棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体功能基因及生物学性状分析

【目的】分析棉花黄萎病致病菌相关基因的功能揭示其中致病机制。【方法】通过ATMT法构建了大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)650个T-DNA插入突变体。利用hiTAIL-PCR技术获得17株T-DNA插入体侧翼基因序列,通过blast比对分析表明,其中16个基因序列编码酶或蛋白。【结果】突变体的生物学性状与野生型菌株Vd991相比,出现黄色菌丝型2株,中间菌丝型6株;部分突变体在生长速率(7株)、产孢量(14株)和粗毒素产量(4株)上都发生了具有统计学意义的变化(p0.05);致病力测定表明,9株突变体的致病力较野生型有所降低,在p0.05水平具有统计学意义。【结论】该研究为大丽轮枝菌致病基因的筛选和鉴定提供了理论基础。     

短小芽孢杆菌Y106对棉花黄萎病的防治作用

短小芽孢杆菌Y106(Bacillus pumilus Y106)是从土壤中筛选分离得到的一株对黄萎病菌具有拮抗作用的细菌菌株.平板对峙实验结果显示,Y106和黄萎病菌共同培养至10d时,处理组的黄萎病菌菌落直径为3.82cm,比对照组减小了38.7%,说明Y106菌株对棉花黄萎病菌有较强的拮抗作用;在液体PDA中共同培养Y106菌和带有绿色荧光蛋白基因标记的棉花黄萎病菌Vd-gfp77,随着Y106菌浓度增加,Vd-gfp77菌液在发射光波长为530nm处的荧光吸收值从217.43下降至97.49,说明黄萎病菌液浓度减小,黄萎病菌的生长受到抑制.土壤中拮抗实验结果显示,对照组长出菌落数目约为79个,处理组长出菌落数目随着Y106浓度的增加而减少至44个,比对照组菌落数目减少44.3%,表明在土壤中Y106菌株对棉花黄萎病菌的增殖有抑制作用.进一步的实验表明,Y106菌株可使盆栽棉花黄萎病发病率从76.47%下降至52.94%.因此,短小芽孢杆菌Y106对棉花黄萎病菌有较强的抑制作用,可用于棉花黄萎病的生物防治.     

大丽轮枝菌淀粉酶VdAmy-1的致病功能

大丽轮枝菌是引起棉花黄萎病的病原菌,其分泌蛋白是侵染寄主的主要作用因子.然而目前尚不清楚分泌型淀粉酶在大丽轮枝菌致病过程中发挥的作用.该研究使用BLASTp搜索到大丽轮枝菌淀粉酶VdAmy-1,进而对其功能进行了初步研究.酵母信号肽捕获系统表明VdAmy-1的N端信号肽具有引导蛋白分泌的功能.进一步构建大丽轮枝菌VdA...     

棉花黄萎病拮抗菌的筛选及抑菌谱测定

采用稀释平板法,从健康棉花根部土壤中分离得到细菌、放线菌及真菌分离物1723个。通过室内平板筛选获得25株对棉花黄萎病菌具有强拮抗作用的细菌菌株。温室盆栽防治黄萎病实验结果表明：3株拮抗细菌在防治棉花黄萎病中表现较好的防病效果,其中868菌株的防治效果为67.3%,3个拮抗细菌对病原真菌棉花枯萎菌、立枯丝核菌、番茄叶霉病菌、大豆黑斑病菌、大麦条纹病菌、大豆疫霉有较强的抑制作用,抑菌谱较广。     

棉花黄萎病菌酯酶同工酶的初步研究

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对大丽轮枝菌不同致病性、不同营养亲和群的11个菌系和黑白轮枝菌的2个菌系的酯酶同工酶进行了研究.结果表明,采用酯酶同工酶法可区分黑白轮枝菌与大丽轮枝菌,也可区分棉花黄萎病菌中的落叶型与非落叶型.     

棉花黄萎病菌 T-DNA 插入突变体功能基因及生物学性状分析

【目的】分析棉花黄萎病致病菌相关基因的功能揭示其中致病机制。【方法】通过 ATMT 法构建了大丽轮枝菌(Verticillium dahliae ) 650 个 T-DNA 插入突变体。利用 hiTAIL-PCR 技术获得 17 株 T-DNA 插入体侧翼基因序列,通过blast 比对分析表明,其中 16 个基因序列编码酶或蛋白。【结果】突变体的生物学性状与野生型菌株 Vd991 相比,出现黄色菌丝型 2 株,中间菌丝型 6 株;部分突变体在生长速率( 7 株)、产孢量( 14 株)和粗毒素产量( 4 株)上都发生了具有统计学意义的变化(p <0.05 );致病力测定表明, 9 株突变体的致病力较野生型有所降低,在 p <0.05 水平具有统计学意义。
     

不同抗性棉花品种PR基因响应大丽轮枝菌的表达分析

由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的棉花黄萎病每年给我国农业生产造成严重经济损失.为了明确不同抗性陆地棉(Gossypium hirsutum)品种中病程相关基因(GhPR基因)响应不同致病型大丽轮枝菌的表达差异,揭示GhPR基因在棉花与大丽轮枝菌互作过程中的免疫反应变化,本研究用寄主来源的棉...     

棉花黄萎病拮抗内生菌的筛选鉴定及抗菌物质研究

从棉株中分离筛选到一株对棉花黄萎病菌具有较强拮抗作用的内生细菌BSD-2.通过形态特征、生理生化特性以及16S rDNA碱基序列测定和同源性分析,鉴定其为枯草芽孢杆菌.平板对峙试验表明,BSD-2对多种植物病原真菌有抑制作用.BSD-2培养液以50 %硫酸铵沉淀所得的拮抗物粗提液,具有良好的热稳定性和酸碱稳定性,对胰蛋白酶、蛋白酶K和胃蛋白酶均不敏感,对氯仿敏感,能够有效抑制黄萎病菌孢子萌发.     

土木香内生细菌的分离鉴定及抑菌活性检测

利用组织分离法从用药植物土木香根、茎和叶中分离得到内生细菌32株.采用纸片法对菌株进行了抑菌活性研究,并运用生理生化与分子生物学方法进行种类鉴定.抑菌试验结果表明,10株内生菌发酵液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及禽多杀性巴氏杆菌均有不同程度的抑菌活性.鉴定结果表明,菌株YIR-5,YIR-7,YIR-8,YIR-9为假单胞菌属菌种,菌株YIR-3,YIR-6为沙雷氏菌,菌株YIR-4,YIS-1,YIS-2分别为水生拉恩氏菌、薄壁芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌,而菌株YIL-3归属于芽孢杆菌属.土木香内生细菌组成丰富,莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）YIS-1对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和禽多杀性巴氏杆菌的抑菌活性最强.     

放线菌LG-9发酵液对棉花黄萎病菌的抑菌活性及防效测定

为了研究放线菌LG-9发酵液对棉花黄萎病菌的抑菌作用,本文使用菌丝生长速率法、孢子萌发抑制法测定了放线菌LG-9发酵液对黄萎病菌菌丝生长、产孢量、孢子萌发和抗氧化功能的影响。结果表明,拮抗菌LG-9发酵粗提液5倍稀释液对棉花黄萎菌菌落生长抑制率最大,为76. 77%,产孢抑制率为84. 35%,孢子萌发抑制率为80. 00%;发酵粗提液5倍稀释液处理诱导棉花黄萎病菌抗氧化相关酶酶活降低和丙二醛(MDA)含量上升。田间试验结果表明,拮抗菌LG-9对棉花黄萎病的防治效果显著,培养滤液3次灌根处理,对棉花黄萎病的田间防效达到49. 07%。     

棉花黄萎病菌拮抗木霉的筛选及其抑菌机制的研究

从实验室保存的8株高产胞外细胞壁降解酶的木霉菌株中筛选到一株对棉花黄萎病茵具有强烈抑制作用的木霉菌株SMF5．对其作用机制的研究表明,SMF5对棉花黄萎病茵的作用机制包括生境竞争、产生耐热代谢产物、产生细胞壁降解酶等．     

利用拮抗细菌防治棉花黄萎病

本项目研究中,从植物根围、根表和植物内部分离到1345株细菌,并测定了他们对棉花黄萎病菌的抑菌性。118株细菌表现较强的抑菌性,抑菌率≥50％。其中25个菌株的抑菌率≥。70％,93个菌株的抑菌率为50％～70％。另外从棉花黄萎菌的微菌核际分离到57株细菌,其中30株细菌能显著地抑制棉花黄萎菌微菌核的菌落生长(5个菌株完全抑制微菌核的萌发和生长,15菌株的抑菌率为40％～97％)。这些拮抗菌的培养滤液也能抑制棉花黄萎菌的生长。室内盆栽实验证明,应用拮抗菌处理棉花种子,有10个拮抗细菌能极显著地防治棉花黄萎病,其中4个菌株(ICB-18、NCD-2、CS-25和CS--27)的防病效果极好,防病效果为72．3％～81．4％,3个菌株(C-94、C-28和NCD-25)的防病效果为55．7％～61．9％。1999～2000年的2年田间小区试验中。NCD-2菌株对棉花黄萎病防治效果显著,并且显著优于国外商品化生防制剂TF,该菌株连续两年的防病效果平均为85．4％;另外4个菌株(ICB-18、CS-25、C-94和C-28)亦能显著防治棉花黄萎病,但防病效果与国外商品化生防制剂TF相当。在田间示范中,应用生防细菌NCD-2制剂拌种后直接播种技术防治棉花黄萎病,防病效果达到51．2％。同时应用生防细菌NCD-2制剂拌种育苗移栽技术防治棉花黄萎病,防病效果达到52．6％并且增产22．85％。本文同时测定了NCD-2对主要大田作物的安全性,证明其对小麦、玉米、棉花、马铃薯、黄瓜、茄子和大豆等7种作物没有致病性,并且对这些作物的出苗、生长和发育没有不良影响。     

棉花黄萎病毒素在早期抗病性检测中的应用研究

用棉花黄萎病（Ｖ．ｄａｈｌｉａｅ）毒素,处理不同抗性品种二叶期幼苗,结果表明,黄萎病毒素对棉花幼苗有明显致萎作用,其萎蔫指数与田间病情指数呈显著正相关,同时发现黄萎病毒素对种子发芽也有明显的抑制作用     

内生细菌YBS106对棉花的诱导抗性研究

本实验以从一把伞南星(Arisaema erubescens(Wall.)Schott)组织分离到的内生细菌YBS106对三叶一心棉苗进行灌根诱导,同时挑战接种棉花枯萎病菌或棉花黄萎病菌,测定YBS106诱导对棉叶中抗性相关酶POD和PPO活性及与抗性相关的MDA和VC含量的影响,同时测定YBS106对棉花枯、黄萎病的相对防效。结果表明,YBS106诱导对POD和PPO活性及MDA和Vc含量均有显著影响。YBS106能有效诱棉叶中POD和PPO等防御酶活及Vc含量增加和MDA含量的减少,MDA和Vc含量在诱导后第5天达到最高,POD和PPO活性在诱导后第10天达到最高。病原菌挑战接种100 d时,YBS106对棉花枯萎病菌和黄萎病菌的相对防效分别为64.24%和71.37%,这与棉花系统抗性相关的防御酶活及相关物质(MDA和Vc)含量的变化趋势吻合。该结果表明YBS106诱导棉花产生了对棉花枯萎病菌和棉花黄萎病菌的系统抗性。     

木霉及其制剂对棉花真菌病害的防治效果

在盆栽条件下,9个木霉菌株对棉花丝核菌立枯病的防治效果为39．71％-82．35％,14个菌株对棉花枯萎病的防治效果为37．5％-75．00％,9个菌株对棉花黄萎病的防治效果为30．49％-65．85％。制备了绿色木霉LTR-2的可湿性粉剂,田问条件下处理种子及灌根,菌剂对棉花枯萎病的防治效果达50．1％-80．0％。     

有机改良剂对棉花黄萎病的防治效果及其对根际微生物区系的影响

用7种不同有机改良剂处理土壤,在盆栽和田问小区试验条件下分别研究了它们对棉花黄萎病的防治效果。调查结果表明：几丁质(蟹壳粉)处理对棉花黄萎病的防治效果最好,在盆栽和小区试验中病情指数分别比对照降低了72．21％和62．26％;豆秸粉和绿肥(新鲜油菜叶腐熟物)也有较好的防效,在盆栽和小区试验中均达到50％以上。田问小区的试验结果与盆栽试验结果基本一致。对根际微生物区系分析结果表明,不同有机改良剂处理土壤后根际微生物群体数量显著增加,种类增多,区系组成更加复杂,而且对棉花黄萎病菌具有抑制作用的真菌和放线菌比率也高于对照。     

新疆棉花黄萎病菌的培养特性及致病性分化的研究

1996-1999年对采自新疆各地的30个菌株进行了培养特性及致病性分化的研究。查明新疆棉花黄萎病不仅在培养特性上存在明显区别,在致病性上也存在强、中、弱三种不同的类型。过去检查新疆棉花黄萎病一般属于致病性较弱的类型,而这次通过鉴别寄主反应及多感染塔什干1、2号品种,说明新疆棉花黄萎病菌的致病性在中亚地区属较强的类型。     

棉花变黑轮枝菌的鉴定及致病性的测定

自湖北棉区有黄萎病症状的棉叶中分离到能产生厚垣孢子的褐色菌,取2个供试菌株V12和V24,经形态特征、生物学特性和ITS分析,鉴定为变黑轮枝菌(V.nigrescens).对其致病性进行测定,发现其对棉花致病力极弱.推测该菌是一种植物衰老期或植物生长势呈下降趋势时的病原菌,常与大丽轮枝菌混生.     

棉花黄萎病菌遗传转化载体构建和农杆菌转化

载体构建是建立真菌遗传转化体系的基础。本研究以pCAMBIA1305.1双元载体为基本骨架,构建棉花黄萎病菌遗传转化T-DNA质粒双元载体,通过限制性内切酶酶切、补平、连接以及去磷酸化等措施将pCAMBIA1305.1上Hygromycin抗性基因的CaMV 35S启动子替换成构巢曲霉的trpC启动子。经大肠杆菌转化后对转化子进行酶切验证,并将新构建的载体1305-3分别转入农杆菌菌株LBA4404和EHA105。为农杆菌介导的黄萎病菌遗传转化体系的建立和优化提供了存在于不同农杆菌菌株中的供试载体。     

棉花黄萎病生防细菌NCD-2抑菌物质提取研究

应用微生物控制植物病害是非常有效的方法。枯草芽孢杆菌是最著名的产生抗生作用的拮抗细菌。本文所使用的防治棉花黄萎病生防细菌NCD-2是枯草芽孢杆菌菌株,对16种植物病原真菌具有抑制作用,并且对棉花黄萎病具有较高的田间防病效果。通过发酵培养、有机溶剂萃取和盐析和透析提取了该菌株的胞外分泌产物,经抑菌作用测定证明该菌株分泌的有效抑菌成分为耐热蛋白。