盐芥TOR基因的克隆及对盐芥生长发育的影响

雷帕霉素靶蛋白(TOR)在调节动植物的生长及新陈代谢方面起重要作用.为进一步研究植物中TOR的作用,对盐芥TOR基因进行克隆,采用聚合酶链式反应和cDNA末端快速扩增技术等分子生物学方法获得盐芥TOR基因的cDNA全长及基因组全长,构建了ThTOR基因沉默植物表达载体并成功获得盐芥ThTOR基因沉默的转基因株系.结果表...     

高山离子芥磷脂酶Dα编码区基因序列克隆与表达载体构建

磷脂酶D(PLD)是重要的细胞磷脂代谢酶,在植物的生长及对不良环境胁迫的抵御反应中起重要作用.本试验以高山离子芥(Chorispora Bungeana)为材料,取幼叶分离mRNA,反转录合成cDNA,PCR扩增加XbaΙ和SacΙ酶切位点的高山离子芥磷脂酶Dα(PLDα)编码区序列、测序.结果表明插入片段为PLDα目的基因片段,全长约1 600bp,blast比对发现该序列与Genbank中报道的拟南芥PLDα基因相比同源率为94.6%.回收纯化PCR产物,克隆至pTG19-T载体双酶切后将目的基因片段定向克隆至pBI-121载体,构建高山离子芥PLDα基因编码区片段的表达载体pBI121-PLDα,双酶切及PCR鉴定结果显示表达载体构建成功,为下一步进行抗逆转基因作物选育奠定了基础.     

大麦醇溶蛋白基因片段克隆和RNAi植物表达载体构建

 为了降低啤酒大麦蛋白的含量,提高啤酒大麦品质,利用甘肃推广面积最大的品种甘啤4号为材料,克隆大麦醇溶蛋白基因保守区序列,构建RNAi表达载体。根据已知大麦醇溶蛋白基因保守序列设计一对特异性引物B2PF5′-CAACCATTTCCACAGCAACCACCAT-3′,B2PR5′-GAAAGATAGAGTAGACGATTGCACG-3′,采用PCR技术从甘啤4号大麦基因组中获得了1个349bp片段（GP4）。依据载体pHANNIBAL和pART27的结构,分别将GP4按所对应酶切位点正反向插入,利用热激法转化。结果分析显示,克隆出的片段与GenBank （NCBI）中醇溶蛋白基因核苷酸序列同源性高达92%,所构建成的RNAi表达载体pART27-pHAN-GP4中含目标片段。     

柑橘CsPRP4基因RNAi载体的构建

富含脯氨酸蛋白4(PRP4,proline-rich protein 4)是一类响应胁迫并在细胞发育过程中起作用一种细胞壁蛋白。用RT-PCR克隆柑橘CsPRP4基因的正、反义cDNA序列,分别连接到T载体pMD–19T上;经限制性核酸内切酶2次双酶切,将CsPRP4基因的正、反义片段定向连接至双元质粒pFGC5941查耳酮合成酶A(CHSA)内含子的两端,构成反向重复序列;经菌液PCR和测序验证,成功构建了CsPRP4基因的RNA干涉载体;经农杆菌介导法转化柑橘,转基因植株具有明显不同于对照的表现型,研究为进一步阐明CsPRP4的功能奠定了基础。     

盐芥ThPHT1;8基因的克隆和功能分析

磷(P)是植物生长发育过程中重要的矿质营养元素之一,PHT1磷酸转运蛋白家族负责调控植物从土壤中吸收磷以及细胞间无机磷(Pi)的转运.本文以盐芥幼苗根cDNA为材料,克隆到盐芥磷酸转运蛋白ThPHT1;8基因.生物信息学分析结果表明,ThPHT1;8蛋白编码525个氨基酸残基,蛋白分子质量为58.1,ku,等电点6.33,是一个定位在细胞膜上的疏水、无信号肽的非分泌性蛋白,含有高亲和力磷酸转运蛋白典型的跨膜结构.实时定量PCR结果显示,低磷胁迫能促进ThPHT1;8基因在盐芥根部的表达,而且不同磷浓度处理下ThPHT1;8基因表达的模式不同.ThPHT1;8基因在转基因拟南芥中的生物学功能研究表明,不同浓度低磷胁迫处理下,与野生型拟南芥相比,35S:ThPHT1;8转基因拟南芥幼苗的主根根长显著增加、侧根密度显著降低,叶绿素含量、无机磷和总磷含量提高,花青素含量降低.上述结果表明,盐芥ThPHT1;8基因确实参与低磷胁迫时植物的应答,能够提高转基因拟南芥的耐低磷能力,为土壤磷高效利用提供了一种有潜力的候选功能基因.     

水稻OsWHY1基因克隆及过表达与RNAi载体构建

Whirly蛋白是一种单链DNA结合蛋白,是植物特有的存在于细胞核与叶绿体中的双定位蛋白.本研究以水稻品系金23B为材料,从cDNA中克隆得到水稻whirly蛋白基因(OsWHY1).该基因的c DNA全长为1 250 bp,开放阅读框大小为825 bp,编码274个氨基酸.结构域分析结果表明OsWHY1蛋白序列具有whirly蛋白家族共有的whirly结构域.蛋白质序列比对分析表明,OsWHY1蛋白序列与玉米(Zea mays),小米(Setaria italica),黍(Panicum miliaceum),高粱(Sorghum bicolor),大麦(Hordeum vulgare)的蛋白序列相似性分别为79. 8%、83. 1%、82. 7%、78. 7%和75. 3%.此外,本研究通过酶切酶连的方法成功构建了pU1300-OsWHY1过表达载体和PTCK303-OsWHY1 RNA干扰载体,为进一步研究OsWHY1基因在水稻持绿性中的功能打下基础.     

百合花发育相关基因LLGLO1的RNAi载体构建

百合花发育相关基因的研究是开展花卉分子育种的重要基础。以麝香百合(Lilium longi-florumThumb.)未开放的花蕾为材料提取总RNA。根据LLGLO1序列的同源比对选取特异区段,设计引物扩增区段cDNA并引入酶切位点。将PCR扩增片断连接到T载体上,经酶切及PCR验证后进行测序。测序结果表明:用于RNAi的cDNA片断与LLGLO1序列完全相同。通过中间载体pSK+intron引入一段内含子间隔区,RNA干扰片断经过多次的酶切和连接过程最终连入表达载体pCAMBIA1301中形成ihpRNA结构。PCR及双酶切鉴定结果显示,构建的RNA干扰载体的ihpRNA结构完整。     

构建T载体用于PCR克隆

通过克隆甘露聚糖酶基因到pMD-18T载体构建了质粒pMD-18Tman2XcmI,克隆的甘露聚糖酶基因两侧各引进了一个特定的XcmI酶切位点;用XcmI酶切质粒pMD-18Tman2XcmI可以制备T载体．因为甘露聚糖酶基因作为填充片段和筛选标记受半乳糖苷酶基因启动子的控制,甘露聚糖酶能够表达,从而水解甘露聚糖产生水解圈,指示转化了部分酶切质粒的背景菌落．此外,在甘露聚糖酶基因中存在第3个不同序列的XcmI酶切位点,因此残余的甘露聚糖酶基因引起的背景可以进一步降低．抽提大量质粒贮存,随时制备T载体使用,增加了克隆的稳定性．该T载体克服了一般T载体质量不稳定,费钱,克隆效率低,假阳性高的缺点．使用构建的T载体完成了10个基因的克隆,结果表明重组效率达到了90％～100％．     

中性蛋白酶基因的克隆与表达载体的构建

中性蛋白酶是指其最适作用pH为6－7．5的一类蛋白酶，其主要作用为皮革脱毛、毛皮软化、制蛋白胨、 酵母膏、肝宁及用于食品工业等。我们从枯草杆菌中克隆出中性蛋白酶基因，并成功构建了中性蛋白酶基因表达载体，为下一步实现蛋白酶的高效表达奠定了基础。     

大熊猫白血病抑制因子RNAi干扰载体的构建及应用

旨在构建大熊猫白血病抑制因子(LIF)RNAi重组质粒,以期进一步研究LIF对大熊猫骨髓间充质干细胞(PDBM-MSCs)的调控作用.试验设计3组大熊猫LIF shRNA慢病毒pLKO.1 puro-LIF-down干扰载体,通过慢病毒的方式感染PDBM-MSCs,经q-PCR鉴定重组质粒pLKO.1 puro-LIF-down-1抑制效果最显著.pLKO.1 puro-LIF-down-1实验组和空质粒对照组比较发现,LIF mRNA表达水平抑制后能够显著下调细胞周期调控基因CDK2、CCNB2、CCND3的mRNA表达水平(P<0.05);显著上调凋亡基因P53、P16、P27、caspase3的mRNA表达水平(P<0.05);显著下调干性基因KLF4、SOX2的mRNA表达水平(P<0.05).以上结果表明,此次研究成功构建出大熊猫LIF RNAi干扰载体,LIF对PDBM-MSCs的生长和干性维持具有重要的调控作用,为大熊猫干细胞的体外培养及干性机制的研究奠定基础.     

拟南芥AtPLC4基因RNAi载体的构建及遗传转化

利用RNAi技术,构建了AtPLC4基因的RNAi双元载体,并进行了拟南芥的遗传转化,通过抗性筛选及PCR鉴定,获得20株遗传转化株系.进一步通过RT-PCR检测,得到3株AtPLC4基因表达降低的转基因植株,为运用反向遗传学的方法深入研究AtPLC基因家族的生物学功能提供基础.     

小麦AGPase胞质型小亚基SSUⅠ的克隆及过表达反义表达与RNAi干扰载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的发育籽粒中克隆出小麦淀粉合成关键酶AGPase胞质型小亚基（AGPase plastic small subunit,SSU Ⅰ）的cDNA全长,并构建了此基因的过表达、反义表达和RNAi干扰载体.SSUI的cDNA全长为1465 bp（GenBank No.EF405961）,编码域长度为1 422 bp,位于EF405961的2～1 423 bp.同源性比较结果表明：与GenBank上已报道的SSU I基因（X66080,AF244 997,Z48562）同源性达98%～99%.以pWM101质粒为基础,构建了由35 S启动子调控的SSU I基因的过表达载体pWM101SSU Ⅰ S;将该基因反向置于pBI121质粒的CaMV35S启动子之后,构建了SSU Ⅰ的反义表达载体pBI121SSU Ⅰ A.同时还克隆出SSU Ⅰ基因的一段260 bp高保守序列,以pFGC5941质粒为基础,构建了RNAi干扰载体pFGC5941SSU Ⅰ.     

磷酸甘露糖异构酶基因的克隆与表达载体的构建

根据genebank中公布的pmi基因序列通过PCR的方法从大肠杆菌中得到目的片断,并与pGM-T easy载体连接.将鉴定为阳性重组子中的目的基因进一步与植物表达载体pBI121的不同区域连接,成功构建了载体NPTII-pmi-121和pmi-121^△NPTII.     

小麦AGPase胞质型小亚基SSU I的克隆及过表达反义表达与RNAi干扰载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的发育籽粒中克隆出小麦淀粉合成关键酶AGPase胞质型小亚基(AGPase plastic small subunit,SSU I)的cDNA全长,并构建了此基因的过表达、反义表达和RNAi干扰载体.SSU I的cDNA全长为1465 bp(GenBank No.EF405961),编码域长度为1 422 bp,位于EF405961的2～1423 bp.同源性比较结果表明:与GenBank上已报道的SSU I基因(X66080,AF244997,Z48562)同源性达98%～99%.以pWM101质粒为基础,构建了由35S启动子调控的SSU I基因的过表达载体p.WM101SSU I S;将该基因反向置于pB1121质粒的CaMV35S启动子之后,构建了SSU I的反义表达载体pBI121SSU I A.同时还克隆出SSU I基因的一段260 bp高保守序列,以pFGC5941质粒为基础,构建了RNAi干扰载体pFGC5941SSU I.     

豌豆凝集素基因的克隆与植物表达载体的构建

为研究凝集紊基因转化非豆科植物后对根瘤菌的识别作用,设计特异引物扩增出豌豆凝集紊基因,并对基因序列进行比对分析．将豌豆凝集紊基因克隆到载体pVCT2020中,获得植物表达载体pVCT—PsL．该载体可用于转化烟草等非豆科植物．     

狗头枣ACOⅠ基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

枣作为我国一种独特的优势经济作物,既可鲜食也可制成枣干,其营养价值高,经济效益好,而采摘后易软化变质影响销售。为探索ACOⅠ基因功能及其与枣果软化之间的关系,以狗头枣ACOⅠ基因外显子3和外显子4为靶标,构建了以CaMV 35S启动子驱动的ihRNAi植物表达载体pART ACOⅠ_3-4。以ZK木枣品系叶片为外植体,采用农杆菌介导的叶盘法法对其进行遗传转化,经抗性筛选及PCR鉴定,初步获得了16株阳性木枣试管苗。通过木枣叶片为外植体对其进行遗传转化获得转基因材料,为培育出耐贮藏的转基因红枣奠定基础。     

Mi基因过表达载体和16D10基因RNAi载体的构建及转化

文中采用PCR技术从番茄中克隆获得了Mi基因,采用反转录PCR(RT-PCR)技术从来源于红橘（Citus reticulate）的根结线虫中克隆获得了16D10基因,采用DNA重组技术构建了Mi基因的过表达载体和16D10基因的RNAi载体,分别命名为pB-Mi和pB-16DR. 通过根瘤农杆菌介导的遗传转化,获得了经PCR检测为阳性的沙田柚转基因植株. 这一结果将为研究Mi基因过表达和16D10基因的RNA干扰对柑橘根结线虫病的抗性影响提供试材和技术支持.     

番茄紫外损伤DNA结合蛋白2(UV-DDB2)全长cDNA克隆及RNAi载体的构建和转化

人类紫外损伤DNA结合蛋白复合体(UV-DDB)由127 kDa 的DDB1蛋白和48 kDa的DDB2蛋白组成.DDB复合体在核酸损伤修复(NER)过程中起到重要作用.本研究通过RACE技术,获得番茄DDB2的全长cDNA序列(1945 bp),具有一个完整的开放阅读框(160bp),编码的氨基酸序列与拟南芥和水稻的DDB2蛋白分别有65.5%和56.1%同源性.利用半定量RT-PCR技术分析表明,DDB2在番茄根、花、嫩叶和幼嫩的果实等分裂旺盛的组织中表达量较高.同时构建了DDB2基因RNA干扰(RNA interference)载体,并利用根瘤农杆菌介导的番茄转化技术获得转基因植株.     

三角褐指藻PPDK基因RNAi载体的构建和基因枪转化

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的全基因组序列已经公布,为了把RNAi的技术应用于三角褐指藻的相关研究中,以C4途径关键酶丙酮酸磷酸二激酶基因(PPDK)为试验对象,构建了用于表达与PPDK部分序列同源的发夹RNA(hpRNA)的载体pPPDKi,并用基因枪方法成功将PPDKi和Zeocin抗性基因sh ble共转化到三角褐指藻细胞中.摸索出的较优基因枪转化的条件为:使用50%海水f/2培养基预培养的藻进行微粒轰击,轰击压力10.5 MPa,钨粉直径1.0 μm,轰击距离6.5 cm.PCR 检测结果表明,在Zeocin筛选的阳性藻株中约有60%同时整合了PPDKi序列.将其中6株共转化的转基因藻与野生型藻的生长速率进行比较,发现它们的生长受到4.6%～10.7%的抑制.这可能是PPDKi的表达影响了丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)的活性,从而进一步影响了三角褐指藻的生长,但也有可能是外源片段的插入影响了其他基因的正常表达,导致细胞活动异常.     

番茄红素β环化酶基因RNAi植物表达载体的构建及遗传转化

番茄红素是类胡萝卜素合成途径中重要的中间产物,本研究探讨了在番茄中通过RNAi手段提高番茄红素含量的依据,由Genbank中番茄红素β环化酶(Lyc-β)序列设计2对引物,通过高保真PCR扩增出2段Lyc-β基因的高度保守片段。根据RNAi的原理将该基因片段构建成为具有RNA干扰作用的植物表达载体,将该干扰载体通过农杆菌介导转化的叶盘法转入烟草中。经过PCR鉴定证明,干扰载体已经转入烟草中。