TRAIL与kallistatin联合表达载体的构建及抗肿瘤活性分析

为研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)与组织激肽释放酶结合蛋白(kallistatin)联合用药的抗肿瘤作用,构建TRAIL与kallistatin双表达的重组质粒pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL,将重组质粒转染A549,LO-2,NCI-H446和Hela细胞,考察其抗肿瘤活性.实验结果表明:构建的双表达载体能同时表达TRAIL与kallistatin,且均能分泌至培养基中;TRAIL与kallistatin联合表达对肿瘤细胞活力的抑制作用明显增强,诱导肿瘤凋亡的作用也明显增强,说明联合表达TRAIL与kallistatin能够增强抗肿瘤活性.     

睾丸特异表达蛋白质RNF138的表达纯化及抗体制备

目的:制备RNF138的多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.方法:通过RT-PCR从小鼠睾丸cDNA文库中扩增mRNF138的开放阅读框,并克隆至原核表达载体pET-30a中;将测序正确的pET-30a(+)/mRNF138重组质粒转化大肠杆菌Rosseta菌株,经IPTG诱导表达后通过镍离子螯合柱(Ni-NTA)...     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)联合低剂量顺铂诱导多药耐药人卵巢癌细胞凋亡的实验研究

为研究卵巢癌多药耐药机制和逆转耐药,探讨在低剂量顺铂存在下,人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对多药耐药人卵巢癌细胞的杀伤增效作用及其可能存在的分子病理机制。用顺铂为诱导剂,逐步建立多药耐药人卵巢癌细胞株SKOV3/cDDP。(此细胞株经免疫组化检测P-gp高表达)。TRAIL、顺铂或两药联用12h,24h,48h,采用MTT法测试细胞毒作用,Hochest33258染色荧光显微镜下观察细胞形态学改变,透射电镜下观察亚细胞结构形态,通过流式细胞术检测细胞凋亡比例,Western blot分别检测在联用TRAIL作用前后cFLIP蛋白的表达情况。结果显示:1)单用100ng/mL TRAIL只能杀伤4.67%±0.26%的SKOV3/cDDP细胞,IC50>1000ng/mL。顺铂对SKOV3/cDDP细胞的作用存在剂量依赖性细胞毒效应,这种效应主要通过诱导细胞凋亡实现;2)亚毒性浓度TRAIL(100ng/mL)与亚毒性浓度DDP(1.0μg/mL)联用可杀死52.12%±2.84%的SKOV3/cDDP细胞。呈现出高效协同作用;3)流式细胞术分析、透射电镜观察及荧光显微镜证实其协同性杀伤作用主要通过促进诱导细胞凋亡实现;4)亚毒性浓度TRAIL(100ng/mL)与亚毒性浓度DDP(1.0μg/mL)联用,可使细胞cFLIP蛋白的表达下调,促进了细胞凋亡的发生。结论:TRAIL与亚毒性浓度顺铂联用表现出对多药耐药人卵巢癌细胞的高效杀伤作用,这种作用可能主要由促进细胞凋亡介导实现,cFLIP蛋白的表达减少可能参与这一过程。     

XIAP在TRAIL抗性细胞HCT116 bax-/-中的作用机制研究

为了探索结直肠癌细胞HCT116抗TRAIL诱导凋亡的分子机制,本课题以其抗性细胞HCT116 bax~(-/-)为实验对象进行了研究.通过利用目前最热的基因定点编辑技术Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9系统将HCT116bax~(-/-)的XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis protein)基因彻底敲除后,用TRAIL处理,发现其恢复了对TRAIL的敏感,形态学发生了明显凋亡,而且western blot检测显示PARP蛋白发生了完全剪切.由此证明敲除XIAP基因能克服HCT116 bax~(-/-)对TRAIL的抗性.这些发现对肿瘤细胞抗TRAIL的分子机理研究以及肿瘤的个性化治疗有非常重要的意义.     

Sorafenib联合重组人可溶性TRAIL蛋白对K562细胞增殖抑制和凋亡诱导的研究

目的观察比较联合应用重组人可溶性TRAIL蛋白及Sorafenib于人慢性髓系白血病细胞株K562与单独应用时细胞增殖抑制及诱导凋亡的差异。方法通过CCK-8法检测两者对K562细胞的增殖抑制作用;Western-Blot分析TRAIL或与Sorafenib联用对K562细胞的凋亡诱导作用。结果 Sorafenib与TRAIL联合作用于K562细胞时,其细胞的增殖抑制率及凋亡率均显著高于二者单独应用。结论 Sorafenib与TRAIL对K562细胞的增殖抑制及凋亡诱导有增敏及协同作用。     

ABL沉默对DOX和TRAIL诱导结肠癌细胞HT29凋亡的影响

研究酪氨酸激酶Abelson(ABL)基因沉默与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)、阿霉素(doxorubicin,DOX)联合作用对结肠癌细胞株HT29凋亡的影响.利用shRNA慢病毒载体构建ABL沉默稳转细胞株,并用Western blot检测ABL表达水平;细胞计数试剂盒8(cell count kit 8,CCK8)实验检测细胞增殖和药物毒性;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;Western blot检测凋亡相关蛋白PARP1,cleaved-caspase3的表达水平.结果表明:TRAIL,DOX均能够抑制结肠癌细胞的细胞活性,二者联合用药可在较低剂量诱导细胞凋亡;ABL基因沉默能够抑制结肠癌细胞增殖,但同时也抑制了TRAIL对HT29细胞的凋亡诱导作用,以及TRAIL和DOX对HT29细胞凋亡的协同作用.可见,DOX和TRAIL联合用药能够显著诱导HT29细胞发生凋亡;虽然ABL沉默能抑制HT29细胞增殖,但同时也抑制了TRAIL和DOX协同促进HT29细胞凋亡的作用.     

Myostatin基因原核表达载体的构建及蛋白表达、纯化与鉴定

应用基因工程技术,将合成Myostatin C-末端区(330bp)的基因序列,克隆至原核表达载体pQE30,以构建人的Myostatin基因原核表达载体.构建的重组质粒pQE-Ms转染大肠杆菌宿主菌DH5α后,IPTG诱导表达重组蛋白.应用SDS-PAGE电泳和Western Blot分析和鉴定了重组蛋白的特异性,并用镍离子亲和色谱柱层析进行目的蛋白的纯化与鉴定.结果表明:重组质粒pQE-Ms酶切和测序结果与预期相符,SDS-PAGE电泳和Western Blot证实表达蛋白为目的蛋白,蛋白表达形式为包涵体,经镍离子螯合亲和层析柱纯化及鉴定,确定实验获得了高纯度的目的蛋白,为人体血清中Myostatin蛋白表达的检测及特异性抗体制备等研究提供了实验依据.     

人可溶性TRAIL原核分泌表达载体的构建

为了克隆人可溶性TRAIL基因片段,构建其新型原核分泌表达载体,从HL-60细胞中提取总RNA,根据GeneBank提供的人TRAIL基因序列,设计扩增人可溶性TRAIL基因114～281片段的特异性引物,同时引入NcoI、BamHI、TEV酶的酶切位点及His标签,以便纯化及纯化后切去His标签,并将目的基因克隆至原核表达载体PhoA,经测序分析鉴定,于大肠杆菌MM294中进行表达.结果表明:克隆到人sTRAIL基因序列,经DNA测序结果与GeneBank基因库报道的一致,成功构建了可分泌表达的人源可溶性TRAIL原核表达载体PhoA-sTRAIL,并在大肠杆菌MM294中成功表达.     

由羽毛粉制备复合氨基酸螯合锌的研究

将超声波技术应用于硫酸水解羽毛粉,经8h水解反应后,氨基酸的生成率可达93.6％。通过正交试验研究了投料比、pH值、螯合温度和螯合时间四个因素对由上述水解所制得的复合氨基酸与硫酸锌反应制备复合氨基酸螯合锌的螯合反应的影响,其对指标螯合率的影响依次为：pH值、螯合温、投料比、螯合时间；最佳的螯合反应条件为：复合氨基酸：硫酸锌=2：1(m／m),螯合温度90℃,pH值为8,螯合时间为2h。     

2-羟基苯乙酮镍(Ⅱ)配合物的晶体结构及其抗肿瘤活性

以2-羟基苯乙酮(HAP)为配体合成一个2-羟基苯乙酮镍(Ⅱ)配合物[Ni(AP)2](1),并通过X射线单晶衍射表征其晶体结构。在该配合物中,中心镍(Ⅱ)采取四配位方式,2个2-羟基苯乙酮分子分别通过其脱质子的2-羟基O原子和酮羰基O原子与镍(Ⅱ)反式双齿螯合配位,形成平面四边形的几何构型。采用MTT法测试HAP配体及其镍(Ⅱ)配合物1对4种人肿瘤细胞株(BEL-7404、HepG2、A549、MGC80-3)以及人脐静脉内皮细胞HUVEC的体外增殖抑制活性。研究结果表明,HAP及其镍(Ⅱ)配合物1对上述各细胞株均显示出中等程度的增殖抑制活性。除对MGC80-3之外,配合物1对其他肿瘤株的体外增殖抑制率均高于HAP,初步说明HAP与镍(Ⅱ)配位结合后在抗肿瘤活性上表现出一定的正协同效应;且配合物1的细胞毒性总体上低于顺铂,推测其非细胞毒类化合物。以DNA为潜在抗肿瘤靶分子,通过液态荧光光谱分析和琼脂糖凝胶电泳的方法,从分子水平上研究配合物1与DNA的结合作用,结果表明:配合物1对ct-DNA存在弱的插入作用,且当其浓度达到70μmol/L以上时,对质粒DNA表现出切割活性。由此推测,DNA大分子应是配合物1产生抗肿瘤活性的关键靶点之一。     

甲巯咪唑脂质体的制备及其对大鼠T_3、T_4及TSH值的影响

目的制备甲巯咪唑脂质体并测定其包封率,考察其对大鼠T_3、T_4及TSH值的影响。方法应用逆向蒸发-超声法制备甲巯咪唑脂质体,透射电子显微镜考察其形态与粒径;采用高效液相色谱法测定脂质体的包封率;将大鼠随机分成2组,分别服用甲巯咪唑片剂和脂质体溶液,8周后测定大鼠血清T_3、T_4及TSH值。结果制备的脂质体粒径大小均匀,粒径范围为150～175nm;甲巯咪唑检测浓度的线性范围为0.01～1mg·mL~(-1)(r=0.9991,n=6),平均回收率为100.03%(RSD=1.24%,n=6);包封率最高可达75.8%,最低42.4%;脂质体溶液给药与口服给药两组比较,脂质体溶液给药对大鼠血清T_3、T_4有显著抑制作用,P0.05;对TSH的影响两组间无显著性差异。结论本方法制备的甲巯咪唑脂质体可以在临床上推广使用。     

猪牙皂皂苷脂质体的制备及其黏膜毒性的评价

目的:利用脂质体较好的包载作用与生物相容性,将具有较大黏膜毒性的猪牙皂皂苷制备成脂质体,以减小其黏膜毒性,为猪牙皂皂苷在临床上的应用提供可能.方法:薄膜分散法制备猪牙皂总皂苷脂质体,高速离心法测定猪牙皂皂苷脂质体的包封率.以包封率为主要评价指标,正交设计法优化猪牙皂皂苷脂质体的组方;以粒径、Zeta电位、圆整度评价猪牙...     

多养分复合叶面肥的制备与性能

在确定多养分复合叶面肥制备工艺的基础上,考察了螯合剂种类、螯合温度、螯合时间、溶液pH值等因素对产品性能的影响。通过正交试验获得了叶面肥的最佳螯合反应条件为:以EDTA与柠檬酸组合作为螯合剂,螯合温度70℃,螯合时间0.5h,溶液pH值5.5.研究发现螯合剂种类对叶面肥性能影响最大,次为溶液pH值,螯合温度与螯合时间影响最小。制备的多养分复合叶面肥主要指标完全符合国家标准;同时还含有大量元素氮、磷、钾,中量元素钙、镁、硫,高活性腐植酸钾及稀土添加剂等有益组分。     

雷公藤红素脂质体及其制备方法

行业领域:生物医药-化学药专利信息:非专利技术成熟度:正在研发技术推广方式:正在技术推广联系人:吕伟锋联系方式:13806746268成果内容简介:雷公藤红素(又名"雷公藤内酯醇")具有出色的抗肿瘤作用,其抑瘤作用高达65%-93%,远远超过紫杉醇。根据脂质体的靶向性特征,将雷公藤红素制成脂质体,以提高药物靶向性,提高疗效,本项目已经完成了雷公藤红素脂质体小试,取得了成功。目前完成处方工艺优化,制备包封率高、稳定性好的雷公藤红素脂质体,对其理化性质进行考察;建立了雷公藤红素的高效液相含量测定方法;建立了葡聚糖凝胶柱层析法和透析法两种雷公藤红素脂质体包封     

带鱼下脚料水解螯合物制备及其生物特性研究

通过对带鱼下脚料水解物亚铁螯合修饰及其功能性研究,为带鱼下脚料水解物的高效利用奠定理论基础。采用复合酶水解法和亚铁修饰法进行初步研究。未脱脂的带鱼下脚料水解螯合修饰的最适条件为蛋白质水解度为5%、螯合pH为7.0、螯合温度为20℃、螯合时间为15min;经无水乙醇沉淀可获得4种螯合组分,分别为:CA,螯合后产生的沉淀物组分;CB,沉淀于50%无水乙醇中的组分;CC,悬浮于80%无水乙醇中组分;CD,沉淀于80%无水乙醇底部组分。在这4种组分中,CB抗氧化活性最高,其抗氧化活性可达到a-生育酚活性的92%;CD抗菌性最强,它对大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌以及枯草芽胞杆菌都具有抗菌性。带鱼下脚料水解螯合可作为食品添加剂在食品工业中应用。     

镍奥氏体铸铁耐腐蚀及磨损行为

针对高镍奥氏体铸铁成本高的特点,拟通过用价格低廉的锰代替价格昂贵的镍,并调整Cu,Cr和Si等元素含量,制备低镍奥氏体铸铁。研究镍铸铁在5%(质量分数)HCl溶液中的腐蚀行为和在3.5%(质量分数)NaCl溶液中的电化学腐蚀行为及在干摩擦条件下的耐磨损性能。研究结果表明:在5%HCl溶液中,低镍铸铁耐腐蚀性能与高镍铸铁的耐腐蚀性能相当;同时,所有镍铸铁试样在3.5%NaCl盐溶液中的电化学腐蚀行为都出现了氧扩散的平台,并且自腐蚀电流密度与自腐蚀电位随着Ni,Cr和Cu含量的降低而不同程度地增加;在干摩擦条件下,低镍铸铁的耐磨损性能接近或高于高镍铸铁的耐磨损性能,其主要的磨损机制是黏着磨损,同时还存在疲劳磨损和磨粒磨损。     

用SDS-PVP软模板制备镍纳米粒子

以十二烷基硫酸钠(SDS)-聚乙烯吡咯烷酮(PVP)软团簇为模板,水合肼为还原剂还原氯化镍制备纳米镍粉,采用X-射线衍射仪、透射电镜、激光粒度分析仪及差热分析仪等对其进行表征.结果表明:在制备过程中,SDS-PVP团簇具有防止镍粒子团聚的作用;所得镍纳米粒子属立方晶系,平均粒径为16 nm;制备得到的镍粒子的熔点为538.7℃,远低于普通尺寸镍的熔点(1452℃),这与文献报道的镍纳米粒子熔点为524.3℃相近,从而证明了在SDS-PVP模板中制备出镍纳米粒子.     

含偕胺肟基螯合纤维的制备及其吸附性能研究

用正交设计法研究腈结在碱的存在下,与羟胺反应制备含偕胺肟基螯合纤维的反应因素与吸附性能的关系; 探讨螯合纤维对金属离子的吸附特性并与水解腈给作比较; 用红外光谱表征了螯合纤维的化学结构.螯合纤维对An(3+),Cu(2+),Co(2+),Cd(2+),Pb(2+),Fe(3+),Zn(2+)等金属离子的吸附率为90%~100%,对An(3+)的饱和吸附量为140μg·mg(-1)。     

含氮螯合树脂的合成及性能研究

首次以三乙二醇为起始剂,以二乙烯三胺(DETA)为交联剂合成含氮螯合树脂.考察了温度对树脂吸附性能的影响及树脂的等温吸附过程,在实验研究的浓度范围内,树脂对镍离子的吸附可用Freundlish等温方程来描述.根据Arrhenius经验公式求得平均表观活化能Ea=15.13 kJ.mol-1,指前因子A=0.102.通过红外光谱分析研究树脂的螯合机理.     

由羽毛粉制备复合氨基酸蝥合锌的研究

将超声波技术应用于硫酸水解羽毛粉。经8h水解反应后。氨基酸的生成率可达93．6％。通过正交试验研究了投料比、pH值、螯合温度和螯合时间四个因素对由上述水解所制得的复合氨基酸与硫酸锌反应制备复合氨基酸螯合锌的螯合反应的影响，其对指标螯合率的影响依次为：pH值、螯合温、投料比、螯合时间；最佳的螯合反应条件为：复合氨基酸：硫酸锌=2：1（m／m）。螯合温度90℃，pH值为8，螯合时间为2h。