番茄丛矮病毒组(Tombusviruses)成员外壳蛋白是一种单双链DNA结合蛋白

应用South-western技术以番茄丛矮病毒组(tombusvirus)6种病毒为材料研究了它们的外壳蛋白对单双链DNA的结合作用。结果表明tombus-组6种病毒(PLCV,AMCV,CNV,CyRSV,PAMV,TBSV)的外壳蛋白及PLCV重组外壳蛋白是一种单双链DNA结合蛋白,对单链DNA的结合能力远远超过双链DNA。这种结合作用可能与在tombus一组病毒外壳蛋白立体空间结构有关,因为当蛋白变性时结合作用大大降低。另外,一旦外壳蛋白与单链DNA发生相互作用,用4moL/L尿素或0.1％SDS在90°C水浴中难以洗掉。Tombus一组病毒外壳蛋白这种对单双链DNA的结合作用可能表明它们是一种参与病毒体内运输或调节复制的蛋白。     

过表达Pseudomonas mendocina复制起始相关蛋白提高菌体繁殖速度

复制起始蛋白DnaA通过识别复制起始位点oriC上的特殊序列,并招募复制复合体起始复制,它通过绑定ATP或ADP来对复制起始的开始进行调节.DNA聚合酶III的β亚基DnaN蛋白,负责将DNA聚合酶III连接到已经解旋的DNA上,以开始复制过程.通过过表达复制起始相关蛋白DnaA和DnaN,促进了菌体的繁殖能力,优化了菌体的生长状态,缩短了菌体倍增时间,为构建Pseudomonas mendocina工程菌株提供了参考.     

牦牛病毒性腹泻病毒P20和P14蛋白基因的原核表达及其产物检测

以牦牛BVDV基因组DNA为模板, 运用聚合酶链反应首次成功扩增出牦牛BVDV P20及P14基因, 并将其插入到pET-28a原核表达载体, 构建重组表达质粒pET-28a-P20和pET-28a-P14并分别转化至Rosetta(DE3)和BL21(DE3) 宿主菌中, IPTG诱导表达, 经SDS-PAGE检测, pET-28a-P20在宿主菌Rosetta(DE3)和BL21(DE3)中表达出约26KU的融合蛋白, pET-28a-P14表达出约20KU的融合蛋白, 结果分析表明p20和p14蛋白在两个宿主中都获得了高效表达, 表达出的蛋白大小与预期结果相符.     

AtbZIP19和AtbZIP23蛋白的原核表达

bZIP类转录因子参与调控多种生物学过程,包括植物生长、花的发育、种子的成熟、衰老、光信号传导、损伤修复、病菌防御以及对各种环境胁迫的响应等。文章构建AtbZIP19和AtbZIP23基因的原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了蛋白表达;提取拟南芥植株总RNA,通过RT-PCR克隆AtbZIP19与AtbZIP23基因cDNA全长;将pET-32a+载体和聚合酶链反应(PCR)产物进行双酶切,通过DNA连接反应将2个基因定向克隆到pET-32a+质粒中;经菌液PCR和测序鉴定获得阳性克隆后,将重组质粒转化至大肠杆菌原核表达菌株BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达得到目的蛋白。     

利用质谱技术鉴定寨卡病毒非结构蛋白NS1的细胞内相互作用蛋白

寨卡病毒(Zika Virus)属于黄病毒科中的黄病毒属,虽然很早就已经被人类所发现,但是一直到2015年在南美巴西的大规模爆发,才引起了广泛的关注.寨卡病毒对人类的感染往往引起包括小头畸形和格林-巴利综合征在内的多种症状.寨卡病毒的基因组为单链正链RNA,其基因组可以编码翻译并剪切加工出3个结构蛋白,分别为膜蛋白,囊膜蛋白和核衣壳蛋白,以及7个非结构蛋白(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5).相关研究已经证明,NS1蛋白与同属黄病毒属的登革病毒的发病有紧密的联系,而且根据其蛋白结构推测其可能与寨卡病毒穿越血脑屏障有关.因此鉴别NS1与细胞内的相互作用蛋白对于发现寨卡病毒在细胞内的转运,转录,以及装配都有重大的意义.在此,该课题构建并在HEK293细胞中表达包含Flag和Strep两种标签的NS1融合蛋白,通过免疫沉淀的方法将与NS1结合的蛋白利用标签蛋白进行分离,利用高分辨生物质谱技术,对蛋白进行分析鉴定.通过分别带有Flag与Strep标签的相互作用蛋白分析,发现了16个两种标签共同的结合蛋白,其进一步的通路分析证明这些蛋白于与病毒转录、病毒复制和免疫反应多个通路有关,相关的研究结果为今后进一步研究寨卡病毒的复制机制以及开发抗病毒药物提供了重要的参考价值.     

黑曲霉T21 glaA 5′上游调控区的两个蛋白结合因子及其靶序

采用凝胶阻滞法从糖化酶高产株黑曲霉(Aspergillusniger) T21部分纯化的蛋白提取液中检测到与糖化酶基因(glaA) 5′cis调控区特异结合的两个蛋白因子,其一的靶DNA定位在glaA翻译起始点(ATG)上游-580～-509及-318～-254bp两个区域,另一蛋白因子的靶DNA定位在-809～-580区域.-580～-509序列含有"TATA"的重复结构,-318～-254序列富含"GC"以及-809～-580序列含有CCAAT的特点暗示此3片段及其所结合的蛋白因子在A.nigerT21 glaA的表达调控中可能有重要作用.     

赖解旋酶恒温基因扩增技术的原理、应用和展望

赖解旋酶恒温基因扩增方法(HDA法)是新近发明的一种简便、快速、高效的体外恒温基因扩增技术.该法依靠DNA解旋酶解开双链DNA、单链DNA结合蛋白(SSB)维持单链状态、DNA聚合酶催化靶片段的扩增.研究表明,HDA能扩增微生物基因组DNA、病原菌DNA、质粒DNA和cDNA等,从灵敏性、准确性和可操作性几方面看,该方法具有广阔的实用前景.     

表达EGFR与HER2双抗体融合蛋白腺病毒载体研究

构建携带Cetuximab全长抗体与Herstatin C末端79个氨基酸(Herin)融合蛋白的腺病毒,探讨其在体外表达情况,及其与EGFR和HER2的结合能力.通过PCR,将抗体cetuximab基因与编码Herstatin C末端79个氨基酸(Herin)的序列融合,构建携带西妥昔单抗全长基因与Herin融合基因的腺病毒穿梭载体pDC339-AT2一Herin,并在293细胞内包装成重组病毒Ad5-AT2-Herin.通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Ad5-AT2-Herin表达全长抗体融合蛋白的体外表达量;应用Western印迹法检测所表达全长抗体轻重链的完整性及均衡性;应用间接免疫荧光法(IFA)检测所表达的融合蛋白与EGFR(+)Her2(-)的A431细胞,以及EGFR(-)Her2(+)的SK-OV-3细胞膜结合的特异性.ELISA检测分析表明,AdS-AT2-Herin在293细胞中的表达量为209.3 ng/mL-317.3 ng/mL;Western blot显示轻重链表达平衡,大小符合预期;间接免疫荧光(IFA)显示腺病毒表达的融合蛋白与A431细胞表面受体EGFR及SK-OV-3细胞表面受体Her2均能特异性结合.成功构建携带EGFR和HER2双特异性抗体基因的腺病毒载体Ad5-AT2-Herin,该载体在体外能高效表达双特异性抗体蛋白AT2-Herin,而且AT2-Herin蛋白能在体外与EGFR和HER2特异结合.     

白桦脂酸对Cx32组成的细胞缝隙连接功能的影响

目的:体外观察白桦脂酸对天然表达缝隙连接蛋白32(Cx32)的BRL-3A细胞的细胞缝隙连接(GJ)功能及Cx32蛋白表达水平的影响.方法:SRB法检测不同质量浓度白桦脂酸对BRL-3A细胞的毒性;细胞接种荧光示踪法观察不同质量浓度白桦脂酸对GJ功能的影响;Western blot方法检测白桦脂酸影响GJ功能的质量浓度对Cx32蛋白表达水平的影响.结果:白桦脂酸在0~1μg/m L质量浓度对BRL-3A细胞无毒性作用;白桦脂酸(0.01~1μg/m L)质量浓度依赖性地降低GJ功能,但对Cx32表达无影响.结论:白桦脂酸在0.01~1μg/m L质量浓度范围内,降低BRL-3A细胞的GJ功能;这种作用与Cx32蛋白的表达水平无关.     

14-3-3及Bcl-2蛋白在人脑胶质瘤中的表达及意义

目的通过检测14-3-3和Bcl-2蛋白在人脑胶质瘤中的表达情况,探讨其在胶质瘤发生、发展中的作用机制.方法采用免疫组化S-P法对5例正常脑组织标本和68例人脑胶质瘤标本进行14-3-3和Bcl-2蛋白检测.结果与正常脑组织比较,14-3-3蛋白在胶质瘤表达异常增强(P0.05);在不同病理分级中胶质瘤组织表达无统计学意义(P0.05),随着胶质瘤恶性程度的增加,14-3-3蛋白表达的强度和范围增加(P0.05).Bcl-2蛋白在不同级别的恶性胶质瘤中阳性表达率有差别(P0.05),且表达强度随着胶质瘤病理分级增高呈明显增高趋势.结论 14-3-3和Bcl-2蛋白对胶质瘤的恶性程度、肿瘤的病理分级有影响,可作为指导临床病理诊断及分级的参考指标.     

cDNA文库的差异筛选与抑制性减数杂交相结合分离胡萝卜体细胞胚根发育相关基因

应用cDNA文库差异筛选与抑制性减数杂交相结合的技术程序,并通过反向Northern分析进一步验证,成功地从解调控12h的胡萝卜体细胞胚的cDNA文库中,分离到7个在解调控12h特异表达的基因.其中4个含有完整的编码框,分别编码木质葡聚糖内转糖基化酶、脂肪酸去饱和酶、一种poly(A)结合蛋白和一种酰基转移酶.另外3个是5′端部分缺失的cDNA基因片段,分别编码三磷酸甘油醛脱氢酶、一种糖蛋白和一种与单链RNA/DNA结合的蛋白.对其中部分基因的Northern分析结果显示,它们的表达量在蔗糖调控下的胡萝卜体细胞胚根发育的不同时期均有显著变化,说明它们都是与胚根发育相关的基因.     

人类疱疹病毒7 U41蛋白DNA链结合能力分析

目的 :对人类疱疹病毒 7(humanherpesvirus 7,HHV - 7)U4 1的核酸结合能力进行分析鉴定。方法 :DNA结合蛋白分离收集、免疫沉淀及Western印迹检测U4 1蛋白对单、双链DNA的不同结合能力。结果 :U4 1蛋白能结合单链DNA而不能结合双链DNA。结论 :U4 1的功能之一是保持DNA模板的合适构型 ,以便DNA的延伸和病毒DNA的合成。     

AcMNPV bro基因的表达和作用研究

bro基因(baculovirus repeated orf)是杆状病毒编码的一个独特的基因家族,一些病毒的基因组中编码有多个该基因家族的成员.研究分析了苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)基因组仅有的一个bro基因,结果表明:AcMNPVbro基因(ac-bro)在感染后6h就开始转录,并在8h时检测到BRO表达;ac-bro基因敲除的重组病毒感染后子代病毒的效价略低于野生型病毒,且其DNA复制明显推迟.利用大肠杆菌中重组表达的Ac-BRO蛋白进行的体外实验提示其具有结合DNA的能力.这些结果提示ac-bro基因在病毒的复制中有一定的作用.     

水稻OsWHY1基因克隆及过表达与RNAi载体构建

Whirly蛋白是一种单链DNA结合蛋白,是植物特有的存在于细胞核与叶绿体中的双定位蛋白.本研究以水稻品系金23B为材料,从cDNA中克隆得到水稻whirly蛋白基因(OsWHY1).该基因的c DNA全长为1 250 bp,开放阅读框大小为825 bp,编码274个氨基酸.结构域分析结果表明OsWHY1蛋白序列具有whirly蛋白家族共有的whirly结构域.蛋白质序列比对分析表明,OsWHY1蛋白序列与玉米(Zea mays),小米(Setaria italica),黍(Panicum miliaceum),高粱(Sorghum bicolor),大麦(Hordeum vulgare)的蛋白序列相似性分别为79. 8%、83. 1%、82. 7%、78. 7%和75. 3%.此外,本研究通过酶切酶连的方法成功构建了pU1300-OsWHY1过表达载体和PTCK303-OsWHY1 RNA干扰载体,为进一步研究OsWHY1基因在水稻持绿性中的功能打下基础.     

重组人源METTL3蛋白的表达与纯化

m6A受到甲基转移酶(METTL3,METTL14,WTAP等)/去甲基化酶(FTO,ALKBH5等)以及一些RNA 结合蛋白(YTHDF1/2/3, ELAVL1 等)的共同调控,在细胞内是一个动态可逆的过程 . 甲基化转移酶METTL3 是甲基转移酶复合物中重要的组成部分,参与调控真核生物mRNA的甲基化水平.目前关于METTL3的分子结构基础以及整个甲基化转移酶的复合物的组装机制还不是很清楚.本研究中构建了原核表达载体pET.32M.3C-METTL3 ^(1-305) ,利用大肠杆菌原核表达系统表达出了可溶性的目的蛋白,通过镍柱亲和层析,凝胶过滤层析以及离子交换层析获得了纯度高,构象均一的蛋白METTL3 ^(1-305) .除此以外,还分别利用超速离心和圆二色谱的技术对蛋白的构象以及二级结构进行了分析.已获得的高纯度融合蛋白METTL3 ^(1-305) ,为进一步研究METTL3蛋白的结构以及与复合体其他成分之间的相互作用提供了一定的基础.     

真核生物DNA聚合酶δ的研究现状

DNA聚合酶δ(DNA polymerase δ)是真核生物DNA复制的主要复制酶,同时还参与DNA修复,对保持真核生物基因组的结构完整性和遗传稳定性具有重要作用.对DNA聚合酶δ蛋白功能活性及其基因表达机制的研究因受技术上的限制而未能深入研究.由于其重要的生物学功能,目前引起人们的更多关注和重视.文中就该酶的生物学功能、亚基组成、核心酶的分子表达调控以及与其他蛋白相互作用等方面对国内外DNA聚合酶δ的研究进行简要综述.     

FOXA1、GATA-3与ER在乳腺癌中的表达及预后意义

目的:研究原发性浸润性乳腺癌(非特指)中GATA结合蛋白3(GATA-3)、叉头框架蛋白A1(FOXA1)及雌激素受体(ER)的表达、相互关系及其预后意义.方法:收集乳腺癌改良根治标本138例,依据ER、孕激素受体(PR)、Ki-67及HER-2表达,分为Luminal A型、Luminal B型、Her-2过表达型及三阴型乳腺癌.采用免疫组化EnVision法检测138例非特殊型原发性浸润性乳腺癌组织中GATA-3、FOXA1和ER的蛋白表达.结果:GATA-3的总体阳性表达率为66.7%(92/138),其中Luminal A型阳性率90.0%(45/50)、Luminal B型阳性率74.1%(43/58)、Her-2过表达型阳性率30.0%(3/10)、三阴型阳性率5.0%(1/20);FOXA1的总体阳性表达率为40.6%(56/138),其中Luminal A型阳性率78.0%(39/50)、Luminal B型阳性率27.6%(16/58)、Her-2过表达型阳性率10.0%(1/10)、三阴型阳性率0(0/20).GATA-3与FOXA1在Luminal A型组的表达率显著高于其他亚型(P0.01).GATA-3与FOXA1的表达均与肿瘤大小、Nottingham预后指数、组织学分级呈负相关(P0.01).GATA-3和FOXA1的阳性表达率与基底样表型标记(CK5/6)及表皮生长因子受体(EGFR)的表达率均具有很强的负相关(P0.01).GATA-3与FOXA1在ER/PR阳性乳腺癌中的阳性率明显高于ER/PR阴性乳腺癌中的阳性率(P0.01),而且GATA-3和FOXA1的表达均与ER、PR直接相关(P0.01).结论:GATA-3与FOXA1在乳腺癌中与ER表达密切相关,可以作为乳腺癌预后良好的指标;另外对于GATA-3表达的乳腺癌,FOXA1可用于危险度分层.     

脱氢姜酮对人肺癌细胞A549细胞毒活性的研究

对生姜中有效成分脱氢姜酮对人肺癌细胞A549细胞(简称A549细胞)毒活性进行研究,同时考察其氢化产物姜酮的细胞毒活性,研究其构效关系.实验利用MTT法测定脱氢姜酮和姜酮对A549细胞的生长抑制作用,DNA电泳研究脱氢姜酮和姜酮对DNA切割作用,免疫印迹实验检测相关蛋白的表达.实验结果表明:脱氢姜酮对A549细胞增殖具有一定的抑制作用,在40~300μmol/L之间呈剂量依赖性;脱氢姜酮抑制A549细胞增殖的能力和对DNA的切割能力大于姜酮;N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)明显抑制脱氢姜酮的活性,对姜酮没有影响.免疫印迹结果显示脱氢姜酮可诱导CHOP蛋白的表达,表明脱氢姜酮通过内质网应急途径发挥作用.     

人泡沫病毒GAG、ENV蛋白的原核表达、抗血清制备及鉴定

构建了HFV的GAG和ENV蛋白原核表达载体pET-32a-gag和pET-32a-env,转化E.coli BL21Star(DE3)后用IPTG诱导出高水平的GAG、ENV融合蛋白表达.以融合蛋白免疫新西兰兔制备了GAG和ENV抗血清.Western Blot检测表明,抗血清可以识别原核表达的GAG和ENV蛋白,说明抗血清具有较好的特异性.结合Western Blot和间接免疫荧光实验,表明抗血清可以检测到病毒表达的GAG和ENV蛋白.     

人USP14蛋白在大肠杆菌中表达纯化的初步研究

采用PCR技术从人胎脑cDNA文库中克隆了usp14(ubiquitin-specific peptidase 14)基因编码区全长序列。序列分析表明人usp14基因含有peptidase蛋白酶C19A保守区,将usp14基因与pET-28b(+)载体相连,构建表达载体pET28b/usp14;把该表达载体转入大肠杆菌Rosetta(DE3)pLyS,以Isopropyl-D-thiogalactopyranoside(IPTG)诱导25°C 6小时,USP14蛋白获得高效表达。对表达产物进行Western blotting检测,并用Ni-NTA亲和层析技术获得了纯化的人USP14蛋白,表达的目的蛋白大小约为56kDa。