sbel基因与waxy基因在胚乳中的表达受到像REB这样的bZIP类转录因子的协同调控。     

一个新的人类硫氧化还原蛋白基因的克隆

根据不同发育阶段 ( 1 3,33周 )的人胎脑组织mRNA差异显示分析 (又称DDRT PCR)所得到的具有差异表达的EST的序列 ,设计引物筛选点阵排列的人胎脑cDNA文库 ,得到一个新的全长cDNA克隆 .这个克隆全长 1 2 0 8bp ,包含一个 889bp的开放阅读框 ,一个 1 32bp的 5′非翻译序列和一个 2 0 9bp的 3′非翻译序列以及典型的polyA加尾信号 .其推断的氨基酸序列与人硫氧化还原蛋白同源 ,而且含有硫氧化还原蛋白的保守的活性位点序列 .将它命名为人的类硫氧化还原蛋白基因 (humanthioredoxinlikegene ,hTRXL) .     

人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ型基因在黑曲霉中的表达

将人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ（sTNFRI)基因插入黑曲霉（A.niger)融合蛋白基因的表达质粒pIGF中,融合之处设计类胰蛋白酶（KEX2）加工位点,构建融合表达载体pHBC。以pHBC转化黑曲霉胞外蛋白酶缺失株A.niger3.795-1-23,通过Southern杂交鉴定阳性克隆。A.niger3.795-1-23重组菌株的蛋白电泳显示有特异表达带,Western blotting证实该分泌蛋白具有sTNFRI的免疫活性。