PML分子不同剪接体的分型及其应用

早幼粒细胞白血病(Promyelocytic Leukemia,PML)基因位于15号染色体,含有9个外显子,通过对内含子不同的剪接方式产生7大类20余种不同的PML剪接体.为对PML不同剪接体进行分型,针对PML各剪接体C末端设计5对型特异性引物,通过PCR扩增产物的有无及大小来判断PML分子的型别.利用设计的引物,通过对已知类型的PML质粒进行分型,确定了分型引物的可行性.对一株肝癌细胞系QGY7701中表达的PML分子进行分型,发现其为PML剪接体IV型与II型的混合型.研究表明,利用所设计5对引物的扩增,可以判断出某种组织或细胞中表达的PML分子剪接体型别.     

睾丸特异乳酸脱氢酶-C基因选择性剪接的研究

采用RT-PCR方法从牦牛、狗和大鼠睾丸组织中克隆睾丸特异乳酸脱氢酶-C（LDH-C）基因的cDNA序列,结果在3种动物中均发现了4或5种Ldhc剪接体,包括外显子缺失或内含子增加两种类型,其中外显子缺失数量为1或2个的比例高．3种动物中外显子缺失的比例由高到低依次为外显子5,4,7,6;狗和大鼠剪接体中额外增加的内含子部分序列均导致在内含子中提前形成终止密码子;对牦牛和狗睾丸组织LDH同工酶的电泳分析未检测到潜在的多种Ldhc剪接体的表达,推测睾丸组织Ldhc选择性剪接的功能是调控该基因在睾丸中表达的方式之一;用RT-PCR方法克隆牦牛肌肉和心脏组织Ldhc基因,意外检测到Ldhc的两种剪接体,提示Ldhc基因的选择性剪接可能参与睾丸以外的其他组织沉寂Ldhc基因的表达．     

PD-L1基因在正常胃和胃癌组织中的表达及其可变剪接变异体的鉴定

目的:检测PD-L1基因的常规和可变剪接变异体mRNA在胃癌组织和正常胃组织中的表达。方法:以RT-PCR方法从胃癌和正常胃组织的总RNA中扩增PD-L1的cDNA,并将扩增产物通过测序鉴定。结果:4例胃癌标本中,从病例2中扩增到常规和可变剪接变异体,但以常规剪接体为主,病例3仅扩增到常规剪接体PD-L1Ⅰ,病例4扩增到其可变剪接变异体PD-L1Ⅱ,而病例1两种剪接形式均未扩增到。在2例正常胃组织中均只扩增到可变剪接变异体PD-L1Ⅱ。结论:PD-L1基因在大多数胃癌组织中表达,正常与胃癌组织中还表达可变剪接变异体PD-L1Ⅱ,提示表达产物的剪接方式具有多样性。     

剪接体结构解析：摘获结构生物学“圣杯”

<正>大约1/3的人类遗传病与细胞中的一种复杂生命活动—剪接有关。剪接是生命信息从DNA向蛋白质传递过程中的关键一环。执行剪接任务的剪接体,更是细胞中最为复杂的分子机器。解析剪接体的结构曾经被视为"不可能完成的任务"。但在过去5年间,施一公院士与研究团队通过冷冻电镜技术,成功获得了酵母剪接体在剪接过程中全部8个基本状态以及人源剪接体7个状态的高分辨率结构,探明了剪接体组装、激活和催化机制,为治疗相关的人类疾病提供了可能,并因此荣获2020年度陈嘉庚科学奖生命科学奖。     

一种新HDM2剪接变异体的cDNA克隆与序列分析

利用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)分析癌基因HDM2在人宫颈癌Hela细胞中的表达.对克隆到的HDM2基因片段进行测序分析,从中筛选到一种新的HDM2剪接变异体.该剪接变异体阅读框由1 401 bp组成,预测编码466个氨基酸.与野生型HDM2相比,该变异体氨基酸序列的29-53位缺失,395住丝氨酸突变为苯丙氨酸,407位丝氨酸突变为半胱氨酸,其中缺失段29-53位于HDM2与p53相结合区域的上游部分.这可能影响HDM2与p53的相互作用,与p53的失活及癌细胞的转移相关.     

转录因子FOXM1剪接异构体在乳腺癌EMT过程中的初步研究

探究转录因子FOXM1不同的剪接异构体对乳腺癌EMT过程中的影响.采用基因工程方法分别构建了表达FOXM1B-EGFP和FOXM1C-EGFP两种FOXM1剪接异构体真核表达质粒,并将其转染进乳腺癌细胞,采用RT-PCR和Western印迹检测细胞样本中FOXM1剪接异构体的表达和EMT相关基因表达,同时采用transwell检测高表达不同FOXM1剪接异构体细胞的侵袭和迁移能力.成功构建了FOXM1B-EGFP和FOXM1CEGFP真核表达质粒.外源FOXM1B在乳腺癌间质型细胞的表达高于上皮型细胞,并主要存在于细胞核内,且高表达FOXM1B能够显著促进乳腺癌细胞的侵袭和EMT过程.外源FOXM1C在乳腺癌上皮型细胞中的表达高于间质型细胞,并且在细胞核和细胞质中均有表达,高表达FOXM1C能够显著抑制细胞的侵袭和EMT过程.实验结果表明,在乳腺癌细胞中,FOXM1B主要存在于细胞核内,FOXM1C在细胞核和细胞质中均有表达.本研究预示FOXM1B和FOXM1C对乳腺癌细胞EMT过程发挥不同的影响.     

敲低EYA3基因抑制人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞的生长

为了探讨人眼缺失基因(EYA3)在人视网膜母细胞瘤发生发展中的生物学作用,构建了EYA3小干扰RNA (siRNA)的真核表达载体,并验证敲低效果和观察其对人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞生长的影响.根据人EYA3的cDNA序列,将设计含有小发卡结构的寡核苷酸序列克隆到siRNA表达载体上;将重组质粒转染HEK293T细胞中,通过实时定量RT-PCR及Western印迹检测EYA3基因的表达水平;重组质粒稳定转染人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞并利用生长曲线检测EYA3对其生长的影响.结果表明:构建的siRNA能够抑制EYA3基因的表达,生长曲线验证EYA3 siRNA基因能抑制人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞的生长.最后结论是EYA3 siRNA能够抑制人视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞的生长,本实验为进一步研究EYA3在视网膜母细胞瘤中的功能奠定了基础.     

油菜BnCYP83B1基因的克隆与生长素相互作用的研究

为了探寻油菜BnCYP83B1基因的序列特征以及是否在IAA生长素代谢途径中发挥作用.采用克隆测序技术获得BnCYP83B1基因序列,编码区序列全长1500bp,编码一个含有499个氨基酸残基的蛋白质,全长基因内含有一个152bp的非正常剪接GU-AG内含子.采用Real-time PCR技术检测经2,4-D生长素类似物处理的油菜种子内BnCYP83B1基因的表达水平,发现在2,4-D处理下与对照相比存在显著的表达差异.BnCYP83B1基因可能拥有其他十字花科植物相同的功能极其可能在IAA代谢中发挥重要作用.     

家猪STAT1的基因克隆、剪接变体鉴定及组织表达研究

以长白猪(Landrace)cDNA为模板, 克隆STAT1基因cDNA全长.家猪STAT1基因cDNA全长编码757个氨基酸的前体蛋白, 与人、大鼠、小鼠、牛等哺乳动物的STAT1氨基酸序列一致性分别为95％、908％、896％、916％; 同时, 本研究亦鉴定到家猪STAT1的3种剪接变体(分别命名为STAT1 sv1, STAT1 sv2, 和STAT1 sv3).采用RT PCR方法, 进一步检测了STAT1及其3种剪接变体在成年家猪各组织中的表达情况.STAT1和两种剪切变体(STAT1 sv2 和STAT1 sv3)在家猪组织中广泛表达, 而剪接变体STAT1 sv1则在肺和脾脏中有较高表达水平.     

pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293 细胞系中的表达

目的:构建pEGFP-C1-MCH真核表达载体,并将其转染入HEK293细胞中,筛选阳性细胞克隆,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及机制提供细胞模型.方法:提取脑组织总RNA,反转录为cDNA,参照Genbank中提供的序列设计引物扩增MCH基因全长.再将该基因全长cDNA克隆至质粒pEGFP-C1,经菌落PCR筛选及双酶切和DNA测序鉴定,成功构建了含有目的基因MCH的重组质粒pEGFP-C1-MCH.并利用脂质体2000介导其转染HEK293细胞,用荧光显微镜和RT-PCR检测EGFP和MCH在细胞中的表达.结果:克隆的pEGFP-C1-MCH质粒序列中的MCH与Gen Bank相符;细胞转染72 h后,转染成功的细胞在荧光显微镜下表达较强的绿色荧光,MCH基因稳定表达.结论:pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的稳定表达,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及作用机制提供了实验模型.     

基于CRISPR/Cas9技术构建TRPV1基因敲除的CACO-2稳定细胞系

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人结直肠腺癌细胞Caco-2中的辣椒素受体基因TRPV1,构建TRPV1基因敲除的Caco-2稳定细胞系.使用CRISPR/Cas9在线靶点设计程序在TRPV1基因4个转录本的公共CDS区的第一个外显子DNA区域中设计一对gRNA,将gRNA构建到真核重组表达质粒的载体上,电转染待敲除细胞,经嘌呤毒素抗性筛选和基因测序获得敲除TRPV1基因的稳定细胞系.用Western Blot检测TRPV1基因蛋白表达量验证Caco-2中TRPV1基因的敲除效果,CCK-8检测TRPV1基因敲除细胞的生长曲线,与野生型细胞对比检测TRPV1基因敲除对细胞生长的影响.筛选出TRPV1基因敲除的CACO-2稳定细胞系,而且TRPV1基因敲除对Caco-2细胞生长无显著影响.基于CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了TRPV1基因敲除的CACO-2稳定细胞系,为后续研究辣椒素对肠道脂类吸收影响的机理研究提供了有利的工具.     

GFRa1不同剪接变异体mRNA在胃癌及结肠癌组织中的表达

为检测正常胃粘膜及胃癌组织和正常结肠及结肠癌组织中GFRa1 m RNA表达量,以及两种剪接体GFRa1a和GFRa1b的m RNA含量。初步明确胃及结肠组织中GFRa1剪接体存在形式以及与胃癌、结肠癌发生的相关性。采用收集23例正常胃粘膜/胃炎组织、20对胃癌及其切缘组织和6例非癌患者正常结肠活检组织、20对结肠癌及其切缘组织的方法。选择并提取结肠癌细胞系RKO,正常人胃粘膜上皮细胞系GES-1和人胃癌细胞SGC-7901这3种细胞系的RNA。以Alu m RNA为内参照,用定量RT-PCR的方法对胃组织、结肠组织以及所选的细胞系中GFRa1总m RNA含量进行分析。运用DHPLC技术区分GFRa1不同的剪接体,定量测定两种转录本剪接体的比值。结果显示,胃及结肠组织中,与正常及癌组织相比,切缘组织GFRa1总m RNA、剪接体a及剪接体b的m RNA相对拷贝数均显著增加(P0.05)。所有组织中GFRa1剪接体b的m RNA相对拷贝数均高于剪接体a。细胞系RKO、GES-1和SGC-7901均检测到GFRa1剪接体b的表达,而未检测到剪接体a。由此可知,胃和结肠组织以及相应的细胞系中GFRa1主要以剪接体b的形式存在;GFRa1剪接体b的高表达可能在胃及结肠组织癌变过程发挥作用。     

猪SOCS7基因克隆、组织表达图谱分析及剪接变体鉴定

以家猪肌肉来源 cDNA为模板,克隆了 SOCS7的编码区 cDNA 全长并发现了三种剪接变体(命名为：SOCS7-v1、SOCS7-v2和 SOCS7-v3).家猪 SOCS7编码区 cDNA 全长为1785bp,由9个外显子组成,编码含581个氨基酸残基的蛋白质.家猪SOCS7基因的三种剪接变体分别编码含547、520、512个氨基酸残基的蛋白质.通过RT-PCR方法,本研究对家猪SOCS7基因及其剪接变体的组织表达图谱进行了分析,结果显示：SOCS7在精巢、小脑、背肌、腹肌、股肌、大脑、下丘脑、心脏、肝脏、脾脏、小肠等组织中均有表达,在精巢中表达信号最强.SOCS7-v1和 SOCS7-v2除大脑外的19个检测组织中均能检测到较强的表达信号, SOCS7-v3在除精巢外的19个组织中均有表达.以上实验结果为探究家猪 SOCS7基因的生理功能奠定了基础.     

爪蟾卵母细胞中核酸—蛋白质的相互作用

已知爪蟾中编码核糖体蛋白Ｌ１的基因是在转录后被调节的；第三内含子能从前体ｍＲＮＡ以两种可选择的方式被剪裁下来，结果导致Ｌ１ｍＲＮＡ的产生或释放出一种小的核仁ＲＮＡ（Ｕ１６）。通过卵母细胞的显微注射，对剪接复合物的形成进行了活体研究，证明了剪接体的装配在Ｌ１的第三内含子上受到了损害，而剪接效率低的原因是由于存在次等的同感序列。对核内不均一的核内核蛋白体（ｈｍＲＮＰ）的分布也进行了分析，揭示了核内不均     

表达HIV-1复合多表位基因的p815细胞稳定株的建立和评价

建立稳定表达HIV-1p24MEG复合多表位基因的p815细胞克隆.设计引物,以HIV-1标准株全长cDNA序列为模板,PCR扩增获得p24基因片段;合成改造后的多个表位基因MEG并且与p24片段相连接,克隆入pcDNA3.1(+).在阳离子聚合物作用下重组真核质粒转染的p815(H-2d)细胞, 以G418压力筛选,RT-PCR检测mRNA表达,间接免疫荧光检测蛋白表达.通过PCR获得了HIV-1 p24片段,获得了与多表位基因连接后的p24MEG融合基因,成功构建了p24MEG基因的重组真核表达载体pcDNA3.1(+)/p24MEG.转染p815细胞后, RT-PCR检测到融合蛋白mRNA表达,间接免疫荧光显示 p815细胞内有融合蛋白的表达.结论:建立了稳定表达HIV-1p24MEG融合蛋白的p815细胞克隆,为评价多表位抗原p24MEG在BALB/c小鼠体内诱导的细胞免疫应答奠定基础.     

MEN1基因生物学功能研究进展

MEN1基因是多发性内分泌肿瘤1型综合征(MEN1)的关键致病基因之一.其编码蛋白menin在细胞核中与混合谱系淋巴瘤基因(MLL)等大量关键转录因子相互作用,直接参与组蛋白甲基化修饰等表观遗传调控过程,对靶基因转录和细胞表型的维持起关键的调控作用.MEN1基因突变导致的menin表达或核转位异常将引起一系列信号通路紊乱,进而引起内分泌系统疾病如MEN1.近年来,随着研究的深入,发现menin参与调控的组蛋白3的赖氨酸4残基(H3K4)甲基化修饰与内分泌系统肿瘤以及非内分泌系统如血液系统肿瘤的发生密切相关;我们最近的研究结果显示,menin通过赖氨酸27残基(H3K27)组蛋白甲基化修饰调控的多效生长因子等关键信号通路是调节肺癌表型的重要机制之一,提示menin在内分泌系统之外的广泛的生物学作用.综述了本实验室及国际上关于menin生物学功能的经典及最近的研究,重点介绍menin在非内分泌系统肿瘤发生发展中的关键作用及其调控的组蛋白修饰特点、规律.同时根据我们新近的研究,提出menin在其他系统疾病发生中的可能作用.这些新发现将有助于进一步深入揭示menin介导的表观遗传学调控在疾病发生中的关键作用,为以menin为靶点的疾病治疗提供崭新思路.     

高效转染HepG2细胞的逆转录病毒载体系统的构建及应用

为构建含绿色荧光蛋白(EGFP)和人胰岛素原基因的逆转录病毒表达载体,并检测其在人肝癌细胞HepG2中的表达,将IRES-EGFP片段克隆到含调控元件的人胰岛素原基因逆转录病毒表达载体(pLXSN-GI-Ins)中,构建得到表达质粒pLXSN-GI-Ins-EGFP.经脂质体介导转染HepG2细胞后,各孔分别加入含有30.0 mmol/L葡萄糖的培养液继续培养24 h,在荧光显微镜下观察EGFP基因的表达,检测细胞上清液中的胰岛素值.数据显示,成功构建逆转录病毒表达质粒pLXSN-GI-Ins-EGFP.转染HepG2细胞后48 h,表达EGFP基因的细胞数目占总细胞数目的比值为(38.0±5.0)%.结果表明,构建了含EGFP和调控元件的人胰岛素原基因逆转录病毒表达载体,并且能够在HepG2细胞中成功表达.     

UFC1基因在乳腺癌细胞中的表达及意义

目的：泛素结合酶UFC1是一个新鉴定的类似泛素结合酶E2的基因,探讨UFC1基因在不同类型的乳腺癌细胞中是否表达及表达量情况.方法：分别应用RT-PCR法、Western-blot法检测分别检测一系列的乳腺细胞系MCF7、HBL100、MDA-MB231和MDA-MB-453中UFC1基因的表达水平,并进行比较.结果：在正常的HBL100乳腺细胞系中的表达最低,而在乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB231、MDA-MB-453中的表达明显增强,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论：UFC1在乳腺细胞系中的差异表达的结果为将UFC1作为新的靶分子引入乳腺癌的临床预防和治疗提供实验依据.     

β-乳球蛋白启动子控制生长激素基因在293细胞中的表达

牛β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)启动子控制人生长激素(h GH)基因的表达载体p BLGH62可以在转基因小鼠的乳腺上皮细胞中高效表达.为了探索利用此表达载体在培养的细胞中生产人生长激素的可能性,将p BLGH62转染非乳腺细胞-人胚肾293细胞用胰岛素、地塞米松和催乳素进行诱导.结果显示,在细胞培养液中检测到人生长激素,说明p BLGH62能在293细胞中表达并能分泌到细胞外.但是,激素诱导对表达量的影响不明显.此外,人生长激素基因存在着可变剪接现象.     

抑制肿瘤小G蛋白ARHI研究进展

小GTP结合蛋白在细胞的整个生命活动中起着重要的作用.人类ARHI基因是小GTP结合蛋白中Ras亚家族的一个成员.系母系印迹基因,定位于染色体lp31.ARHI基因含有两个外显子和一个内含子,启动子区域有转录抑制因子E2F结合位点、3'末端有Au-rich区域.在ARHI基因中存在三个CpG岛,其中第一个CpG岛位于该基因的启动子区域,第二个CpG岛跨越了启动子和第一个外显子区.第三个CpV岛处于第二个外显子之内.与正常细胞相比,ARHI基因在肿瘤细胞中表达受到抑制,其原因为ARHI基因的杂合缺失,CpG岛的异常甲基化,转录抑制因子增多和多聚组蛋白脱乙酰化酶表达加强等.ARHI通过需钙蛋白酶途径诱导细胞凋亡;通过与STAT3(信号转导与转录激活因子3)的结合阻滞癌变.