RNA干扰技术及其在医学研究中的应用

RNA干扰(RNAi)是指生物体内利用双链RNA(dsRNA)诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,从而导致转录后基因沉默的现象.RNAi主要通过核酸酶Dicer切割dsRNA生成21-23 nt的小干扰RNA(siRNA),继而由siRNA识别并靶向降解同源靶基因mRNA,从而抑制靶基因的蛋白表达.近年来,RNAi技术在医学研究中的广泛应用均取得了显著的基因沉默效果,RNAi以其高特异性、高效性等显著优势将成为研究基因功能的全新手段.文中综述了该技术在医学研究中的应用.     

慢病毒介导的RNA干扰抑制白血病细胞增殖的应用

通过慢病毒载体介导的RNA干扰(RNAi)技术,沉默成人T细胞白血病(ATL)中关键的病毒基因HBZ,并研究RNA干扰后对白血病细胞增殖的影响.首先根据HBZ基因序列设计RNA干扰片段,构建其慢病毒载体,并将其包装成病毒.然后用HBZ siRNA慢病毒感染白血病细胞株TL-Om1,通过RT-PCR和Western blot检测HBZ基因和蛋白表达情况,MTT技术检测沉默HBZ后TL-Om1细胞的增殖情况,利用RT-PCR检测病毒感染后下游生长相关基因的表达.实验结果表明:利用慢病毒介导的RNA干扰技术能有效降低HBZ的表达,进而抑制了白血病细胞的增殖;沉默HBZ后,细胞内E2F1,PCNA和Myc等下游生长相关基因的表达受到了明显抑制.这将为慢病毒介导的RNA干扰技术应用于临床治疗成人T细胞白血病提供重要的实验依据.     

RNA干扰技术在植物中的应用研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一项新的分子生物学技术,是外源和内源性双链RNA(double-strands RNA,dsRNA)在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,从而导致转录后基因沉默的现象。目前,RNAi及相关沉默反应的机制在植物中的研究取得了重大进展,在此对RNAi在植物功能基因组分析、抗逆性、抗病虫害和农作物遗传改良等方面的研究进行概述,以期为RNAi技术在植物上的深入研究提供参考。     

JcERF1基因RNA干扰载体的构建、转化及沉默效果研究

构建了麻疯树(Jatropha curcas)一个新的ERF类转录因子基因RNA干扰(RNAi)载体,并将之转入过表达JcERF1基因烟草体内, 得到了RNA干扰型烟草. 利用实时荧光定量PCR(QPCR)检测了JcERF1基因的表达量, 发现该基因在干扰型烟草中表达量明显降低. 通过野生型、过表达型和干扰型烟草的种子萌发实验和高盐胁迫实验发现: 与过表达型烟草相比, 干扰型烟草的抗盐能力明显降低, 且干扰型烟草的游离脯氨酸和可溶性糖含量在高盐处理后上升的幅度明显低于过表达型烟草. 以上研究结果说明JcERF1基因在干扰型烟草体内已被有效沉默, 同时说明该基因具有提高转基因烟草抗盐性的功能.     

RNA干涉研究进展

RNA干涉(RNAi)是生物体内的一种通过双链RNA(dsRNA)来抵抗病毒入侵和抑制转座 子活动的自然机制.快速发展的RNAi技术为抑制特异性基因的表达提供了有利的工具.到目前为 止,在真菌、拟南芥、线虫、锥虫、水螅、涡虫、果蝇、斑马鱼、小鼠等真核生物中都发现存在基因沉默 机制.RNAi作为基因沉默的工具,为基因功能研究、基因治疗、药物研究与开发等许多领域开辟了 一条新路.     

重组腺病毒介导RNA干扰人DLK1基因表达的研究

构建抑制人DLK1基因表达的重组腺病毒载体,利用腺病毒载体介导的RNA干扰技术评价其在肝癌细胞株中的基因沉默效应.将针对人DLK1基因的RNAi寡核苷酸序列,连接到腺病毒穿梭质粒中,在含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183内进行同源重组.重组腺病毒载体在HEK-293细胞中包装扩增,得到高滴度的重组腺病毒.通过绿色荧光蛋白示踪腺病毒的感染效果,并通过荧光实时RT-PCR,western blot的方法证实重组腺病毒能够显著抑制DLK1基因在肝癌细胞株中的表达.     

Nucleostemin siRNA对结肠癌细胞株HT-29细胞凋亡的影响

利用RNA干扰技术沉默结肠癌细胞株HT-29细胞中Nucleostemin(NS)基因的表达,并分析其对HT-29细胞凋亡的影响,进一步利用半定量RT-PCR和Western blotting技术检测细胞凋亡相关基因caspase-3/9 mRNAs和蛋白的表达.结果表明,NS基因的沉默能明显提高caspase-3/9的活性(P0.05),并诱导细胞发生凋亡,此外,HT-29细胞中NS基因沉默后,caspase-3/9mRNAs和蛋白的表达均明显升高,提示NS基因沉默介导的细胞凋亡与caspase-3/9基因表达的升高密切相关.     

溴氰菊酯胁迫下小菜蛾泛素化蛋白的分析与鉴定

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western Blot和LC MS/MS技术,对在溴氰菊酯胁迫下的小菜蛾(Plutellaxylostella)四龄幼虫的泛素化蛋白(Ubiquitinated protein)的组分进行分析,结果表明小菜蛾溴氰菊酯敏感品系与小菜蛾溴氰菊酯抗性品系里的泛素化蛋白表达量有显著差异.本实验成功证明了在药剂胁迫下小菜蛾泛素化蛋白存在表达上的差异,该研究结果为分析昆虫细胞中泛素的功能及其对昆虫生理、生化和环境胁迫等方面的调节作用提供了参考.     

小白杏自交不亲和S-RNase基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

为了应用RNAi技术调控杏自交不亲和性状,根据自交不亲和S66-RNase基因序列(Gen Bank登录中)设计特异引物,通过RT-PCR扩增S66-RNase基因(Gen Bank登录中)高变区及下游(63 bp)作为靶基因,构建RNAi表达载体的ihp RNA。以植物表达载体p CAMBIA为骨架载体,利用农杆菌介导的方法转化本氏烟,利用子房转化法转化小白杏。结果显示:获得了长度为439 bp的ihp RNA。表达载体酶切检验表明S66-RNase基因的RNAi表达载体构建和转入农杆菌LBA4404成功。通过抗性筛选和GUS染色检测,获得了16株阳性植株。结论:获得转基因烟草植株证明了本研究构建的RNAi植物表达载体有效,为诱导杏S-RNase基因转录后基因沉默、获得自交亲和的杏提供参考。     

RNA干涉与基因沉默研究进展

生物体内导入双链RNA(dsRNA)后会引起体内同源基因特异的沉默，这种现象称为RNA干涉(RNAi)．基因沉默是生物体基因表达调控的一种重要机制，具有重要生物学功能．就RNA干涉与基因沉默的研究历史、作用机制和应用作了综述．     

RNA干扰及其在哺乳动物中的应用进展

通过双链RNA(dsRNA)在植物、线虫、果蝇等中进行RNA干扰(RNAi)已获得了很大的成功,但将其应用于哺乳动物却遇到了一定困难.随着各种转染方法的日益改进,以及各种小干扰RNAs(siRNAs)表达载体的出现和不断优化,它们在体内的转录产物(长约21～23nt的双链siRNAs)能特异性抑制哺乳动物基因的表达,使得RNAi应用于哺乳动物系统成为可能. RNAi正在改变以往人们研究哺乳动物细胞基因功能的方式.不仅如此,RNAi正在向病毒、癌症、基因药物研制等方向迅猛发展,文中对RNA干扰及其在哺乳动物中的应用进展进行了综述.     

靶向hnRNP K基因siRNA的筛选及其对精原细胞存活的影响

利用免疫细胞荧光、RNA干涉(RNA interfere,RNAi)、qRT-PCR、Western blot及细胞计数等方法,设计合成三对小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)(siRNA-hnRNP K-1,2,3),对小鼠精原细胞中内源性的不均一性核糖核蛋白K(Heterogeneous ribonucleoproteins K,hnRNP K)进行敲低并对其沉默效率进行筛选,研究其对小鼠精原细胞存活的影响.结果表明,siRNA-hnRNP K-3对小鼠精原细胞具有80%以上的沉默效率,转染后发现细胞数目明显减少,说明沉默hnRNP K基因的表达对小鼠精原细胞的存活有显著影响.     

RNAi及其在生命科学研究中的应用

RNAi即RNA干扰(RNA interfering),是近几年才发现的一种由双链RNA引起的基因沉默的现象,是目前分子生物学领域研究的热点。介绍RNAi的发现,并对RNAi在生命科学研究领域的最新应用进行综述。     

甘蓝型油菜G蛋白β亚基过量表达载体和RNA干扰载体的构建及遗传转化

构建了含甘蓝型油菜G蛋白β亚基BnGB1基因的过量表达载体pFGC5941-BnGB1和RNA干扰(RNAi)载体pFGC5941-Ri-BnGB1,将构建的两个载体分别经根癌农杆菌介导,转化甘蓝型油菜"R197"下胚轴外植体,经过外植体的预培养、共培养以及选择培养后,获得再生植株24株.经PCR鉴定,其中有1株为BnGB1基因过量表达转基因植株,2株为BnGB1基因RNA干扰转基因植株.RT-PCR结果显示,相对于野生型"R197"油菜,过表达转基因植株中的BnGB1基因的表达量提高,而RNA干扰转基因植株中BnGB1基因的表达量降低.     

基因沉默抑制子HC-Pro表达载体的构建

RNA沉默广泛存在于植物等大多数真核生物中,能够防御外源基因的入侵和调控基因表达等.然而,基因沉默抑制子HC-Pro蛋白的具体功能的研究并不十分清楚.本文重点介绍了基因沉默抑制子HC-Pro的表达载体pBI121-HC-Pro的构建及HC-Pro基因在烟草(Nicotiana benthamiana)中的稳定表达.并利用半定量RT-PCR技术检测了目的基因HC-Pro的表达,检测结果表明我们获得了HC-Pro基因稳定表达的转基因烟草株系,为进一步深入研究基因沉默抑制子HC-Pro的功能奠定了实验基础.     

RNAi表达载体在哺乳动物中的研究进展

对RNA干扰(RNAi)表达载体的非生物与生物递送系统及主流应用进行综述,明确其在基因调控及未来基因治疗领域的应用前景,并指出其在种属特异性及表达效率等方面存在的局限性.对RNAi表达载体的结构组成、发展沿革及体内作用机制进行归纳分析,提出基于结构组成和加工机制双重属性的分类方法.     

RNA干扰技术及用于基因治疗的研究现状

RNAi是双链RNA介导的转录后基因沉默作用的重要机制之一,笔者主要介绍了RNAi技术的原理和用于基因治疗的研究现状.     

RNA干扰及其应用

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是真核生物中普遍存在的一种自然现象，是由双链RNA（double—stranded RNA，dsRNA）启动的序列特异的转录后基因沉默过程．在这一过程中，双链RNA被核酸内切酶切割成小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），小干扰RNA与相关的蛋白质结合成RNA诱导沉默复合体（siRNA—induced silencing complex，RISC），RISC识别并降解靶mRNA．现在认为RNA干扰是真核生物共有的抗病毒、抗转座子、抗转基因和抗异常RNA的基因组免疫系统．随着RNA干扰的研究，产生了一种新的技术-RNA干扰技术，并得到了广泛的应用．