PDLIM2的PDZ结构域晶体结构及其与2-吗啉乙磺酸的相互作用研究

在之前的研究中曾发现PDLIM2 蛋白能够通过其N 端的PDZ 结构域,与H5N1 亚型流感病毒NS1 蛋白的ESEV 序列相互作用. 解析了分辨率0.173 nm 的PDLIM2 的PDZ 结构域晶体结构,发现2-吗啉乙磺酸(MES)分子能够与该PDZ 结构域结合,并且占据PDZ 结构域中与流感病毒NS1 的ESEV 序列相互作用的位点.进一步利用体外GST-pulldown 实验证明,MES 对于NS1 与PDLIM2 之间的相互作用具有一定的抑制效果. 这一发现可能为开发与抗流感病毒相关的药物提供线索.     

用酵母双杂交检测BAR与PDZ结构域的相互作用

用酵母双杂交系统探索P ICK 1分子中BAR结构域与PDZ结构域的相互作用.分别构建了pGAD-PDZ和pGBK-BAR重组子,共转入酵母细胞后,涂布于SD(L eu-,T rp-,H is-)固体平板培养基,经滤纸复印和显色反应,在8 h内观察到只有pGAD-PDZ/pGBK-BAR的表达产物呈阳性,而其它对照pGADT 7/pGBKT 7、pGAD-PDZ/pGBKT 7和pGADT 7/pGBK-BAR均呈阴性反应,说明BAR与PDZ结构域具有相互作用.     

立体异构和羧基甲酯化对PDZ结构域抑制剂与nNOS PDZ相互作用的影响

ZLc-002及其类似物是一系列PDZ结构域抑制剂,它们能够不同程度地阻断nNOS与CAPON之间的偶联,从而表现了不同的抗焦虑活性(PDZ指最早发现含有此结构域的三个蛋白质的首字母缩写,分别是:post synaptic density protein-95,PSD-95;drosophila disc large tumor suppressor gene,DLG;zonula occludens-1 protein,ZO-1。即:突触后密度蛋白95,果蝇光盘大肿瘤抑制剂,和闭锁小带蛋白1。nNOS:neuronal nitric oxide synthase,即神经元型一氧化氮合酶。CAPON:carboxy-terminal PDZ ligand,即神经型一氧化氮合酶羧基末端PDZ结合配体)。为了探究立体异构和羧基甲酯化对PDZ结构域抑制剂与nNOS PDZ之间相互作用的影响,分别应用分子对接、分子动力学模拟,以及传统的和可极化的分子力场,对比研究了3个PDZ结构域抑制剂与nNOS PDZ之间的相互作用方式和强度。研究发现,羧基甲酯化的R型构象的PDZ结构域抑制剂与nNOS PDZ结构域相互作用最强,这与实验上测得的CAPON-nNOS解偶联率相一致。还计算和分析了抑制剂与nNOS PDZ相互作用能的不同分项,结果表明:立体异构和羧基酯化对PDZ结构域抑制剂与nNOS PDZ间的氢键相互作用具有重要影响,而对二者之间的范德华相互作用影响较小。     

小鼠PICK1与Orai1蛋白质间的相互作用研究

从小鼠脑组织中提取总RNA,RT-PCR扩增PICK1及Orai1的CDS序列,构建原核表达载体GST-PICK1及真核表达载体myc-Orai1,重组质粒经SalⅠ和NotⅠ双酶切鉴定后测序.正确的质粒myc-Orai1在HEK293细胞中表达收获过表达蛋白,GST-PICK1进行原核表达并获得融合蛋白.将纯化后的GST-PICK1蛋白条带切下,进行蛋白质液相质谱分析.后将myc-Orai1蛋白与GST-PICK1蛋白混合,进行GST-pulldown实验,western-blot检测到myc-Orai1的条带.结果表明PICK1与Orai1在体外有相互作用.     

VDAC3与ABA受体蛋白相互作用的验证以及初步研究

酵母双杂交技术在拟南芥cDNA文库中筛选得到了与ABA受体蛋白RCAR1,RCAR3均有相互作用的蛋白质VDAC3,并已获得VDAC3基因的全长.VDAC3蛋白包含有3个结构域,分别为Porin3结构域,DUF3442结构域和SEG片段,现根据结构域分布,将VDAC3截短为包含DUF3442的VDAC3N以及包含SEG的VDAC3C两段.将VDAC3全长以及分别截短的169个氨基酸(VDAC3N)及105个氨基酸(VDAC3C)的片段进行酵母转化实验,与RCAR1或RCAR3共同转化后,VDAC3,VDAC3N的共转酵母能够在缺陷型培养基上生长,并且使X-Gal显色为蓝色,而VDAC3C则不能.这验证了全长的VDAC3与RCAR1,RCAR3的存在相互作用,并发现决定VDAC3蛋白与RCAR1,RCAR3是相互作用的结构域位于N端的DUF3442结构域.     

日本赭纤虫第一类肽链释放因子C端结构域分析

eRF1的C结构域与eRF3的C结构域相互作用对于蛋白质翻译终止过程中的快速反应至关重要.通过计算机同源建模对日本赭纤虫第一类肽链释放因子C结构域Bj-eRF1C进行结构模拟,发现在Bj-eRF1C结构域中有些肽段直接参与了eRF1-eRF3相互作用,特别是Bj-eRF1C结构域中V294和D297位点高度保守.通过定点突变与pull-down分析,表明在Bj-eRF1C结构域中V294和D297是eRF1-eRF3相互作用的关键位点.     

人源程序性死亡配体PD-L2蛋白的原核表达与抗血清制备

利用原核表达系统获得包涵体表达形式的重组蛋白h PD-L220~123(Ig V结构域)和h PD-L220~208(Ig V结构域和Ig C结构域);将重组蛋白利用Ni-NTA柱亲和层析纯化与复性后,作为免疫原免疫Balb/c雌性小鼠制备鼠抗人的多抗血清,经ELISA法检测其效价均达到1∶106;Western-blot实验结果表明,制备的多抗血清均能特异性识别h PD-L2蛋白.以制备的多抗血清进行IHC实验评估与鉴定,结果显示:以h PD-L220~123重组蛋白为免疫原制备的多抗血清阳性较弱且定位模糊,以h PD-L220~208重组蛋白为免疫原制备的多抗血清具有很强的膜定位且背景清晰.     

二苯基氯化碘盐与电压门控质子通道Hv1的C-端结构域的相互作用（英文）

电压门控质子通道(Hv1)在"呼吸爆发"过程中参与细胞内p H的调节,以补偿NADPH氧化酶产生电子时的电荷.Hv1胞内C端结构域通过α螺旋二级结构形成二聚体,这种结构对蛋白质定位和在吞噬体中可能感应氧化还原反应起重要作用.二苯基氯化碘盐(DPI)经常被用来抑制细胞内活性氧的产生.通过荧光光谱实验研究了DPI与Hv1的C端结构域之间的相互作用.静态荧光猝灭的存在表明DPI与Hv1的C端结构域之间有相互作用.此外,锌离子的存在使DPI与Hv1的C端结构域之间的相互作用增强,表明锌离子影响DPI与Hv1的C端结构域之间的相互作用.研究结果表明,DPI与Hv1的C端结构域之间有相互作用,这可能为DPI抑制细胞内活性氧的产生机理提供新的解释.     

FOXM1688-748结构域相互作用蛋白的鉴定

为了鉴定转录因子FOXM1转录激活结构域(C-端第688位到748位氨基酸序列)的互作蛋白,以FOXM1的cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法扩增获得其转录激活结构域序列,克隆进入原核表达载体pGEX-4T2;利用大肠杆菌原核表达获得融合谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-Transferase,GST)标签的重组蛋白GST-FOXM1688-748;通过GST-pulldown结合质谱方法鉴定FOXM1688-748的互作蛋白,成功构建了原核表达质粒pGEX-4T2-FOXM1688-748,获得了原核表达的重组蛋白GST-FOXM1688-748.将质谱鉴定获得的互作蛋白进行分析和归类,预示一些互作蛋白可以参与激活FOXM1的转录活性,如RPN2、MISP、MCM7蛋白,一些互作蛋白可以参与调控FOXM1蛋白的稳定性,如USP9Y、CUL4A、HSPB1、BAG2蛋白.FOXM1蛋白的转录激活结构域与许多不同功能的蛋白发生相互作用,暗示该结构域具有重要的分子生物学作用,期望为以FOXM1为靶点的临床药物研发提供实验依据.     

梅毒螺旋体47ku抗原的分段表达及抗原表位分析

通过大肠杆菌表达系统表达了梅毒螺旋体47 ku膜蛋白及其N端和/或C端缺失的重组蛋白共15个,经亲和层析纯化,并通过免疫印迹和酶联免疫实验检测这组蛋白与梅毒病人血清的反应性.结果发现所有包含D结构域的重组蛋白的免疫反应性显著高于不含D结构域的蛋白,提示D结构域中可能包含47 ku膜蛋白上的一个免疫优势表位.     

杨树MAGPIE和JACKDAW基因克隆、表达及蛋白互作研究

利用RACE技术从杨树不定根中克隆获得PeMGP和PeJDK基因全长cDNA序列,分别包含1 434 bp和1 518 bp长度的开放阅读框。两者都含2个内含子,其氨基酸序列均有4个保守结构域:2个C2H2型锌指结构域ZF1(CX2-4CX3FX4LX2HX3-5H)和ZF2(CX4CXnHXnX4H),2个C2HC型锌指结构域ZF3(CX2CXnHX3C)和ZF4(CXCXnHX3C)。在根茎叶中均检测到PeMGP和PeJKD基因的表达,但它们在杨树不定根发育过程中具有动态的表达模式。杨树原生质体瞬时表达揭示,PeMGP和PeJDK蛋白都定位于细胞核,两者在细胞核发生相互作用。     

杨树MAGPIE和JACKDAW基因克隆、表达及蛋白互作研究

利用RACE技术从杨树不定根中克隆获得PeMGP和PeJDK基因全长cDNA序列,分别包含1 434 bp和1 518 bp长度的开放阅读框。两者都含2个内含子,其氨基酸序列均有4个保守结构域:2个C2H2型锌指结构域ZF1(CX2-4CX3FX4LX2HX3-5H)和ZF2(CX4CXnHXnX4H),2个C2HC型锌指结构域ZF3(CX2CXnHX3C)和ZF4(CXCXnHX3C)。在根茎叶中均检测到PeMGP和PeJKD基因的表达,但它们在杨树不定根发育过程中具有动态的表达模式。杨树原生质体瞬时表达揭示,PeMGP和PeJDK蛋白都定位于细胞核,两者在细胞核发生相互作用。     

重组果蝇Merlin蛋白的表达与纯化

NF2基因的的缺失会导致Ⅱ型多发性神经纤维瘤的发生.NF2又称Merlin,和ERM蛋白家族成员类似,Merlin蛋白N端的FERM结构域与C端的CTD结构域存在分子内的相互作用,从而形成一种自抑制的闭合构象;当Merlin蛋白N、C端分子内的相互作用被破坏时,能释放出N端的FERM结构域,从而能与许多效应因子相互作用...     

高尔基体堆叠蛋白GRASP55结构折叠变化研究

哺乳动物细胞中,高尔基体是由数个扁平囊泡堆叠形成的高度有极性的细胞器,其堆叠主要通过GRASP55和GRASP65蛋白的寡聚化来介导.GRASP55由N端两个串联的PDZ结构域和C端脯氨酸丰富结构域组成.前期工作中发现PDZ结构域末尾存在一段内部配体序列在GRASP55寡聚过程中有重要作用.为进一步验证该内部配体的作用,实验中以不含内部配体的截短型GRASP55为研究对象进行结构学研究,发现GRASP55中存在包含此内部配体的3处在构象上易变的区域,通过这些区域在折叠上的变化而影响GRASP55的寡聚化,进而影响高尔基体的堆叠.     

人金属硫蛋白-3的α结构域的表达及其性质研究

参考E.coli偏爱密码子,设计并合成人MT-3α结构域(α-MT-3)的DNA片段,克隆到表达载体pGEX-4T-1中。经IPTG诱导,在E.coli中高效表达出谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-α融合蛋白。凝血酶酶切融合蛋白(用CdCl₂或ZnSO₄辅助)后,得到纯化的结合镉或锌的α-MT-3蛋白。质谱分子量检测及氨基酸组成分析证明得到了目的蛋白。紫外吸收光谱及圆二色性光谱研究重组α-MT-3的结构。MT-3的与其余MT的α结构域不同,α-MT-3的圆二色性光谱在220nm左右为负峰,说明α-MT-3可能包含一个α-螺旋的二级结构。     

拟南芥AtTR1相互作用蛋白质筛选和鉴定

本研究利用酵母双杂交系统筛选与E3连接酶AtTR1存在相互作用的靶蛋白.首先,根据AtTR1所含有的结构域,我们对其进行了不同程度的截断以及点突变处理,以验证其各个片段的自激活活性和毒性.最终我们选取AtTR1-△119为诱饵蛋白对拟南芥归一化通用型cDNA文库进行筛选.结果初步获得了13个与其有潜在互作的候选蛋白.经酵母正向和反向多次验证发现转化了AtTR1与CURT1C和AtTR1与SWEET5的酵母在三缺和四缺培养基中均正常生长,而且在含有X-α-gal的培养基中出现蓝斑.双分子荧光互补技术也证明AtTR1与CURT1C或SWEET5之间也有相互作用.     

LHCGR胞外结构域蛋白的生信分析、原核表达及纯化

目的 为获得小鼠LHCGR胞外结构域蛋白(LHCGR-1),分析其结构及理化性质,为今后研究该蛋白功能及筛选与之相互作用的小分子化合物奠定基础。方法 根据NCBI中小鼠LHCGR氨基酸序列合成目的基因Lhcgr-1,经生物信息学分析后,将该基因插入至表达载体pET-28a(+),并转化至BL21(DE3)感受态细胞中;经IPTG诱导,表达重组蛋白pET-28a-LHCGR-1,利用SDS-PAGE和Western Blot进行鉴定,之后对该蛋白进行纯化,并通过分子对接技术预测该蛋白与LH、CG的相互作用。结果 预测LHCGR-1蛋白分子量为40 749.08,由367个氨基酸组成,等电点理论值为5.47;氨基酸序列中有29个丝氨酸位点、10个苏氨酸位点和5个酪氨酸位点;成功构建了表达载体pET-28a-LHCGR-1并获得纯化的目的蛋白;分子对接结果表明目的蛋白可以与LH、CG通过多种相互作用,形成稳定的复合物,有利于其发挥原有的生物学功能。结论 成功构建了小鼠胞外结构域蛋白LHCGR-1在大肠杆菌内的原核表达体系并获得了纯化蛋白,分子对接预测该蛋白具有生物学功能,提示该蛋白可以用于后...     

c-Src结构域真核表达载体的构建及鉴定

通过聚合酶链式反应(PCR),将c-Src的三个结构域SH3、SH2和KD分别定向克隆至C端带有HA蛋白标签序列的真核表达载体pcDNA3中.经HindIII和XbaI双酶切分析和测序鉴定正确后,应用脂质体法转染HeLa细胞48 h,蛋白免疫印迹法可以检测到细胞内SH3、SH2和KD的表达,证明重组表达质粒pcDNA3-SH2、pcDNA3-SH3和pcDNA3-KD构建成功,为进一步研究Src激酶在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础.     

鲫血清转铁蛋白推导序列分析及空间结构预测

用DNA Club分析软件推导出鲫血清转铁蛋白序列,并对该序列进行分析.推导的蛋白质长度为807个氨基酸残基,Mw约为90 000.其中半胱氨酸43个,可以组成21对二硫键.疏水性和二级结构几率分析表明:有两个非常相似的结构域分别存在于1-390和390-807区域.旋管结构和螺旋结构的分布区域,均分别集中在上述两个区段中,同样位于两个结构域中,结构也非常类似.证实了转铁蛋白(Tf)由2个同源性较高的结构域(N结构域和C结构域)组成.Tf的三级结构呈"V"字形,每个结构域又各自分为3个小的结构小区(即N1、N2、N3和C1、C2、C3).两个糖基位于N1和C1区,呈"Y"字型结构;铁链位于N2和C2区;受体结合位点R1和R2位于N3和C3区.