表达5aG株狂犬病毒糖蛋白基因的重组痘苗病毒的构建及鉴定

采用同源重组的方法，将５ａＧ株狂犬病毒糖蛋白基因插入天坛株痘苗病毒基因组ＴＫ区段，置于痘苗病毒晚期启动子Ｐ１１控制之下，通过筛选，得到一株重组病毒ＶＶａＧ，实验结果表明：该株病毒可表达５ａＧ株糖蛋白基因，表达产物位于感染细胞膜表面，分子量６４×１０＾３，并可与抗狂犬病毒糖蛋白抗特异组合，用ＶＶａＧ免疫小鼠，可诱导机体产生抗狂犬病毒中和抗体，抵抗致死剂量狂犬病毒的攻击，中和抗体滴度在免疫后１４ｄ达到     

应用单克隆抗体建立快速狂犬病毒抗原检测方法及其应用的研究

该项目运用单克隆抗体技术快速检测狂犬病毒抗原，采用狂犬疫苗作为标准抗原，免疫动物，制备出抗狂犬病毒的单克隆抗体，再将获得的多株单抗混合，增加单抗的亲合力，捕捉狂犬病毒抗原，做成酶免疫双抗体夹心法试剂。用该试剂对不同来源的狂犬病毒株和不同来源的狂犬疫苗进行检测，结果与法国巴斯德研究所生产的试剂测试结果相同，     

猴接种狂犬病毒核糖核蛋白诱生抗狂犬病保护性免疫

本文研究了猴体内狂犬病毒核糖核蛋白(RNP)诱生抗狂犬病保护性免疫及诱导病毒中和抗体(VNA)产生的能力。猴子经两次接和狂犬病毒RNP后产生强烈的抗RNP免疫应答并能抵抗致死量狂犬病毒的攻击而不受感染。先接种RNP再免疫一剂狂犬病毒人二倍体细胞疫苗(HDCV)后所产生的VNA滴度与未接种RNP而经两次接和HDCV疫苗后产生的VNA滴度相当。本文就狂犬病毒RNP对人类狂犬病在暴露前的预防作用进行了讨论。     

狂犬病毒核蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫原性的研究

目的在昆虫细胞中表达出狂犬病毒核蛋白(NP),并探讨重组NP的免疫原性.方法采用杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中表达狂犬病毒核蛋白,用直接免疫荧光(DFA)、SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行检测和分析,以感染重组杆状病毒的昆虫细胞裂解液免疫小鼠,检测表达产物的免疫原性.结果重组杆状病毒在昆虫细胞中获得表达,免疫小鼠可产生抗核蛋白抗体.结论在Sf9昆虫细胞中表达出狂犬病毒核蛋白,重组产物具有生物活性.     

高致病性禽流感病毒广谱嵌合抗体的构建表达及活性研究

高致病性禽流感病毒高度变异且缺乏有效的治疗药物.在前期研究工作中,本课题组发现一株鼠源广谱中和单抗13D4,在动物实验中显示出对H5N1禽流感病毒具有广谱治疗效果.在本研究中,从分泌13D4单克隆抗体的杂交瘤细胞株中抽提总RNA,经RT-PCR扩增出轻重链可变区DNA序列,并分别与人IgG1的轻重链恒定区基因序列拼接,构建人-鼠嵌合抗体.筛选出稳定表达嵌合抗体的CHO细胞株,从培养上清中纯化出嵌合抗体.竞争Elisa结果表明,嵌合抗体与鼠源单抗能够识别同一个抗原表位并具有相似的亲和力.血凝抑制反应和中和活性测定结果证明,13D4嵌合抗体保留了对不同亚型H5N1病毒的广谱反应性,并且对两株H5N1病毒具有中和活性.本研究获得的13D4嵌合抗体将具有潜在的治疗价值.     

唾液、DTT、2-Me三种物质对IgM抗体中和能力的比较

探索了三种物质对IgM抗体中和能力,选取5例0型孕妇产前检查标本,分别采用唾液、DTT、2-Me三种物质中和IgM抗体,检测IgG抗体效价。5例孕妇血清经唾液中和,测得IgG效价分别为抗A：0;抗B：0;抗A：1：2;抗B：0;抗A：0抗B：0;抗A：0;抗B：0;抗A：0;抗B：0。采用DTT中和后测得IgG效价分别为抗A：1：8;抗B：1：16;抗A：16;抗B：1：16;抗A：1：16;抗B：1：8;抗A：1：8;抗B：1：8;抗A：1：16;抗B：1：16。采用2-Me中和后测得IgG效价分别为抗A：1：2;抗B：1：64;抗A：1：128;抗B：1：4;抗A：1：32;抗B：1：128;抗A：1：16;抗B：1：32;抗A：1：64;抗B：1：32。结果表明唾液型物质不仅中和IgM抗体,而且中和部分IgG抗体,DTT对IgM抗体中和能力较差。2-Me对IgM抗体中和能力较强,而且对IgG抗体破坏小。     

兔抗人M-CSF特异性抗体在夹心ELISA方法检测人M-CSF中的应用

用人尿来源经纯化的 M-CSF 免疫家兔制备抗 M-CSF 物异性抗体.经 ELISA试验证明该抗体可对天然和重组人 M-CSF 进行特异性识别,与人的 GM-CSF 和 IL-3无交叉反应,并且该抗体可中和天然人 M-CSF 集落刺激活性。用该抗体与人 M-CSF 标准品进行夹心 ELISA 实验,结果证明夹心 ELISA 方法测定的标准品 M-CSF 含量与实际相一致,并且与软琼脂骨髓细胞集落形成试验检测到的活性结果相平行。     

Rab39A多克隆抗体的制备与鉴定

制备抗人Rab39A多克隆抗体并进行纯化检测,以用于Rab39A功能的研究.选取免疫原性强且特异性高的羧基端42个氨基酸(176～217aa)作为目的片段.PCR法扩增并构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rab39C42.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化GST-Rab39C42融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体.然后以亲和层析法纯化抗体,利用Western blot和免疫荧光检测抗体的特异性.结果表明,构建的原核表达载体经IPTG诱导后高效表达GST-Rab39C42蛋白,纯化后抗体质量浓度为1μg/μL;Western blot实验显示,抗体可以识别外源Rab39A蛋白和多个细胞系的内源Rab39A蛋白;抗体中和实验和RNA干扰实验证明了该抗体具有特异性.本研究成功构建了pGEX-4T-1-Rab39C42原核表达载体,并制备了特异性的抗人Rab39A兔多克隆抗体,为进一步研究Rab39A的功能提供了有力的支持.     

脊髓灰质炎病毒I型单克隆抗体的制备

目的: 为建立脊灰病毒Sabin株I型特异的单克隆抗体．方法:以Vero细胞增殖病毒并用蔗糖密度梯度离心法纯化后,用病毒免疫SPF级Balb/c小鼠．取小鼠免疫脾淋巴细胞与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞进行细胞融合,通过间接 ELISA 法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞,并用有限稀释法克隆化．用细胞培养法制备脊灰病毒单抗,并以中和试验测定单抗效价．结果:获得了8株分泌抗脊灰病毒Sabin株I型单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中1株G8G7能够稳定分泌抗体．间接ELISA 法测得单抗的效价为1∶8,中和试验测得中和抗体的效价为1∶58．结论:G8G7分泌的抗体为抗脊灰病毒Sabin株I型特异的单克隆抗体.     

CdS纳米晶标记抗雌二醇抗体荧光免疫分析试剂

在水相中制备了CdS纳米晶,其在536 nm处有较强荧光发射,用巯基乙酸修饰后与抗雌二醇抗体偶联,制备了CdS纳米晶标记的抗雌二醇抗体标记物,该标记物具有良好的荧光特性,发射波长红移至588 nm.利用该标记物竞争免疫分析法测定雌二醇的线性范围为0.20～8.00 mg/L.     

关于小鼠脑内不同注射手法的探讨

目的研究小鼠脑内不同注射部位、进针深度以及拔针方式对实验结果的影响。方法将狂犬病毒CTN株样品和CVS株样品分别在11～13g以及18～20g的SPF小鼠脑内注射,0.03mL/只,按不同注射部位、进针深度以及拔针方式进行滴度测定,其中注射部位分别为眼窝后缘眼角的斜上方和两眼角后缘连线的正中线;进针深度分为进针浅、中和深(2mm,4mm,6mm);拔针方式有直接法和旋针法。结果两个注射部位测出来的滴度结果没有显著性差异;3种进针深度测得的滴度结果为浅针的最高,其次为中针,深针测定的滴度结果最低;直接法拔针方式测出来的滴度结果比旋针法测出来的高。结论进针深浅以及拔针方式对小鼠脑内注射的动物实验结果有显著性的影响,这很大可能是由狂犬病毒的生物学特性所决定的。     

GGPPS多克隆抗体的制备与鉴定

构建人香叶基香叶基二磷酸合成酶基因(GGPPS)原核表达载体,制备兔抗人GGPPS多克隆抗体.利用DNA重组技术构建原核表达载体pGEX-4T-GGPPS,诱导表达GGPPS融合蛋白,分离纯化该融合蛋白后,作为免疫原免疫家兔制备多克隆抗体.成功构建了pGEX-4T-1-GGPPS原核表达载体,转化Rosetta菌株后可高效表达GGPPS融合蛋白,成功制备GGPPS多克隆抗体,间接ELISA法测定抗体效价为1∶32000,并且抗体具有良好特异性.成功克隆GGPPS基因并制备了特异性的兔抗人GGPPS多克隆抗体,为进一步研究GGPPS的功能奠定了基础.     

伪狂犬病毒糖蛋白H基因片段的克隆,序列测定和分析

对伪狂犬病毒湖北地方株（ＰＲＶ ＨＢ株）糖蛋白Ｈ基因片段进行了扩增、克隆、序列测定和分析，比较了该序列与ＰＲＶ Ｋａ株及ＮＩＡ－３株三之间的同源性。结果显示，克隆片段长１３９６ｂｐ，Ｇ＋Ｃ含量７５．６％包括糖蛋白Ｈ（ｇＨ）Ｎ端２８３个氨基酸编码区及上游调控序列和胸苷激酶端１３     

抗膀胱癌单链抗体基因在烟草中的表达

以抗膀胱癌单链抗体（ｓｃＦＶ）基因为目的基因,构建植物表达载体,转化烟草,研究医用治疗性工程抗体基因在植物中的表达,结果表明,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定出的转基因植株,叶片提取物的蛋白电泳有特异带出现,其分子量约为２７ｋｕ,同预期的单链抗体分子量一致,表达量最一株,抗体含量占可溶性蛋白的１．４％,竞争性抑制ＥＬＩＳＡ测定结果显示,该抗体有抗原结合活性。     

噬菌体筛选技术筛选与联萘酚(BINOL)相结合的抗体

利用噬菌体展示技术筛选只结合1种对应体的BINOL抗体,建立人类单链抗体(scFv)噬菌体文库--Griffin.1文库,以固相化抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体.从经过4轮富集的次级抗体库中挑选到噬菌体克隆,用该克隆制备的单链抗体阳性克隆,经ELISA证实具有良好的抗原特异性.从人类scFv噬菌体文库中获得抗BINOL的特异性抗体.     

伪狂犬病毒表达载体的构建

利用伪狂犬病毒湖北地方株胸腺核苷激酶基因和ｇＧ糖蛋白基因启动子，构建了ＰＲＶ基因转移载体。通过β－半乳糖苷酶基因确定了ＰｇＧ控制下外源基因的表达并筛选出表达β－半乳糖苷酶的ＰＲＶ重组病毒。     

SARS-CoV刺突蛋白受体结合区的表达及高潜在中和性人源抗体的制备

为表达SARS-CoV刺突蛋白S(Spike)受体结合区(RBD)并从中筛选高潜在中和性人源抗体,我们用原核表达并纯化的SARS-CoVSRBD进行抗体库的筛选。从多个曾患SARS的健康人血中获得淋巴细胞,PCR扩增全部抗体基因,插入Pcomb3x载体中,构建抗SARS病毒人源噬菌体抗体库。利用噬菌体表面呈现技术,从中筛选结合SARS-CoVSRBD的人源抗体并用ELISA及Westernblot鉴定阳性克隆,竞争ELISA检测人源抗体阻断SARS-CoVSRBD与其受体ACE2的结合情况。结果为构建了库容量6.2×107的免疫Fab噬菌体抗体库,重组率为75%,从中筛选获得9株特异抗SARS-CoVSRBD的人源Fab抗体,ELISA及Westernblot检测均为阳性。其中有一株能阻断SARS-CoVSRBD与其受体ACE2的结合。本实验结果表明:人源抗SARS-CoVSRBD基因工程抗体的获得,一方面将对SARS疾病的特异性预防,治疗和诊断提供新的途径,同时也提示SARS-CoV亚单位疫苗可以用于SARS疾病的预防。     

恒河猴犬瘟热病毒基因疫苗制备单克隆抗体的研究

从感染犬瘟热病毒死亡的恒河猴肝脏组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增H全基因并克隆到真核表达质粒pVAX中,构建了基因疫苗pVAX-H。用制备的基因疫苗免疫BaLb/c小鼠,小鼠可以产生免疫应答,免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后,经间接ELISA法筛选,获得5株稳定分泌抗CDV H蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该5株单抗对应不同的病毒抗原表位,且均不与CPV和MV发生反应, McAb诱生的腹水可体外中和犬瘟热病毒,其中2株中和效价大于1:256。结果表明,CDV H基因疫苗可制备具有一定中和效价的抗CDV的单克隆抗体。     

抗胸腺素α1(Tα1)多克隆抗体的纯化及转基因藻中Tα1的检测

采用不同浓度的硫酸铵分级盐析纯化抗Tα1多克隆抗体,然后用不同量的牛血清白蛋白(BSA)与兔抗Tα1抗体进行中和,以去除血清中的抗BSA抗体,并利用纯化后的抗Tα1多克隆抗体检测转基因藻中Tα1.结果表明:采用25%(NH4)2SO4进行分离纯化,并将BSA加入到血清中进行中和,37℃处理30min,BSA的量与血清的比例以1μL血清 15μgBSA可达到中和血清中的抗BSA抗体的目的.获得的抗Tα1抗体效价与未进行分离前基本相同,并且阴性本底低.采用ELISA方法检测野生藻和转基因藻中的Tα1,转基因藻的Tα1OD450值比野生藻的高2.1倍以上,提示Tα1在转基因藻中成功表达.实验证明,此方法能有效纯化抗胸腺素α1多克隆抗体,获得特异性强的抗胸腺素Tα1抗体,并且效价不受影响.     

恒河猴犬瘟热病毒基因疫苗单克隆抗体的制备

从感染犬瘟热病毒死亡的恒河猴肝脏组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增H全基因并克隆到真核表达质粒pVAX中,构建了基因疫苗pVAX-H.用制备的基因疫苗免疫BaLb/c小鼠,小鼠可以产生免疫应答,免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后,经间接ELISA法筛选,获得5株稳定分泌抗CDV H蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株.该5株单抗对应不同的病毒抗原表位,且均不与CPV和MV发生反应,McAb诱生的腹水可体外中和犬瘟热病毒,其中2株中和效价大于1∶256.结果表明,CDV H基因疫苗可制备具有一定中和效价的抗CDV的单克隆抗体.