异源nifA基因对苜蓿中华根瘤菌nifA突变体的互补分析

为深入研究苜蓿中华根瘤菌NifA的特性, 分别用组成型表达的慢生型大豆根瘤菌和紫云英根瘤菌的nifA 基因互补苜蓿中华根瘤菌nifA 突变体, 观察其共生表型. 结果表明, 慢生型大豆根瘤菌和紫云英根瘤菌nifA 基因不能互补苜蓿中华根瘤菌nifA 突变体的共生表型. 以苜蓿中华根瘤菌 nifA 突变体为遗传背景, 利用全基因组微阵列实验比较分析引入异源nifA 基因后产生的基因表达谱的变化. 结果显示, 苜蓿中华根瘤菌自身NifA蛋白引起238个基因的表达发生变化. 这些表达差异的基因分属共生、能量和中心代谢、持家、细胞结构与运输等生物学功能组. 慢生型大豆根瘤菌、紫云英根瘤菌和阴沟肠杆菌的NifA蛋白分别引起了20, 7和9个基因的表达发生变化. 这些基因主要是固氮相关基因, 但差异不及苜蓿中华根瘤菌NifA互补菌明显. 以苜蓿中华根瘤菌nifH启动子与lacZ融合基因为报道基因, 研究nifH的表达. 结果指出, 慢生型大豆根瘤菌和紫云英根瘤菌的NifA蛋白只能部分激活苜蓿中华根瘤菌nifH的表达, 激活水平分别为苜蓿中华根瘤菌NifA蛋白激活率的70%和50%, 与微阵列实验结果相符.     

固氮正调节基因nifA促进大豆根瘤菌的结瘤效率

先前的工作指出nifA不仅调节niffix基因的表达,同时可能也调节包括根瘤形成和维持根瘤功能中的一些基因,通过在大豆根瘤菌Sinorhizobium fredii NH01中引入额外组成型表达的肺炎克氏杆菌（Klebsiella pneumoniae）nifA,研究固氮正调节基因nifA对共生结瘤过程的影响,研究结果发现,引入KpnifA可提高大豆根瘤菌的结瘤活力及竞争结瘤能力,同时初步试验结果证实,带额外nifA的大根瘤菌比野生型大豆根瘤菌具有更高的结瘤因子活性,推测nifA对结瘤过程的促进作用可能作用于根瘤菌的结瘤因子合成阶段,由于结瘤因子是诱导主形成根瘤的主要信号分子,而结瘤过程具有自我调节作用,植株一旦结瘤,就会抑进一步结瘤,因此引入固氮正调节基因nifA能提高结瘤效率。     

非豆科作物共生固氮的研究(Ⅱ)——根瘤菌与小麦共生结瘤的固氮酶活性

一、前言豆科植物和根瘤菌共生结瘤固氮是农业的主要生物固氮资源,但广大面积的非豆科粮食作物并不具有这种固氮自肥能力。因此,如何扩大根瘤菌共生固氮范围,使粮食作物也能结     

nifA突变的苜蓿根瘤菌在根瘤中的转录组学分析

用全基因组微阵列比较了根瘤中苜蓿根瘤菌1021的nifA突变菌和野生菌的基因表达谱. 分析结果表明, nifA的缺失引起601个基因的表达发生变化. 这些基因分别属于生物大分子的合成代谢、三羧酸循环及呼吸代谢以及结瘤固氮过程等多个功能组, 预示着根瘤中细菌的生长状态发生了显著的变化. 在根瘤中, fixK以及受其激活的基因在nifA突变菌中的表达量显著高于野生菌. 定量实时PCR分析表明, 根瘤中fixLJ的转录水平在nifA突变菌中显著高于野生菌. 通过统计学方法从13个表达发生显著变化的基因的上游调控序列中找到推测的NifA结合位点.     

大豆早期结瘤素基因enod2B启动子在水稻中的表达受结瘤因子诱导

在根瘤菌与宿主豆科植物形成的共生关系中, 根瘤菌分泌的结瘤因子是宿主专一性的主要决定因子. 结瘤因子信号能够诱导豆科植物根毛细胞质膜去极化、离子流动和早期结瘤素基因的表达以及根毛变形、皮层细胞分裂和根瘤原基形成等与共生有关的表型变化. 水稻是重要的粮食作物, 能否对结瘤因子信号产生应答反应是最终实现水稻结瘤固氮的关键因素. 将大豆早期结瘤素基因Gmenod2B的启动子与报告基因b-葡萄糖苷酶(GUS)基因融合构建成嵌合基因Gmenod2BP-GUS, 以此嵌合基因作为探索水稻细胞感受结瘤因子信号的分子标记. 通过根癌农杆菌介导的遗传转化系统, 获得了携带嵌合基因Gmenod2BP-GUS的水稻再生植株. 以广宿主根瘤菌NGR234(pA28)分泌的结瘤因子作为探针, 检测转基因水稻中嵌合基因Gmenod2BP-GUS的表达. 结果表明, 转基因水稻中大豆早期结瘤素基因enod2B启动子的表达可以受结瘤因子诱导, 仅在水稻根部的皮层薄壁细胞和内皮层细胞中呈特异性表达, 并且受到氮源的调控. 推测在水稻中可能存在结瘤因子所诱导的豆科早期结瘤素表达的类似机制.     

禾本科/豆科间作促进豆科共生固氮机理研究进展

综述以往研究发现,大多数禾本科/豆科间作都会显著增加豆科作物的固氮比例(%Ndfa),并认为这种增加是由于禾本科作物对豆科作物根际氮素的耗竭作用引发的.但豆科作物体内通常会在氮磷之间保持稳定的化学计量关系,豆科作物共生固氮的增加会使作物生长受到磷的限制.在这种磷素限制条件下豆科作物会被激发出潜在的磷吸收策略,即通过根系分泌物或丛枝菌根真菌增加对土壤磷素的获取满足其自身固氮对磷素的大量需求,进而增强豆科作物自身的结瘤及固氮.此外,随着分子生物学技术的发展,新近研究发现禾本科作物根系分泌物能上调豆科根部关键结瘤基因NODL4, ENODL2, ENOD93,固氮基因FixI3,查尔酮-黄酮异构酶CFI基因和生长素响应基因GH3.1的表达,这些基因超量表达可促进豆科作物类黄酮物质的分泌、根毛卷曲、结瘤并促进豆科作物固氮.间作作物间通过根际氮素耗竭作用、磷素活化作用以及固氮基因分子调控等三个层面上互相偶联来促进间作系统氮素吸收、优化氮素利用效率和提升作物产量,这些研究对促进和发展禾本科/豆科间作固氮理论体系具有重要指导意义.     

结瘤基因群调控蛋白Nod D在DNA分子上的结合位点的测定

豆科植物和根瘤菌协同进行共生固氮,是自然界将游离的N_2转化成有机NH_3的主要途径之一。共生固氮只有在根瘤内环境中才能进行。通过转座突变、重组克隆和转化等一系列实验后发现,共生固氮菌中存在着一群特定的基因——结瘤nod基因,它们引起植物根部结瘤,并决定寄主的专一性。不同根瘤菌内的nod基因数量虽然不同,但一般不超过十多个。     

苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti) nifA基因通过诱导宿主防卫反应调节根瘤的形成

苜蓿中华根瘤菌nifA基因是固氮基因的正调节因子, 本文研究了nifA基因对根瘤形成的调节作用. 在分裂根实验中, nifA突变株对另一侧根的结瘤抑制率比野生型菌下降43.7%, 感染突变株植物合成的植保素和形成的坏死细胞的数量也相应减少, 与植物防卫反应相关的苯丙氨酸解氨酶基因、查儿酮合成酶基因和几丁质酶基因不能表达. 这些结果说明, 苜蓿中华根瘤菌nifA基因通过诱导宿主植物的防卫反应对根瘤的形成进行调节. 虽然nifA突变株在宿主植物上引发根瘤的数量增加, 它合成的结瘤因子的量却比野生型菌株少. 因此, 可以推测nifA基因介导了多种信号途径对根瘤的形成进行调节.     

弗兰克氏菌固氮基因片段的分离及其比较

弗兰克氏菌和放线菌结瘤植物(actinorhizal plants)之间的共生与根瘤菌和豆科植物间的共生有很多相同点:如侵染过程、瘤结构形态和固氮效率等;但同时它又比根瘤菌有更广的寄主植物范围(涉及8科至少23属200多个种),远远超出了根瘤菌寄主范围的限制,因此被认为是研究有关共生基因特别是与寄主专一性有关的基因的很好的材料。自1978年第一株     

固氮细菌找到新寄主

研究人员促成了固氮根瘤菌到包括稻子在内的非豆科植物的根际安家结瘤.固氮根瘤菌是一种极其特别的细菌.除个别例外,它们只能在豆科植物例如大豆,苜蓿和刺槐的根部结瘤固氮.这种细菌,摄取在空气中无用的氮气,并将其转化成氨和植物的其他营养成份.实际上,细菌是为     

紫云英根瘤菌基因文库的构建和结瘤基因片段的分离

根瘤菌(Rhizobium)与寄主豆科植物的共生涉及到根瘤菌和植物之间的识别;根瘤菌的浸染;根瘤的形成;根瘤菌类菌体的发育等一系列复杂的过程。 在苜蓿根瘤菌(R. meliloti)中决定引起根瘤的结瘤基因(nod gene),目前已经鉴定出nodA,B,C,D。因为这类基因在多种根瘤菌中都被找到,而且在功能上可以互补,所以     

组成型nifA对大豆根瘤菌(Rhizobium fredii)HN01lux结瘤固氮效率的促进作用

肺炎克氏杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）固氮调节基因ｎｉｆＡ对大豆根瘤菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｆｒｅｄｉｉ）ＨＮ０１ｌｕｘ的结瘤固氮效率有促进作用。首先构建一个带有Ｋｐ ｎｉｆＡＨ的重组质粒ｐＸＤ１,使ｎｉｆＡ在卡那霉素磷酸转移酶基因启动子控制下呈组成型表达。当质粒ｐＸＤ１转移至大豆根瘤菌ＲｆＨＮ０１ｌｕｘ后,获得带Ｋｐ ｎｉｆＡ的大豆根瘤菌,其结瘤固氮效率与原始出发菌相比有明显     

苜蓿根瘤菌1021外源cAMP上调glnⅡ及glnK-amtB的表达

苜蓿根瘤菌1021中多个腺苷酸环化酶基因的存在, 暗示着cAMP的重要性. 本研究用全基因组DNA微阵列分析了外源cAMP对苜蓿根瘤菌的功能. 分析结果表明, glnⅡ和glnK的转录水平在外源cAMP存在时有明显上调. 通过测定glnⅡ和glnK启动子与lacZYA报告基因融合系统在苜蓿根瘤菌体内的活性, 再次证实外源cAMP对glnⅡ和glnK启动子表达有激活作用.     

结瘤基因调控区中多个活性位点的发现

豆科植物的结瘤是共生生物固氮的首要环节。在豌豆根瘤菌中已鉴定出13个结瘤基因,它们的活动促成豌豆根部结瘤。在这些基因中有一个调控基因nodD。在植物分泌的信号分子——类黄酮的存在下,nodD基因的产物NodD蛋白对其它结瘤基因的活动起着重要的调     

组成型nifA对大豆根瘤菌(Rhizobium fredii))HN01lux结瘤固氮效率的促进作用

肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)固氮调节基因nifA对大豆根瘤菌(Rhizobium fredii)HN01lux的结瘤固氮效率有促进作用.首先构建一个带有Kp nifA的重组质粒pXD1,使nifA在卡那霉素磷酸转移酶基因启动子控制下呈组成型表达.当质粒pXD1转移至大豆根瘤菌RfHN01lux后,获得带Kp nifA的大豆根瘤菌,其结瘤固氮效率与原始出发菌相比有明显提高,感染大豆幼苗后,大豆生物量的增加,如植株株高、植株鲜重、植株干重及大豆产量均优于原始出发菌.     

苜蓿根瘤菌nod C蛋白生化特性的分析

根瘤菌的共同结瘤基因nod A,B和C,具有高度的保守性。这些基因对诱发宿主根毛的卷曲和根瘤早期的形成起重要作用.比较苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)和碗豆根瘤菌(R. Leguminosarum)结瘤基因的DNA序列,由此得出nod C蛋白(Nod C)的氨基酸顺序同源性达95％。最近开始对结瘤蛋白生化功能的研究表明,Nod C的结构同细胞表面受体非常类似。     

PAS结构域介导Org35蛋白与NifA之间相互作用

在巴西固氮螺菌中, 氧和铵是调节固氮基因表达的主要环境因子, 即高浓度的氧和铵抑制固氮作用. NifA蛋白(nifA基因的产物)是所有固氮基因(nif基因)的转录激活蛋白. 目前, 在该菌中, 氧和铵对NifA蛋白的表达和活性的调节机制仍然不清楚. 本研究从巴西固氮螺菌中克隆到编码含有PAS结构域蛋白的org35全基因, 将根据org35的核苷酸序列推测的Org35蛋白氨基酸序列在NCBI网上进行同源性比较, 结果表明, Org35蛋白属于杂合双组分调节系统, 包括3个结构域, 即N-端PAS结构、中间组氨酸激酶结构域(HPK)和C-端响应调节蛋白结构域(RR). 并通过酵母双杂交系统证明了Org35蛋白与NifA蛋白之间的相互作用是由PAS结构域介导的.     

紫云英根瘤菌nodD基因的克隆及核苷酸序列

豆科植物紫云英(Astragalus sinicus)是生长于我国南方地区的重要绿肥之一.紫云英根瘤菌(Rhizobium huakuii即R.astragali)是革蓝氏阴性细菌,感染豆科植物紫云英后形成有效的固氮根瘤.决定根瘤菌在宿主植物引起根瘤的基因称结瘤基因(nod和nol基因),nod和nol基因的诱变将导致根瘤菌不能或延迟在宿主植物上结瘤.这些基因包括共同结瘤基因nodABC,nodIJ.宿主专一性结瘤基因(hsn)nodEF,nodG,nodH,nodQ等及与结瘤有关的一些nol基     

蒺藜苜蓿重金属转运蛋白HMA5基因在共生结瘤中的功能分析

重金属转运ATP酶(heavy metal transporting ATPase, HMA)主要参与植物体内重金属的转运.前期研究发现,HMA5基因与苜蓿铜胁迫及共生结瘤相关.为探明豆科植物根瘤中的铜离子吸收、转运及平衡机制,本研究以模式豆科植物蒺藜苜蓿(Medicago truncatula, Mt)为材料,对其HMA5同源基因MTR_8g079250在共生结瘤中的功能进行了初步研究.亚细胞定位分析表明, MTR_8g079250主要定位于细胞膜和细胞核上; GFP::MTR_8g079250融合表达分析显示, MTR_8g079250主要在根瘤的分生区、侵染区、皮层和根的中柱、根冠表达, RNAi沉默目的基因后对共生固氮表型没有产生明显影响.然而,目的基因过表达植株的鲜重和单株根瘤数目较野生型明显降低,侵染线和根瘤原基也显著减少;透射电子显微镜分析表明,根瘤细胞中含有少量的类菌体且形状不规则,环类菌体空间增大,呈现出早衰的迹象; q RT-PCR结果显示,结瘤标志性基因NIN、DMI1、ENOD11和豆血红蛋白基因的表达水平均有不同程度的下调,豆血红蛋白基因的表达水平也有所下调.这些结果表明, MTR_8g079250过表达对共生结瘤有抑制作用.     

固氮斯氏假单胞菌四碳二羧酸转移酶DctPQM的跨膜结构分析与功能研究

固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501四碳二羧酸转移酶系由dctPQM基因编码. 基因序列和结构分析表明, dctP, dctQ和dctM紧密连锁, 并在核苷酸和氨基酸水平上与自生固氮菌棕色固氮菌的四碳二羧酸结合蛋白基因dctP和转运蛋白基因dctQM高度同源. 经分析表明, DctP不含跨膜区, DctQ包含5个跨膜区, DctM包含12个跨膜区. 为验证四碳二羧酸转运系统对固氮能力的增强作用, 将含有完整dctPQM基因的DNA片段连接在自杀性转移质粒载体pSZ21的Tn5转座区域中, 获得重组质粒pSZY6. 采用三亲接合方法, 经Tn5转座作用将dctPQM基因随机插入到野生型菌株A1501的染色体上, 构建了重组菌株A-142. 经nptⅡ基因的PCR扩增实验证明, 该重组菌株确实携带了额外拷贝的dct结构基因. 该重组菌株以不同浓度的琥珀酸、延胡索酸和苹果酸(20, 10和5 mmol/ L)为惟一碳源生长时, 其固氮活性均明显高于野生型菌株A1501, 表明额外拷贝的四碳二羧酸转移酶系编码基因dctPQM能增强受体菌的固氮能力.