基于多重长PCR靶向捕获测序技术的高同源SNP鉴定

为建立一种高同源区段的单核苷酸多态性(SNP)基因分型技术,通过构建本地Blast对SNP所在的200和400 bp区段进行同源性评估,并筛选出高同源区段的SNP。利用第一轮多重长PCR(polymerase chain reaction)捕获329个样本的9个高同源区段SNP所在的长片段,使用纯化后的第一轮PCR产物作为模板进行扩增子建库测序,检测样本共得2 928个SNP位点信息,测序成功率高达98.885 6%。利用Hardy-Weinberg(HWE)法则计算试验研究的9个高同源区段SNP位点的基因频率(p值均大于0.05,符合HWE法则),并与NCBI(national center for biotechnology information)中千人基因组数据库中获取的基因频率相比对,发现二者单碱基基因频率一致(误差限<0.15)。研究表明,利用多重长PCR靶向捕获技术结合二代测序技术为高同源区段的SNP分型提供一个准确、快速、大样本检测方案。     

新疆维吾尔族人TNFβ-804基因多态性与乙型肝炎易感性的相关性研究

目的：研究TNF-β基因单核苷酸多态性（SNP）804位点与新疆地区维吾尔族人乙型肝炎之间的关系。方法：用套式PCR（nested PCR）和等位基因特异性PCR（allele一speciicfic PCR,AS-PCR）法,对120例乙肝患者和120例正常对照者TNF-β基因SNP804多态性位点进行基因分型。结果：SNP804多态性位点C/C基因型和C/A＋AA基因型频率在病例组为77%和23%,正常对照组为88%和12%,两组间基因型和等位基因频率分布差异有显著性（p〈0.05）。结论：TNF-β804多态性位点与新疆维吾尔族人乙肝有明显相关性。     

新疆维吾尔族人TNFβ-804基因多态性与乙型肝炎易感性的相关性研究

目的:研究TNF-β基因单核苷酸多态性(SNP)804位点与新疆地区维吾尔族人乙型肝炎之间的关系。方法:用套式PCR(nested PCR)和等位基因特异性PCR(allele一speciicfic PCR,AS-PCR)法,对120例乙肝患者和120例正常对照者TNF-β基因SNP804多态性位点进行基因分型。结果:SNP804多态性位点C/C基因型和C/A+AA基因型频率在病例组为77%和23%,正常对照组为88%和12%,两组间基因型和等位基因频率分布差异有显著性(p<0.05)。结论:TNF-β804多态性位点与新疆维吾尔族人乙肝有明显相关性。     

翘嘴鳜淀粉酶基因SNPs和微卫星位点多态性的检测

本研究主要检测翘嘴鳜淀粉酶(amylase,AMY)基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)和微卫星位点多态性.实验采用PCR产物直接测序法(PCR-direct sequencing,PCR-DS)检测翘嘴鳜AMY基因组序列的SNPs和微卫星位点,并使用创造限制酶切位点PCR法(created restriction sites PCR,CRS-PCR)和PCR-DS法对SNPs进行分型,应用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测AMY基因微卫星位点的多态性.实验结果发现AMY基因第1内含子有一个SNP位点A1,第5内含子有3个SNPs位点(A2、A3和A4);此外,第5内含子中还存在一个微卫星位点B1,共检测到4个等位基因,有9种单倍型.在翘嘴鳜群体中,4个SNP位点呈中度遗传多样性,而微卫星位点表现出高度遗传多样性.     

基于RAD-seq技术的鹅掌楸基因组SNP标记开发

【目的】开发大量可靠的SNP标记,为鹅掌楸高密度遗传连锁图谱的构建和基于基因组的林木选择育种提供分子基础。【方法】从北美鹅掌楸NK基因型为母本、鹅掌楸LS基因型为父本的F1代杂交群体中,选取198株个体为作图群体。用限制性内切酶EcoR I对包括2个亲本和198个子代在内的200个单株的基因组DNA进行酶切,构建RAD(restriction-site associated DNA)文库并进行RAD-seq测序。采用读长为91 bp的双末端测序。2个亲本的平均测序深度为2×,198个子代的平均测序深度为0.8×,平均产量为1.94 Gb,共获得约387.21 Gb数据。用Stacks软件将每个样品的RAD-reads作生物信息学分析,对候选位点进行卡方检验和缺失率检验,再将符合孟德尔遗传的标记及与之相对应的RAD-tag序列和鹅掌楸参考基因组序列进行比对。最后,从本研究开发的SNP标记中选取27个候选SNP位点,设计引物,对随机挑选的16个F1代进行PCR扩增并将结果进行测序,同时验证SNP的有效性。【结果】从候选群体中共鉴定到22 019个SNP位点,符合孟德尔遗传规律的标记为4 233个,最终获得3 501个候选SNP标记。SNP验证中,共有293个SNP标记完成测序并能判读结果,所有位点都为SNP位点,共有194(66.2%)个SNP变异类型得到了验证。 【结论】基于RAD-seq技术和鹅掌楸参考基因组序列为基础的策略,能够作为一种快速有效的手段,实现大规模的分子标记开发,可用于鹅掌楸等林木的高密度遗传图谱的构建。     

Calpain 10基因与新疆维吾尔族2型糖尿病遗传易感性研究

研究Calpain 10基因单核苷酸多态性（SNP）43G-A和63C-T两个位点与新疆地区维吾尔族人群2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）之间的关系。采用1∶1病例——对照研究方法,以聚合酶链式反应——限制性内切酶长度多态性（PCR-RFLP）技术,对120例T2DM患者和120例正常对照者Calpain 10基因SNP43、SNP63多态性位点进行基因分型。SNP43多态性位点的基因型和等位基因频率在病例组和正常对照组中的分布存在差异,T2DM组中GG基因型和等位基因频率均低于对照组,但是A等位基因频率高于对照组,差异有统计学意义（P〈0.005）;SNP63多态性位点的基因型频率和等位基因频率在病例组和正常对照组中的分布无显著差异,（P〉0.005）。结果表明：（1）Calpain 10基因SNP43多态性位点与新疆地区维吾尔族人群T2DM有明显相关性;（2）SNP63多态性位点与新疆地区维吾尔族人群T2DM无明显相关性。     

齐兴肉兔和伊拉兔MC4R、GHR基因SNP的检测

为了探索兔黑素皮质素受体-4 (MC4R)、生长激素受体(GHR)基因的部分单核苷酸多态性(SNP)及其与不同兔品种生长速度之间的关联,试验采用Chelex 100从齐兴肉兔和伊拉兔(n=60)血中快速提取基因组DNA,用PCR扩增MC4R、GHR基因部分片段并直接测序.结果发现:两品种兔GHR基因检测出1个SNP位点g.63343609 TG,为同义突变,该位点仅检测到G等位基因;MC4R基因检测出5个SNP且均为同义突变,各个位点的基因型频率在齐兴肉兔和伊拉兔之间存在不同程度的差异.推测MC4R基因的单核苷酸多态性可能与兔的生长速度有关联.     

BMP7基因多态对大白猪生长性状的影响

目的为了筛查猪BMP7基因SNP位点及分析其对猪生长性状的影响。方法通过PCR产物测序确定BMP7基因外显子上的5个潜在多态位点,用sequenom法对实验猪群进行基因分型并开展基因型与猪生长性状的关联分析。结果在BMP7基因5个潜在SNP位点中检测确定了2个SNP位点:A83509G和G84966A,且均属错义突变。A83509G位点AA型校正达100 kg日龄显著低于AG型和GG型(P0.05),GG型校正达100 kg眼肌面积显著高于AG型(P0.05); G84966A位点GG型校正达100 kg日龄和达100 kg眼肌面积都显著高于AA型(P0.05);在A83509G和G84966A位点单倍型中,AGGA、AAAA型个体校正达100 kg日龄显著低于AGGG基因型个体(P 0.05); AGGA基因型个体校正达100 kg眼肌面积显著高于AGAA基因型个体(P0.05)。结论 A83509G、G84966A变异位点对大白猪眼肌面积及生长速度具有显著影响,可作为猪生长性状选择的潜在分子标记。     

TaqMan技术在原发性高血压候选基因ACE多态位点分型上的应用

利用TaqMan技术对原发性高血压候选基因--ACE基因4504位的G/C多态进行大样本分型,结果发现C等位基因与高血压有显著相关性(P<0.05). 提示ACE基因和原发性高血压的发生有着密切关系. 同时摸索建立一高通量SNP分型的操作平台.     

黄姑鱼转录组SSR的开发与验证

利用MISA软件对黄姑鱼转录组测序数据进行分析,共检索到微卫星(simple sequence repeats,SSR)位点12 254个,其中单碱基、二碱基、三碱基重复分别约占42.70%、32.11%、23.44%,四碱基、五碱基、六碱基重复仅分别约占1.60%、0.09%、0.06%。随机选出80个二至六碱基重复来设计PCR引物,有38对引物通过扩增可获得目的条带。利用南海海区野生黄姑鱼样本对其中的18个具有多态性的SSR位点进行扩增效果验证和评价,结果显示:18个SSR的平均等位基因数为7.67,平均有效等位基因数为4.571,平均观测杂合度为0.3984,平均期望杂合度为0.7518,平均多态信息含量为0.6799,其中有15个位点表现出高多态性(多态信息含量0.5)。与传统方法相比较,利用转录组测序数据开发微卫星标记更加省时、高效。     

用SnaP Shot的方法对线粒体7146位点进行基因分型

利用SNaP SHot的方法对线粒体7146位点在7300人的样品中进行基因分型，这个位点在非洲人群中存在2种等位基因，但是在非洲人群中仅存在突变型，这个研究对利用线粒体研究人类进化，特别是对东亚人群的起源有较大的应用价值，同时还建立了一套大规模，高通量的SNP分型技术平台。     

拉布拉多犬与金毛猎犬毛色基因MC1R(R306ter)与TYRP1(Q331ter)SNP位点的检测

目的建立犬毛色基因MC1R R306ter(c.C916T)与TYRP1 Q331ter(c.C991T)SNP位点的检测方法。方法采用PCR/测序的方法,对19只拉布拉多犬和15只金毛猎犬的MC1R基因c.C916T SNP位点及TYRP1基因c.C991T SNP位点的多态性进行检测,根据MC1R和TYRP1的多态性对犬的毛色基因型进行分析。结果 PCR/测序法能够对TYRP1基因c.C991T SNP位点进行明确和有效的检测。但MC1R基因c.C916T SNP位点的测序结果出现了特殊峰,经克隆/测序法确认该特殊峰型为杂合性SNP位点。毛色基因型分析表明,金毛猎犬的毛色基因型皆为纯合的eeBB(15只),未见其他基因型。拉布拉多犬的毛色基因型分别为:黑色犬EeBB(6只)、EeBb(2只);黄色犬eeBB(9只)、eeBb(2只)。未发现其他如EEBB和EEBb(黑色)、eebb(黄色)的毛色基因型。另外,拉布拉多犬样本中没有巧克力色犬,也未检测出其相应的Eebb和EEbb基因型。结论本研究成功建立了犬毛色基因MC1R R306ter(c.C916T)与TYRP1 Q331ter(c.C991T)SNP位点的检测方法,为分析毛色基因型与导盲犬培训成功率之间的相关性提供了前期工作基础。     

应用24个微卫星标记分析SD和Wistar大鼠的遗传多样性

目的 通过SD和Wistar大鼠群体遗传多样性分析,为其质量控制提供基础数据。方法 采用微卫星DNA标记技术,选取分布于21条染色体上的24个微卫星位点分别对12对SD大鼠和Wistar大鼠的DNA样本进行PCR扩增,所得扩增产物经二代测序分型,再利用PopGen32软件、Littleprogram0.6和GenePop分别进行等位基因、平均杂合度、多态信息含量及遗传平衡检验参数的计算。结果 SD和Wistar大鼠群体分别在24个微卫星位点检测到平均等位基因数3、2.95个,平均杂合度为0.434 4、0.426 1,平均多态信息含量分别为0.38、0.37,分别有10、9个位点偏离了Hardy-Weinberg遗传平衡,其中7、4个位点表现为杂合子缺失。结论 SD和Wistar大鼠封闭群遗传多样性略低于理想封闭群水平,需要在种群繁育中注重科学管理监测,避免近交。     

舟山带鱼线粒体COI基因SNP位点分析

为探讨舟山带鱼种质状况,本研究利用直接测序法对舟山带鱼线粒体COI基因进行SNP挖掘分析,获得长度一致的985 bp基因片段,检测到22个SNP位点,对SNP位点在样品中分布情况分析,发现部分SNP位点分布情况类似甚至完全相同,推测基于线粒体COI基因片段不同位点突变可能存在关联性。     

成都动物园野生动物源贾第虫的多位点基因分型鉴定

为了解四川省成都市动物园野生动物贾第虫的流行及基因型,本研究采集了146份不同野生动物的新鲜粪便并提取基因组DNA.通过巢式PCR扩增β-giardin、tpi和gdh基因,扩增产物测序后进行种系发育分析.结果表明,CDZOO1黇鹿源和CDZOO3龟源贾第虫通过多位点基因分型(MLG)鉴定为AI-1亚型;CDZOO2鹿源贾第虫为E型(β-giardin基因位点);CDZOO4黇鹿源贾第虫为A型(β-giardin和tpi基因位点);CDZOO5浣熊源和CDZOO6细尾獴源贾第虫在β-giardin位点为D型而在tpi位点为A型.     

白细胞介素-10基因的3个单核苷酸多态性位点与慢性乙型肝炎病毒感染后炎症程度的相关性分析

为探索白细胞介素-10(IL-10)基因单核苷酸多态性(SNP)与慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染后炎症程度的相关性,基于212名划分为轻度肝炎组(对照组,151例)和中、重度肝炎组(病例组,61例)的HBV感染者,对IL-10基因的3个SNP位点进行基因分型,比较等位基因、基因型及单倍型在两组间的分布差异;建立遗传模型...     

绵羊X染色体59327581位点在3种不同尾型绵羊品种中的多态检测及分析

脂尾（臀）性状是绵羊逆境生存之需的必要性状,其在尾臀部位大量囤积脂肪的分子机理仍不明晰。为此,本研究以国外新近报道的X染色体一处可能与尾脂性状关联的SNP为研究对象,检测该位点在我国尾型极端差异的阿勒泰羊、湖羊以及细毛羊群体中的多态性,并验证该位点是否可作为1个有效的分子标记应用于低脂绵羊新品种培育。成功地扩增出了含绵羊X染色体59327581位点SNP的385bp片段,并采用PCR—SSCP方法进行SNP分型,后DNA测序只鉴定出1种基因型。结果表明,我国脂臀型阿勒泰羊、短脂尾型湖羊以及长瘦尾型中国美利奴羊在X染色体59327581位点处无多态性,说明我国绵羊X染色体59327581位点不能作为选育低脂绵羊品种的有效分子标记。     

新疆柯尔克孜族人群PPARG基因31个SNP位点的遗传多样性及其与2型糖尿病的关联

 应用基质辅助激光解吸附电离飞行时间(MALDI-TOF-MS)质谱技术对SNP 位点进行基因分型的方法,检测并分析100例(对照正常个体50 例,糖尿病患者50 例)无血缘关系的柯尔克孜族隔离人群过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)基因31个单核苷酸多态性(SNP)位点的遗传多样性,探讨PPARG 基因31 个SNP 位点的遗传多样性及其与柯尔克孜族2 型糖尿病(T2DM)的关联,筛查预测2 型糖尿病的分子标记。结果发现,PPARG 基因所选的31 个SNP 位点中有23 个具有多态性(MAF≥0.05)。两组间分别在血压(SBP、DBP)、腰臀比值、血糖、总胆固醇、低密度脂蛋白水平有显著差异(P<0.01)。rs1801282、rs1899951、rs2881654、rs2972162 位点基因分型在对照组和病例组中的分布均有显著性差异(P<0.01,P<0.05)。非条件Lo-gistics 回归分析显示,PPARG 基因中rs1801282、rs1899951、rs2881654、rs2972162 等位点变异等位基因频率组间比较差异均有统计学意义(OR 值分别为2.639、2.639、1.774、2.639,均为P<0.05)。在男女对照组中rs1899951、rs2292101、rs2881654、rs1801282 和rs6782475 位点等位基因频率均有显著性差异(P<0.05),在男女病例组中rs4684846、rs7615916、rs9817428、rs4684846、rs709151、rs7615916 位点等位基因频率均有显著性差异(P<0.05)。结果显示,PPARG 基因的4 个SNP(rs1801282、rs1899951、rs2881654、rs2972162)位点变异与柯尔克孜族人T2DM 可能存在关联。     

应用SNaPshot技术对桉树SNP的检测

【目的】SNaPshot是一种单核苷酸多态性(SNP)检测的多重分析技术,具有检测速度快、准确性高、成本低廉等特点。利用多重PCR技术,结合SNaPshot分型方法,在桉树中构建SNP复合分型检测体系,促进SNP技术在桉树遗传图谱构建和无性系鉴定的应用。【方法】利用桉树已有的EST序列设计引物,通过PCR产物直接测序进行SNP标记位点的开发,利用多重PCR技术和SNaPshot分型方法建立SNP复合分型检测体系,并在尾叶桉和细叶桉作图群体的两亲本和6个F₁子代,以及16个国内常用的桉树无性系中进行分型检测。【结果】共设计合成12对SNP引物,分为3组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)建立了SNP复合分型检测体系,SNP分型情况与测序结果一致。对桉树作图群体的两个亲本和6个F₁子代的分型结果进行统计,发现12个SNP标记在6个子代中均发生了分离; 对桉树无性系进行多态性的分析,期望杂合度(H_e)为0.11～0.51、观测杂合度(H_o)为0.11～0.56,多态性信息含量(PIC)为0.10～0.37,表现为中度或低度多态性。【结论】利用多重PCR和SNaPshot技术可以快速地对桉树进行基因分型,其结果准确可靠,可以用于桉树遗传图谱的构建以及桉树无性系的鉴定等方面研究。     

连接酶检测反应技术应用于乙型肝炎病毒拉米夫定耐药和阿德福韦耐药突变的研究

目的:研究高温连接酶检测反应技术(LDR)技术检测乙肝病毒拉米夫定耐药和阿德福韦耐药突变的可行性.方法:应用LDR技术和多聚酶链式反应(PCR)技术,在乙肝病毒基因相关区域设计引物和探针检测突变位点.结果:该方法能很好的区分野生型质粒和突变型质粒;90例临床样本的测序结果与LDR检测结果基本一致.结论:LDR技术可以应用于临床乙肝病毒样本的拉米夫定耐药和阿德福韦耐药的检测.