苏木抗乳腺癌活性成分的筛选及其作用效果研究

为了筛选苏木抗乳腺癌活性成分,并验证其抗乳腺癌作用效果,以苏木为原料,用不同提取方法制备不同的苏木提取物,采用高效液相色谱法测定主要组分相对含量;通过MTT法测定不同的苏木提取物对乳腺癌MDAMB-231细胞作用24 h和48 h的抑制率,筛选苏木抗乳腺癌活性成分;采用MTT法检测苏木抗乳腺癌活性成分在不同药物浓度、不同处理时间下对乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7和4T1的抑制率,验证其对乳腺癌的抑制效果。结果显示,不同的苏木提取物对MDA-MB-231细胞作用24 h和48 h的抑制率与其在高效液相色谱中出峰时间为14 min的组分含量呈显著正相关,相关系数分别为0.845和0.740(P<0.01),且其抑制率随着作用时间的延长而增加,经结构鉴定该物为巴西苏木素,即:抗乳腺癌的活性成分。巴西苏木素对三种乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7和4T1均有显著的抑制效果,抑制率均高达90%以上(P<0.01),且抑制效果具有剂量和时间依赖性。故巴西苏木素是苏木中抗乳腺癌的活性成分,且对不同乳腺癌细胞均有显著抑制效果。     

肿瘤抑制因子PTEN上调曲妥珠单抗(Trastuzumab)对胃癌细胞BGC-823的杀伤作用

进展胃癌患者往往失去手术等根治性治疗的机会;但目前西妥昔单抗(Cetuximab)、贝伐单抗(Bevacizumab)等分子靶向药物对胃癌极不敏感,仅有少数患者能够从曲妥珠单抗(Trastuzumab)治疗获益。检测肿瘤抑制因子PTEN上调Trastuzumab杀伤胃癌细胞作用及其分子机制。在胃癌细胞系中使用PTEN的抗体检测其表达水平。在最为公认的胃癌研究模型BGC-823细胞中利用脂质体转染PTEN的表达载体,检测其对胃癌细胞增殖等生物学行为的影响;利用系列浓度梯度的Trastuzumab处理胃癌细胞;并计算抑制率和IC_(50)值。在此基础上,利用MTT和Transwell等技术检测转染PTEN的表达载体对Trastuzumab杀伤胃癌细胞的影响。使用蛋白印迹方法(Western Blot,WB)检测PTEN对HER2下游信号通路AKT磷酸化的影响。结果是PTEN在胃癌细胞中的表达水平极低,过表达PTEN能够抑制BGC-823细胞的增殖作用。PTEN能够上调Trastuzumab抑制BG-823细胞的增殖、锚定非依赖性生长、体外侵袭/转移作用。说明PTEN具有对Trastuzumab杀伤胃癌细胞有增敏作用。     

土槿皮提取物抗菌及抗肿瘤活性的初步研究

选取土槿皮中活性成分土槿甲酸和土槿乙酸为研究对象,采用牛津杯法检测其对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性细菌大肠杆菌的抗菌活性,并采用MTT法检测土槿甲酸和土槿乙酸对人胃癌BGC-823细胞及人肝癌HepG-2细胞的抗肿瘤活性.结果:土槿甲酸和土槿乙酸对人胃癌BGC-823细胞及人肝癌HepG-2细胞均有显著的体外抑制增殖作用.其中土槿甲酸对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌有显著的抑菌活性,对大肠杆菌无抑制作用.土槿乙酸对两种细菌均无抑制作用.     

rh—bFGF抑制顺铂诱导的人胃腺癌BGC—823细胞凋亡

目的：评价外源加入的rh-bFGF对抗肿瘤药物顺铂所致人胃腺癌细胞凋亡的影响。方法：利用顺铂诱导人胃腺癌BGC-823细胞产生的凋亡作模型,体外培养时在顺铂作用前或作用后加入不同浓度的rh-bFGF,观察细胞形态的变化和细胞凋亡经率的变化。结果：预培养的rh-bFGF质量浓度为10ng/mL及1ng/mL时抑制细胞凋亡的发生,共培养时则在质量浓度为1ng/mL时产生抑制调亡的作用。结论：外源加入的rh-bFGF在一定的浓度范围内,不信纸预培养还是与顺铂的共培养12h,均可不同程度的抑制顺铂胃腺癌BGC-823细胞的凋亡,并且这种剂量效应与rh-bFGF影响BGC-823细胞的细胞周期相关。     

人IGFBP-1基因真核表达载体的构建及其对胃癌细胞BGC-823增殖的影响

目的构建IGFBP-1真核表达载体,观察IGFBP-1基因真核表达载体转染胃癌细胞株BGC-823后基因的表达及其对BGC-823细胞增殖的影响.方法以GES-1细胞基因组为模板,PCR技术扩增人IGFBP-1的基因片段,克隆人pc DNA3-His-Flag真核表达载体,重组载体pc DNA3-IGFBP-1-His-Flag,并通过PCR、双酶切和测序鉴定.重组质粒经阳离子脂质体法转染BGC-823细胞,RT-PCR和Western blot检测细胞IGFBP-1的表达情况,并通过CCK8法观察IGFBP-1过表达对BGC-823细胞增殖的影响.结果经PCR、双酶切和测序鉴定证明IGFBP-1真核表达载体构建成功,并在胃癌细胞株BGC-823高效表达.CCK8实验显示:IGFBP-1过表达对BGC-823细胞增殖无影响.结论成功构建IGFBP-1真核表达载体,IGFBP-1过表达对BGC-823细胞的增殖无影响,可为进一步研究IGFBP-1生物学功能奠定基础.     

紫龙金对BGC-823细胞增殖的抑制作用及对p16~(INK4a)启动子活性的影响

利用记数法和Brdu脉冲标记法研究了紫龙金对细胞增殖的影响,western blot检测结果表明:紫龙金(3,4mg.mL-1)处理可明显抑制人胃癌BGC-823细胞的生长、提高BGC-823细胞中p16的表达水平.进一步利用含有p16INK4a启动子片段(-967~-165区域)及荧光素酶报告系统的载体pGL3-Basic-p16N研究了紫龙金对p16INK4a启动子活性的影响及其作用的分子机制,结果表明,紫龙金可能通过提高p16INK4a启动子活性而促进p16的表达,从而抑制细胞的增殖.     

不同恶化程度胃癌细胞系的细胞间隙连接通讯功能及Cx43表达的差异

以人正常胃黏膜上皮细胞系GES-1和不同恶化程度的人胃癌细胞系(低恶化AGS细胞系、中恶化SGC-7901细胞系、高恶化BGC-823细胞系)为研究对象,采用激光共聚焦显微镜的荧光漂白恢复技术及划痕标记荧光染料示踪技术研究不同恶化程度的胃癌细胞系细胞间隙连接通讯(Gap junctional intercellular communication,GJIC)功能的差异;采用荧光定量PCR技术和间接免疫荧光技术检测间隙连接蛋白(Connexin43,Cx43)基因在mRNA和蛋白水平的表达差异,探求其与胃癌恶性程度的相关性.结果表明,在正常胃细胞系和低、中及高恶化胃腺癌细胞系中,细胞间的GJIC功能随着恶性程度的升高而减弱(AGS、SGC-7901)或消失(BGC-823),且Cx43蛋白及mRNA的表达量随着恶性程度的升高而下调(AGS、SGC-7901)或缺失(BGC-823).这提示胃癌恶性程度与胃癌细胞的GJIC功能显著相关(P<0.05),GJIC在胃癌发生中起重要作用.     

（顺）-3-（氯代亚甲基）-6-氟-硫色满-4-酮抗肿瘤机理初步研究

目的研究（顺）-3-（氯代亚甲基）-6-氟-硫色满-4-酮（（z）-3-（chloromethylene）-6-fluorothiochroman-4-one,CMFT）体外抗BGC-823肿瘤细胞机理。方法采用流式细胞仪检测BGC-823肿瘤细胞周期和凋亡。结论 CMFT能够抑制BGC-823细胞周期并诱导细胞发生凋亡。     

灵芝免疫调节蛋白LZ-8及云芝免疫调节蛋白FIP-tvc对几种癌细胞系的抑制活性检测

在体外培养的人非小细胞肺癌A549细胞、人胃腺癌BGC-823细胞、人结肠癌HCT116细胞、人肝癌Hep 3B细胞、人宫颈癌Hela细胞中加入不同浓度的酵母异源表达的LZ-8或FIP-tvc,培养24 h后显微镜下观察细胞形态变化,并用CCK8试剂盒检测细胞存活率,以用来检测灵芝免疫调节蛋白LZ-8及云芝免疫调节蛋白FIP-tvc对几种癌细胞生长抑制能力.结果显示,LZ-8和FIP-tvc在5～10μg/mL浓度时使A549、BGC-823、Hela和Hep 3B细胞贴壁性变差,且CCK8结果显示前3种细胞的存活率有不同程度的降低(80%～95%存活率),而在20μg/mL浓度时FIP-tvc对Hep 3B细胞的存活率开始有明显抑制效果(89%存活率),但对HCT 116细胞的形态无影响,对其存活率也无抑制作用.     

幽门螺杆菌cag7-n基因克隆表达及其重组蛋白对BGC-823细胞生物学的影响

目的研究克隆幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）cag7-n基因对BGC-823细胞增殖和IL-8分泌的影响.方法采用PCR技术从H.pylori基因组DNA中扩增cag7-n基因片段,构建重组质粒pET-28a-cag7-n,转化大肠杆菌BL21,经Western blot鉴定,纯化的蛋白作用于BGC-823细胞,用MTT法检测蛋白对细胞增殖的影响.结果成功克隆cag7-n基因,经镍柱纯化后可获得纯度为98%的重组蛋白.纯化蛋白浓度在100,150,200μg/mL时,培养时间延长,细胞的增殖受到抑制;在相同的培养时间,细胞的增殖程度随蛋白浓度的增加而降低.结论成功克隆了cag7-n基因,并在大肠杆菌BL21中表达,经过镍柱纯化后得到纯度较高的蛋白,纯化透析后的蛋白与BGC-823细胞共培养,可诱导细胞因子IL-8在mRNA水平上的表达及其对BGC-823细胞增殖的影响.     

TAT-Apoptin蛋白制备及其诱导BGC-823细胞的凋亡作用

为了制备单一组分TAT-Apoptin融合蛋白,检测其跨膜及凋亡活性.利用IPTG诱导目的质粒p GEX-6p-1-TAT-Apoptipn及对照质粒p GEX-6p-1-TAT-EGFP和p GEX-6p-1-TAT-Apoptin-EGFP可溶性表达,纯化蛋白并孵育BGC-823细胞,荧光显微镜、DNA ladder、流式细胞术检测融合蛋白跨膜及凋亡活性.结果表明,成功诱导融合蛋白表达,获得单一蛋白,荧光显微镜检测TAT将融合蛋白带入细胞内且不影响其活性,TAT-Apoptin融合蛋白处理BGC-823细胞36和48 h时后出现典型DNA Ladder条带,流式细胞术检测早期凋亡率48 h为61.5%,在24~48 h范围内凋亡率增加.结论为制备的TAT-Apoptin蛋白可跨膜诱导BGC-823细胞凋亡,且具有较高活性.     

维药异常黑胆质成熟剂的抗肿瘤作用及其对细胞迁移的影响

探讨维药异常黑胆质成熟剂(ASM)抗肿瘤作用及其对肿瘤细胞迁移的影响.体外培养人肝癌Bel-7402细胞株、人乳腺癌BCAP 细胞株、人宫颈癌 Hela 细胞株、人胃癌BGC-823细胞株,采用四甲基偶氮唑蓝(tetrzolium-based colorimetric assay,MTT)法检测不同浓度ASM(1、2.5、5、10、15、20、50mg/mL)对人肝癌Bel-7402细胞株、人乳腺癌BCAP细胞株、人宫颈癌Hela细胞株、人胃癌BGC-823细胞株4种肿瘤细胞增殖的影响;选择人肝癌Bel-7402细胞株为研究对象,采用细胞划痕运动实验和扫描电镜技术,观察不同浓度ASM对肝癌细胞迁移的影响.MTT检测结果显示,ASM对人肝癌Bel-7402细胞株、人乳腺癌BCAP细胞株、人宫颈癌Hela细胞株、人胃癌BGC-823细胞株生长均有一定抑制作用,且在15～20mg/mL作用下最为明显,对不同肿瘤细胞株抑制作用不一;体外细胞划痕运动实验和扫描电镜结果显示,ASM对人肝癌Bel-7402细胞运动有一定抑制作用.由此推论,ASM对肿瘤细胞增殖和肿瘤细胞迁移有一定抑制作用.     

细胞石蜡包埋切片技术的应用

目的:研究使用蛋清甘油作为支撑物的石蜡包埋制片技术用于基于细胞的形态学检测的可行性.方法:针对人胃癌BGC-823培养细胞、临床送检宫颈TCT检查细胞、胃癌标本残碎细胞液等细胞学材料,运用蛋清甘油作为支撑物进行石蜡包埋制片,进行HE染色及免疫细胞化学染色,并将染色效果与细胞爬片、细胞甩片及细胞涂片染色效果进行对照分析....     

GADD45β过表达抑制膀胱癌细胞T24的增殖

GADD45β(growth arrest and DNA damage,GADD)在肿瘤的发生、发展以及凋亡过程中起着重要作用。首先利用Real-time quantitative(qPCR)检测到32μg/mL巴西苏木素处理人类移行膀胱癌T24细胞6h后,GADD45β的mRNA水平显著上调2.7倍。为了研究GADD45β在巴西苏木素致死T24细胞中的作用,从T24细胞的cDNA中扩增获得GADD45β基因全长读码框,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1上,构成重组载体pcDNA3.1-GADD45β。将该真核表达载体转染T24细胞,发现GADD45β在mRNA水平的表达显著上调,表明真核表达载体成功转入T24细胞;观察GADD45β过表达后对肿瘤细胞的影响,发现细胞变圆,贴壁性变差,活性显著降低85%。本研究表明GADD45β在T24细胞中的过表达能有效地抑制细胞生长,对细胞有较强的致死作用。     

灯盏乙素对胃癌细胞株的体外抑制作用

目的:初步研究灯盏乙素体外对胃癌细胞的抑制。方法:采用二甲基噻唑二苯基四唑嗅盐(MTT)法测定不同浓度的灯盏乙素对胃癌细胞SGC-7901、BGC-823的抑制作用。结果:灯盏乙素在1 mg/mL时,对胃癌细胞SGC-7901有抑制作用,抑制率为47.07%,且抑制作用与药物浓度呈正相关;灯盏乙素在1 mg/mL时,对胃癌细胞BGC-823无抑制作用。结论:灯盏乙素对胃癌细胞SGC-7901有抑制作用,对BGC-823无抑制作用。     

BGC-823细胞中慢病毒途径针对HIF-1α基因的RNAi实验

目的：构建人HIF-1α基因的shRNA慢病毒载体、包装生产重组慢病毒颗粒,病毒途径高效感染胃癌细胞株BGC-823,并验证基因沉默效率。方法：在NCBI数据查找人HIF-1α基因序列,然后使用siRNA在线设计软件,设计针对基因CDS区的3条siRNA序列及Negative序列。根据设计好的siRNA序列设计双链互补的shRNA-Oligo DNA,退火形成双链后与线性化载体链接,构建shRNA重组表达载体。经由293TN细胞包装shRNA重组慢病毒颗粒,随后使用重组病毒感染BGC-823,通过荧光标记蛋白GFP确定感染效率后收集细胞样本,分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率。结果：shRNA重组表达载体测序结果与设计序列完全一致,包装病毒后滴度达到1×104 ifu/μL。慢病毒感染BGC-823细胞取得了极高的基因转导效率。mRNA检测结果显示,siRNA3对于对与目的基因的沉默效果最好,较阴性对照序列组相比较,mRNA的表达量下降了92%,Western blot检测的结果与mRNA检测结果完全相符合。结论：通过慢病毒途径,可以在BGC-823细胞中高效的进行HIF-1α基因的沉默。     

染色体驱动蛋白KIF4A抑制胃癌细胞的迁移运动

探究染色体驱动蛋白KIF4A与胃癌细胞迁移运动的关系,从而为胃癌临床治疗提供新的治疗靶点。用G418筛选的方法构建了两种细胞株:KIF4A低表达的胃癌SGC细胞株与KIF4A过表达的胃癌SGC细胞株,Western与免疫荧光的验证后,对其分别进行细胞划痕与Transwell迁移实验检测KIF4A对细胞迁移运动能力的影响。成功构建了KIF4A低表达的SGC细胞株(SGC-shKIF4A)与KIF4A过表达的细胞株(SGC-KIF4A),在KIF4A低表达的SGC细胞株中细胞的迁移速率增加,在KIF4A过表达的细胞株中细胞的迁移速率减慢。染色体驱动蛋白KIF4A抑制胃癌细胞的迁移运动能力,为进一步研究KIF4A与胃癌转移的机制奠定基础。     

胃癌细胞C-myc蛋白对他莫昔芬的应答

目的:观察C-myc蛋白在胃癌细胞系BGC823中的表达情况,探讨胃癌细胞BGC823经他莫昔芬(TAM)处理后,C-myc蛋白表达的变化.方法:使用10 5MTAM处理胃癌BGC823细胞系24 h后,通过免疫荧光细胞化学的方法及细胞计数,检测C-myc蛋白的表达变化,并通过WST1法检测细胞活力的变化.结果:C-myc在胃癌BGC823中高表达,经10 5 M TAM处理24 h后BGC823细胞活力明显下降(P<0.05,)同时C-myc的表达减弱(P<0.05).结论:C-myc在胃癌细胞BGC823中发挥生物学作用且与TAM介导的BGC823细胞活力下降相关.     

癌细胞C-myc蛋白对他莫昔芬的应答

目的:观察C-myc蛋白在胃癌细胞系BGC823中的表达情况,探讨胃癌细胞BGC823经他莫昔芬(TAM)处理后,C-myc蛋白表达的变化.方法:使用10 5MTAM处理胃癌BGC823细胞系24 h后,通过免疫荧光细胞化学的方法及细胞计数,检测C-myc蛋白的表达变化,并通过WST1法检测细胞活力的变化.结果:C-myc在胃癌BGC823中高表达,经10 5 M TAM处理24 h后BGC823细胞活力明显下降(P<0.05,)同时C-myc的表达减弱(P<0.05).结论:C-myc在胃癌细胞BGC823中发挥生物学作用且与TAM介导的BGC823细胞活力下降相关.     

多糖对人胃癌SGC7901细胞生长抑制

以培养的人胃癌SGC7901细胞为对象,研究了用多糖处理后培养细胞的变化特征.结果显示,多糖可以抑制人胃癌SGC7901细胞的增殖,并呈现出对剂量和时间的依赖性.用1.0×10-2g/mL的多糖处理培养细胞48h后,出现典型的形态学凋亡现象和明显的DNA片段化,细胞凋亡率达到40%左右.随着细胞凋亡的发生,BCL-2蛋白的表达下降,而BAX蛋白的表达上升.因此,结果表明多糖可以通过诱导细胞发生凋亡来抑制人胃癌SGC7901细胞的生长,从而达到治疗胃癌的目的.