利用昆虫-杆状病毒表达系统制备HPV16E6蛋白

目的利用昆虫-杆状病毒表达系统高效表达HPV16E6蛋白。方法将HPV16E6基因克隆入供体质粒pFastBac-HTb,然后再重组入杆状病毒基因组;用带有目的基因的杆状病毒转染昆虫（Sf-9）细胞,27℃培养72 h,收集被转染细胞,SDS-PAGE,Western-blot分析鉴定表达蛋白。结果SDS-PAGE分析显示所表达蛋白分子量约为24KD,Western-blot结果表明表达产物为HPV16E6蛋白。结论利用昆虫杆状病毒表达系统获得HPV16E6蛋白的高效表达。     

棉铃虫组织蛋白酶B在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定

以棉铃虫（Helicoverpa armigera）组织蛋白酶B作外源基因重组构建克隆载体,自重组菌株HCB-DH10Bac、Histag-HCB-DH10Bac中提取穿梭质粒,脂质体法转染草地贪夜蛾卵巢细胞系Sf21细胞,转染液再感染细胞,收集感染3～4d的上清液,提取芽生病毒的DNA,PCR法鉴定外源HCB基因,感染上清进行SDS-PAGE、Western-blotting、蛋白酶活性检测．结果：感染上清中的芽生病毒的DNA作模板扩增出预期的1700bp片段,SDS-PAGE、westem-blotcing检测均在28ku处有明显表达产物,且表达产物有蛋白水解活性．     

neuritin基因杆状病毒表达载体的构建

为研究Neuritin蛋白的功能,将neuritinORF在杆状病毒-昆虫表达系统中表达,构建杆状病毒表达载体.以308D10为模板,利用PCR方法扩增neuritinORF,定向克隆法将其克隆至PFASTBAC-HTA转移载体中.然后利用同源重组原理将其转移至杆粒bacmid中.得到携带neuritin ORF的重组杆粒.本实验获得了重组目的基因真核表达载体并经PCR鉴定,插入片段方向、大小正确,DNA测序分析表明插入处接头和读框与预期序列相符,成功构建了Neuritin的杆状病毒表达载体.     

单细胞克隆法快速筛选重组昆虫杆状病毒

首先采用显微操作系统挑取包含有重组病毒的单细胞，成功地获得了重组杆状病毒的单细胞克隆，并得到了重组病毒的纯培养，对有多角体的和无多角体的重组病毒细胞的挑取表明，这一方法对重组杆状病毒的筛选具有普遍适用性，我们发展的这一方法比常规的空斑技术简便、便速，只需两周左右即完成重组病毒的筛选。     

昆虫杆状病毒可调控表达系统的初步研究

构建了2株用不同启动子表达tet阻遏蛋白Tet-off,并同时带有tet响应元件及报道基因表达框的重组杆状病毒,研究了其受诱导物(强力霉素)调控表达报道基因的情况.W estern b lot和流式细胞仪分析表明,这两株病毒感染昆虫Sf9细胞后,在有诱导物存在时报道基因egfp表达水平明显高于无诱导物时的表达水平,表明Tet-off可调控表达系统可以用于在昆虫Sf9细胞调控相关基因的表达,这项研究为构建更加有效的可调控杆状病毒表达系统提供了基础.     

二连体人干细胞因子基因的构建及其在昆虫细胞中的表达

应用DNA重组技术构建两端为人干细胞因子 (hSCF) 1～ 16 5肽编码区 ,中间为柔性连接肽 (GGGGSGGGGSGG)编码区的头尾相连的二连体基因 (dSCF) ,并将其插入杆状病毒转移载体 pVL1392中 .重组转移载体 pVL1392 dSCF与野生型苜蓿夜蛾核型多角体病毒AcNPVDNA共转染草地贪夜蛾细胞Sf9,经胞内同源重组和 4轮筛选获得纯净的重组病毒AcNPV dSCF .重组病毒感染Sf9单层培养细胞时 ,主要以分泌形式表达二连体蛋白 ,经MTT比色法测得dSCF的表达量约为 1180units/3× 10 6cells .WesternBlotting鉴定了昆虫细胞表达的重组人二连体干细胞因子 (rhdSCF) ,两种主要产物的分子量分别为 4 0kDa、4 9kDa .     

小鼠细小病毒VP2蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达和免疫原性分析

目的 利用杆状病毒表达系统合成重组小鼠细小病毒(MVM)VP2蛋白，并对其免疫原性分析。方法 将优化后的MVM VP2序列克隆至表达载体pFastBac1,命名为pFastBac1-MVM VP2,再将其转化至DH10Bac感受态大肠杆菌中形成重组杆粒，提取重组杆粒经PCR鉴定正确后转染昆虫细胞Sf9,镜下观察到细胞明显病变后收获重组杆状病毒rBac-MVM VP2。Sf9细胞接重组病毒48和72 h后，用间接免疫荧光(IFA)和蛋白免疫印迹(Western blot)法验证重组蛋白的免疫原性。结果 构建的rBac-MVM VP2重组杆状病毒感染Sf9细胞后，可成功表达MVM VP2重组蛋白，经Western blot和IFA检测分析，重组蛋白具有较好的免疫原性且在病毒感染72 h时表达量较高。经蛋白纯化后可得到纯度较高的VP2重组蛋白。结论 本研究利用昆虫细胞-杆状病毒系统成功表达MVM VP2蛋白并具有良好的免疫原性，为VP2相关功能的研究和临床诊断方法的建立奠定基础。     

重组人神经生长因子昆虫表达载体的构建及表达

目的:构建重组人神经生长因子(rh-NGF)杆状病毒表达载体,转染昆虫细胞从而获得目的蛋白的大量表达.方法:从人胎盘组织中提取细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增-NGF基因片段,经BamHI、HindⅢ双酶切后插入杆状病毒表达载体pFastBacTMDual的多克隆位点处,构建出重组载体pFastBacTM-Dual+[rh-NGF].对构建的载体进行PCR和酶切鉴定并测序.采用脂质体转染方法将表达载体转入昆虫细胞系Sf9中,通过双抗夹心ELISA对rh-NGF的表达进行检测.结果:构建的rh-NGF基因插入正确且序列与GenBank一致.ELISA检测结果显示病毒感染的Sf9细胞可表达rh-NGF.结论:成功构建出杆状病毒表达载体pFastBacTMDual+[rh-NGF],并在昆虫细胞系Sf9中得到表达,为大量制备重组人神经生长因子奠定了基础.     

HPV16 E6基因真核表达载体的构建

本研究目的是构建HPV16 E6真核表达载体,为细胞转染研究E6蛋白和p53Arg或p53Pro蛋白的相互作用以及作用后对细胞功能的影响奠定基础。应用PCR技术从质粒pSP64-HPV16 E6上扩增出HPV16 E6片断。根据Kozak序列对真核蛋白表达的影响,设计2条引物扩增出2个HPV16 E6目的片断均插入真核表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）A中,构建pcDNA3．1／myc-His（-）A．HPV16 E6重组质粒。研究结果显示：经酶切和测序鉴定克隆的基因片段为HPV16 E6 cDNA;建立了pcDNA3．1／myc-His（-）A-HPV16 E6重组质粒。这表明,已成功构建HPV16 E6真核表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）A-HPV16 E6。     

新疆汉族乳腺癌及乳腺良性病变组织中HPV16E6的半巢式PCR检测

了解新疆地区汉族乳腺癌及乳腺良性病变组织中人类乳头状瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染的情况,探讨乳腺癌及乳腺良性病变是否存在HPV16感染及HPV16感染与乳腺癌发病之间的关系.采用半巢式PCR(semi-nested polymerase chain reaction)技术检测80例乳腺癌及60例乳腺良性病变组织中HPV16感染的情况.结果 80例乳腺癌病例中,有22例(27.5%)检测到HPV16的DNA片断;60例乳腺良性病变中,有2例(3.3%)检测到HPV16的DNA序列,检测结果作χ2检验,χ2=14.10,P<0.001,差异有统计学意义.新疆汉族乳腺癌及乳腺良性病变存在HPV16感染,HPV16在乳腺癌的发病中发挥着一定的作用.     

人乳头瘤病毒HPV16E6的表达促进角质生成细胞凋亡的发生

为探讨HPV16早期基因E6的表达对角质生成细胞NIKS凋亡表型的影响及可能的机制,经培养稳定表达HPV16E6的角质生成细胞NIKS;使用不同的DNA损伤剂处理转染后细胞,流式细胞术检测细胞凋亡情况;建立表达HPV16E6突变体Y54D及F2V的p53降解缺陷型NIKS细胞系并用DNA损伤剂处理,流式细胞术检测凋亡情况.研究显示,流式细胞术结果显示稳定表达E6的细胞系在足叶乙甙、丝裂霉素及紫衫醇处理后发生明显的细胞凋亡;表达Y54D或F2V的NIKS细胞经DNA损伤剂处理后凋亡明显低于正常E6表达细胞.研究表明,人乳头瘤病毒E6的表达能够促进角质生成细胞凋亡的发生,这种促凋亡作用与细胞内p53的表达相关.     

58型HPV E6蛋白的原核表达与分离纯化

宫颈癌是一种在女性人群中的常见肿瘤,严重威胁着女性的生理和心理健康;而人类乳头瘤状病毒(HPV)的长期感染是宫颈癌发生的主要诱因.因此,HPV病毒的研究对于我们了解和防治宫颈癌有着十分积极的意义.目前,国外的研究比较多的针对于16型和18型的HPV病毒;但是对于我国比较常见的58型HPV病毒却研究甚少.所以,本试验依据实验室现有的表达纯化平台和噬菌体展示多肽筛选平台,设计并构建了HPV58 E6蛋白的原核表达体系,并对E6重组融合蛋白进行了诱导表达.通过对表达获得的包涵体蛋白进行反复的洗涤、亲和层析以及复性等纯化步骤,得到了纯度较高的E6融合蛋白.     

胞外ATP对VK2/E6E7细胞胞内pH的影响

 利用激光扫描共聚焦显微镜（Confocal microscope）采用pH依赖的荧光探针Snarf-4F测量细胞胞内pH(pHi)方法,发现胞外ATP能剂量依赖（10~1 000 μmol/L）地降低人阴道上皮细胞株VK2/E6E7细胞pHi。当胞外加入200 μmol/L ATP时,能快速地使VK2/E6E7细胞pHi降低,此降低的pHi在洗脱ATP后可迅速恢复。这些结果表明胞外ATP能引起VK2/E6E7细胞胞内酸化。     

HPV 58型E7蛋白特异结合多肽的筛选及分析

 利用M13噬菌体展示技术筛选HPV 58型E7蛋白特异性结合12肽,对这些多肽的序列比对分析得出其共有序列,同时通过BLASTP序列对比分析获得能与E7结合的内源蛋白.利用GST-E7融合表达蛋白为正筛靶分子,GST蛋白为负筛靶分子进行4轮的正负亲和筛选,经过ELISA活性鉴定获得71株阳性克隆,通过DNA测序和序列分析,得到2个能与E7蛋白发生特异性结合的共有序列NHXXANPQQXPQ和TMGFTAPRF-PHY.通过BLASTP分析所有71个多肽在体内的同源蛋白,它们能为对E7蛋白的致癌机理研究提供方向.     

宫颈癌中CALCA基因甲基化与HPV16-E7致癌蛋白表达的依存关系

 选择HPV16 阳性宫颈癌细胞和RNAi 技术,研究CALCA 基因甲基化与HPV16-E7 致癌蛋白表达的依存关系。构建慢病毒siRNA 重组表达载体,建立稳定表达HPV16-E7-siRNA 的RNAi 细胞模型。以SiHa 细胞和RNAi 细胞模型的基因组DNA 为对象,选择CALCA 基因启动子区富含CpG 岛屿的目标片段,使用亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）筛查分析,研究RNAi 抑制HPV16-E 7 表达后,CALCA 基因甲基化状态的可逆性程度。选出CALCA 基因启动子区富含CpG 位点的目标片段,其大小为365 bp,含有19 个CpG 岛屿,发现其中13 个CpG 位点的胞嘧啶在SiHa 细胞基因组DNA 中发生了甲基化（13/19）,而在表达HPV16-E7-siRNA 的RNAi 细胞模型中,所有CpG 位点的甲基化已发生逆转（0/19 位点）。本研究从细胞水平证明了宫颈癌细胞内的CALCA 基因启动子高甲基化对HPV16-E7 致癌蛋白表达有依赖性,为进一步研究E7 蛋白的作用及致癌机制奠定了重要的物质基础。     

HPV16E7-HSP70 Hybrid DNA Vaccine Induces E7-Specific Cytotoxic T Cells and Antitumor Immunity

0 IntroductionInbroicguhltat einxpge cDtaNtiAonvafcocri nper eivse ant ninegw aanpdp cruoraicnhg wdiits-heases . Due to the comparative weakness of cellulari mmunity that is purely induced by E7 DNA vac-cine,research on DNA vaccine is now focused onhowto enhance the i mmunogenicity of DNA vac-cine.It has been found in some research that thestrength of cellular i mmunity activity has things todo with the speed of antigen molecules’degrada-tion,i .e.the faster the degradation,the higher th…     

小鼠Pem-GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达

目的：为制备重组小鼠Pem（以下简称mPem）-谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白，作为研究mPem蛋白功能的材料，方法：根据携带小鼠Pem基因编码序列的模板质粒pEGFP/mPem设计合成特异性引物，PCR扩增小鼠Pem基因编码序列，并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-3中，得到重组表达质粒pGEX-4T-3/mPem，用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞，IPTG诱导重组菌表达mPem蛋白，SDS-PAGE及Western Blot鉴定表达产物。结果：重组菌株明显诱导表达出预期相对分子质量49000的融合蛋白。结论：成功构建了mPem-GST原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达出mPem-GST融合蛋白，为mPem蛋白功能的研究打下了基础。     

重组人截短型IL—6表达载体的构建及表达

旨在建立人截短型IL-6原核高效表达系统。用PCR方法获得截短的人IL-6基因（rhIL-6cDNA）,将其插入克隆载体pUC18中,经证实后再克隆入表达载体pBV220中,鉴定阳性表达载体。结果建立了截短型IL-6基因的克隆载体,经测序证实完全正确;构建了截短型IL-6的原核表达质粒pBV220/rhIL-6并获得高效表达;初步纯化的表达蛋白的比活性为5×10