高通量筛选ENU诱变产生的遗传疾病小鼠模型

由于小鼠和人类基因组的高度同源, 修饰和改造小鼠基因组已经成为建立人类疾病模型和研究基因功能的最重要的手段. 通过C57BL/6J雄性小鼠的ENU化学诱变和子代的表型筛选的方法, 对G₁代3172只小鼠的形态学、行为学、神经功能、学习记忆、听力、视觉生理、骨代谢、血糖和心功能等一系列生理生化指标进行了高通量检测, 筛选出595只与人类疾病相关的显性基因突变个体, 其中毛色转换、眼疾和听力缺陷发生频率较高, 而代谢性异常的显性突变率较低, 提示血糖和心电等重要代谢功能的遗传调控稳定性高于外周神经系统功能. 小鼠单侧性眼疾存在明显的雌雄不均一性和左右不对称性. 骨密度异常与小鼠性别也有一定相关性. 在对104只G₁代突变小鼠和野生型小鼠交配的可遗传性检测中, 已有14只的异常表型被确认可以遗传, 其中行为学异常小鼠的可遗传性较低, 提示行为学异常可能和多基因突变相关. 这些突变小鼠品系的建立, 为疾病表型的发生和病理过程的细胞生物学及分子生物学机制研究、突变基因的染色体定位和克隆奠定了良好的基础.     

用ENU诱变产生斑马鱼胚胎发育突变体

斑马鱼作为一种脊椎动物发育模型，正越来越受到重视。用ENU诱变的方法，建立了320个斑马鱼F2家系。通过对F3代胚胎的表型观察，鉴定在外包、体轴、体节、头部、心血管系统等表现异常的突变体。目前已获得35个突变品系，其中以体轴和体节异常的突变体为主。这些突变体斑马鱼品系的建立为克隆突变的基因、研究胚胎早期发育机制打下了良好的基础。     

ENU诱变获得4种白斑小鼠及对突变基因的染色体定位

“表型驱动法”是通过诱变、定位及克隆突变基因来研究基因功能的一种手段. 以ENU处理C57BL/6J(B6)雄鼠150只, 繁殖后代小鼠3860只, 筛查到有突变表型的小鼠210只, 经传代实验得到能够遗传的突变鼠10余种, 其中4种为呈显性遗传的白斑突变, 它们是Wbct, W^−1Bao, W^−2Bao和W^−3Bao, 共同表现为腹部、四肢末端及尾部的局部白化. 为定位这些突变基因, 选择平均分布于小鼠基因组且在B6与DBA/2J(D2)间有差异的微卫星标记39个, 区分(B6×D2)×D2的F₂代有无白斑表型后, 用39个微卫星进行基因组扫描. 结果表明, W^−1Bao突变基因与D5Mit168的LOD值为0.56, 与D5Mit352的LOD值为4.47. 在此基础上, 逐步选择接近突变基因的微卫星D5Mit290, D5Mit312, D5Mit356及D5Mit308, 扩大F₂的数量至537只, 将W^−1Bao突变基因定位在第5号染色体D5Mit356及D5Mit308之间, 距着丝粒约42.19 cM; 同理, 将W^−2Bao及W^−3Bao突变基因也定位在与W^−1Bao相近的区域, Wbct突变基因定位于第1号染色体距着丝粒约41.6 cM处. 经过检索小鼠基因组数据库和对染色体局部基因的逐个分析, 认为kit基因为W^−1Bao, W^−2Bao及W^−3Bao白斑突变的候选基因.     

用ENU诱导斑马鱼突变的初步研究

斑马鱼作为一种脊椎动物发育模型, 正越来越受到重视. 用ENU诱变的方法, 建立了320个斑马鱼F2家系. 通过对F3代胚胎的表型观察, 鉴定在外包、体轴、体节、头部、心血管系统等表现异常的突变体. 目前已获得35个突变品系, 其中以体轴和体节异常的突变体为主. 这些突变体斑马鱼品系的建立为克隆突变的基因、研究胚胎早期发育机制打下了良好的基础.     

小鼠精子捕获外源DNA的研究

随着遗传工程研究的发展,现今已有多种方法实现外源基因向受体细胞的转移。较常用的方法有显微注射法和反转录病毒载体等方法。但晚近Lavitrano等报道用精子作为外源DNA的载体可以生产转基因动物。这一报道引起了国内外学者的广泛关注。一些作者试图重复这一实验,但至今还没有成功的报道。虽然如此,至今并不能排除精子作为外源DNA的载体的可能性。对这一问题的研究,至少具有以下三方面的意义。第     

小鼠肿瘤及正常器官微血管早期光动力学损伤的超微结构研究

光动力学疗法是一种新的肿瘤冶疗手段,近年来发展迅速,受到广泛重视。但其肿瘤杀伤的体内作用机理尚未完全阐明。许多研究结果表明,光动力学治疗后肿瘤坏死主要是由于血管损伤引起的组织缺氧所致。光动力学作用后,早期常可见到明显的血管改变、血流减缓以至完全停滞。但目前对发生这种变化的原因所知甚少,本文选用小鼠肝癌(Hep A)与LA-795     

《科学》:2014年值得关注的研究领域

<正>临床基因组2014年,越来越多的研究人员——甚至包括一些医生——将要求知晓病人完整的基因组序列或被称为外显子的蛋白编码DNA。其结果可能有助于诊断罕见疾病和确认癌症疗法。有不少研究将探讨测序是否应成为新生儿筛查的一部分,甚至用来指导对健康人群的医疗服务。迄今最雄心勃勃的临床测序项目中,英国将启动为期4年对10万名病人(大多患有癌症和罕见疾病)的基因组测序计划,便于指导对他们的治疗。如果测序得到"易发病"的结果是否该告知病人,目前正在争论中。     

HBeAg阴性小鼠模型的研究现状与展望

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是全球肝病的重要原因之一,全球约有2.5亿患者感染HBV.其中,慢性HBV感染将导致肝纤维化(liver fibrosis),肝硬化(liver cirrhosis, LC)甚至肝细胞癌(hepatocellular carcinonma,HCC). HBV感染的临床进程可分为乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)阳性和HBeAg阴性两个阶段.而长期携带和难以清除的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)是两个阶段共同的固有特征.慢性HBV感染不能完全治愈,其致命原因是没有有效药物能彻底清除cccDNA;严重瓶颈是无理想的实验动物模型,尤其是针对HBeAg阴性cccDNA小鼠模型.目前, HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者在全球范围内呈逐年上升趋势,本文就cccDNA的重要性、HBeAg基因结构及HBeAg转阴机理、HBeAg阴性cccDNA小鼠模型的研究现状与未来的应用前景进行简要述评.     

小鼠眼角膜上皮细胞中IL-1Β对Fas配体的表达调控研究

Fas配体(Fas Ligand, FasL)在多种不同的上皮细胞中均见表达, 在炎症反应中诱导Fas阳性免疫细胞凋亡以保护组织. 为了研究眼角膜炎症反应过程与Fas配体之间的关系, 本研究检测了在眼角膜上皮细胞中IL-1β对FasL的表达翻译水平以及细胞毒性的影响, 明确了在眼角膜上皮细胞中IL-1β抑制FasL的表达以及蛋白翻译, FasL的启动子活性受到IL-1β作用浓度的影响, 两者呈相关性表现, 发现IL-1β阻断由FasL诱导Fas阳性细胞对于眼角膜上皮细胞的细胞毒性作用. 这些结果表明, 眼角膜上皮细胞FasL受IL-1β的调控.     

脑复新与丹参等对小鼠脑水肿和缺氧治疗效果的实验研究

我所应用脑复新(Neuroxine,Pyritinol)和丹参、川芎(Salvia Miltiorrhiza,Ligusticum Wallichii)提取液等综合疗法,曾先后成功地抢救颅脑外伤长期昏迷患者多人,其中有长达98天和142天者。临床实践提示,这些药物对脑功能恢复有一定效果。本工作利用小白鼠缺氧动物模型和脑水肿动物模型,对其作用特点进行进一步分析研究。     

两性小鼠核移植胚胎干细胞系的建立及其在胚胎干细胞多能性评估中的研究

治疗性克隆的安全性与风险性是阻碍治疗性克隆发展的关键环节之一. 由于受到社会伦理问题的限制, 人胚胎干细胞的多能性检测只能通过畸胎瘤的方式鉴定, 与传统的小鼠生殖系嵌合鉴定方式不同. 但是两种多能性检测方式之间的区别还不清楚. 本研究利用遗传突变两性小鼠心肌成纤维细胞作为核移植供体细胞, 构建核移植胚胎, 经过体外培养获得克隆囊胚, 建立核移植胚胎干细胞系. 对胚胎干细胞系的鉴定结果表明, 两性小鼠核移植胚胎干细胞系表达所有小鼠胚胎干细胞系多能性及特异的分子标记, 如碱性磷酸酶活性, Oct4, Nanog, SSEA-1等, 干细胞注射到免疫缺陷小鼠(SCID)体内能够形成含有三胚层分化附属物的畸胎瘤组织, 证明两性小鼠核移植胚胎干细胞系具有多能性. 但通过囊胚注射的方式获得的二倍体嵌合小鼠经过交配不能获得生殖系嵌合的小鼠, 因而两性小鼠核移植胚胎干细胞系并不具有全能性, 说明体内形成三胚层分化附属物的畸胎瘤组织并不能替代传统的生殖系嵌合, 提示在人治疗性克隆胚胎干细胞系多能性鉴定中, 仍然需要更多、更严格的标准, 进而最大程度地降低治疗性克隆临床应用的风险性.     

小鼠β-簇珠蛋白基因LCR调控元件中DNase-I超敏感点Ⅲ(HS3)的研究

人与小鼠β-簇珠蛋白基因在结构与表达模式上存在极大的相似性.基因簇5’上游20kb内是一个Locus control region(LCR)顺式元件,由4个DNase-Ⅰ超敏感区(HSs)组成.相关的研究工作表明LCR对β-簇珠蛋白基因的红系组织专一性表达有重要作用,它的插入或缺失突变将导致基因表达的紊乱,甚至造成严重的贫血症状.近年来,人们对研究LCR调控元件在β-簇珠蛋白基因发育时期特异性表达中的调控机制给予了极大的关注.希望了解LCR元件中不同的HS是否参与β-簇珠蛋白基因的时期特异开关调节.转基因小鼠研究结果表明人LCR元件中HS3可能与发育早期的胚胎型珠蛋白基因的表达调控相关,但近来有关报道表明小鼠的HS3不为β-簇珠蛋白基因的开关所必需,并且仅部分参与了成年型的β-簇珠蛋白基因的调控.因此,HS3是否参与β-簇珠蛋白基因发育时期特异性的调控尚不完全清楚.     

小鼠早期受精胚细胞核诱导成熟卵母细胞Ca2+释放活性的研究

在受精过程中，哺乳动物卵子细胞内的钙离子浓度呈现连续性反复升高，有证据表明；将受精的1-和2-细胞期的胚胎细胞核移植到未受精卵中能导致卵子产生钙升高并使该重构胚激活，然而，尚不清楚胚胎细胞核这种诱导卵子内钙升高的能力是如何获得的，是否处于不同发育阶段的早期胚胎细胞核都具有这种能力，利用细胞核移植技术，将小鼠受精早期胚胎细胞核移植到成熟卵母细胞中，并测定该重构胚细胞内钙含量变化，结果表明，受精1-和2-细胞期的细胞核具有诱导成熟卵子钙释放活性的功能，而4-和8-细胞期细胞核，融合的2或3个4-细胞期的细胞核及乙醇孤雌活化的原核均不具有这种能力，结果说明，胚胎细胞核诱导卵子细胞内钙升高的能力是受精过程中产生的，是受精胚特有的，它存在于早期受精胚的特殊发育阶段，这暗示早期受精胚这一特有的能力对胚胎的正常发育具有重要意义。