乙型肝炎病毒促进肝细胞PD-L1蛋白表达机理

为了研究乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)能否借助肿瘤细胞的抗免疫机制来逃逸机体免疫,利用HBV感染去肝细胞,研究受感染后的肝细胞对宿主免疫应答的变化.通过实时荧光定量PCR的方法分析HBV感染后的肝细胞内Axin和PD-L1的转录水平,发现HBV不影响Axin和PD-L1的转录水平,采用蛋白免疫印迹技术发现HBV能下调肝细胞内Axin蛋白水平,同时上调PD-L1蛋白水平.进一步在细胞内转染表达HBV的组成蛋白的质粒,通过蛋白免疫印迹技术发现HBV的组成蛋白HBx能下调细胞内Axin蛋白的表达.通过数据相关性分析以及泛素化实验发现,Axin能通过增加PD-L1的E3泛素连接酶SPOP的表达,促进PD-L1泛素蛋白酶体降解.进一步对PD-L1的泛素化方式进行探讨,发现Axin促进PD-L1的K48依赖的泛素化降解作用.结果表明,HBV可能通过HBx下调Axin和SPOP蛋白水平,抑制PD-L1泛素化降解,进而逃逸宿主免疫应答.本研究揭示了HBV免疫逃逸新机制,为治疗HBV奠定了新的基础,在一定程度上推动了抗HBV药物开发.     

五味子酚对血管性痴呆小鼠学习记忆能力的影响

目的：：研究五味子酚对血管性痴呆小鼠学习记忆能力的影响。方法：小鼠随机分为假手术组、模型组、五味子酚药物组（30、100 mg/kg,ip）。采用双侧颈总动脉结扎法建立血管性痴呆模型,给药2周后用Morris水迷宫测试小鼠学习记忆能力。结果：五味子酚能明显缩短痴呆小鼠找到平台的潜伏期和游泳路程。结论：五味子酚可改善血管性痴呆小鼠的学习记忆能力。     

PTTG1在肝细胞癌中的分子机制研究

肝细胞癌（HCC）是癌症最常见的一种预后不良的原发性肝癌,也是癌症相关死亡的主要原因.垂体肿瘤转化基因1(PTTG1)在多种癌症中过表达.本研究为了评估PTTG1在HCC患者中的表达和预后价值.使用GEPIA(gene expression profiling interactive analysis)数据库分析PTTG1的蛋白表达及其预后特征.KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析发现PTTG1的相关信号通路.采用免疫组织化学方法比较PTTG1在正常肝组织和肝癌组织中的表达.采用流式细胞术、western blot和CCK-8方法评估两种癌症细胞系和正常肝细胞系中PTTG1的分子生物学的功能.采用细胞划痕实验方法评估PTTG1对细胞迁移的影响.GEPIA数据库分析表明, PTTG1在肝癌组织中表达上调并且PTTG1的表达与肝癌细胞的增殖能力呈正相关.另外,细胞实验发现PTTG1被敲低后显著抑制细胞增殖、阻碍细胞迁移、抑制细胞周期、促进细胞凋亡.因此, PTTG1在肝细胞癌的发生以及病程进展中的作用至关重要,可能是肝细胞癌转移...     

ULK1和Beclin1在原发性肝细胞癌中的表达及临床意义

目的:通过检测ULK1和Beclin1在原发性肝细胞癌组织中的表达,结合数个临床病理因素,探讨ULK1和Beclin1在原发性肝细胞癌治疗中的临床意义.方法:手术取得80对肝癌和癌旁组织及20例正常肝脏组织,采用定量Real-time PCR(qPCR)及免疫组织化学技术检测各组织中ULK1和Beclin1的表达情况,联合临床病理因素进行统计分析.结果:ULK1和Beclin1在肝癌中蛋白表达及mRNA的表达,均低于在癌旁组织以及正常肝组织中的表达(P0.05),而癌旁组织与正常肝组织中ULK1和Beclin1的表达的差异无统计学意义(P0.05).ULK1和Beclin1在肝癌组织中的表达可能呈正相关关系(r=0.26,P=0.02).ULK1在肝癌中与性别、年龄、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、术前肝功能分级、甲胎蛋白(AFP)、嗜酒、肿瘤部位及分级无关,与肿瘤大小相关.Beclin1在肝癌中与性别、年龄、HBSAg、术前肝功能分级、嗜酒、肿瘤的部位及分级无关,但与肿瘤的大小及AFP表达相关.结论:ULK1和Beclin1可能通过影响自噬,进而肝癌的发生发展相关联.     

五味子酯甲对HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察五味子酯甲(Schisantherin A,SCA)对人肝癌细胞(HepG2)增殖和凋亡的影响.方法 将体外培养的HepG2细胞分为空白对照组(CON)和SCA 25、50、100μmol/L 3个浓度组.给药48 h后,应用MTT法检测细胞存活率;应用Western blot法检测HepG2细胞Bcl-2、...     

解毒酶GSTM1和GSTT1缺失与广西肝细胞癌相关性研究

为了研究谷胱甘肽硫转移酶 GSTM1和 GSTT1基因多态性与肝细胞癌风险的相关性 ,在广西黄曲霉毒素(AFB1)高污染区 ,用 PCR技术检测肝细胞癌患者和非肝细胞癌成人血样中 GSTM1和 GSTT1的存在或缺失。肝细胞癌组 (HCC) 181例 ,经病理确诊为肝细胞癌 ,对照组 36 0例 ,由非肝细胞癌成人组成。结果显示 ,GSTM1和 GSTT1零基因型的频率在对照组分别为 4 7.8%和 4 2 .7% ,在肝细胞癌组分别为 6 4 .6 %和 5 9.7% ,两组间的差异有非常显著性意义 (P <0 .0 1)。GSTM1和 GSTT1联合零基因型在肝细胞癌组与对照组分别为 38.2 %和18.5 % ,两组间差异有显著性意义 (P <0 .0 5 )。说明 GSTM1和 GSTT1零基因型在当地与 AFB1诱发肝细胞癌的风险相互关联。     

肝细胞癌铜死亡标志物SLC31A1、DBT的鉴定及化合物筛选

探究铜死亡相关基因对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的影响,并挖掘治疗HCC的活性成分。通过GEO数据库下载GSE84402数据集,获取肝癌差异表达基因,通过文献检索铜死亡相关基因,两者取交集获得肝癌相关铜死亡基因。进一步分析交集基因,使用UALCAN分析其差异表达,R语言分析其表达水平与临床的相关性,Kaplan-Meier Plortter分析其预后价值,HCMDB分析其与肝癌转移的关系,并使用THPA分析其与肝癌的病理关系。最后进行化合物预测与分子对接。结果表明,与正常组相比,铜死亡关键基因SLC31A1、DBT在肿瘤中表达水平下调,病理分析显示其蛋白在HCC组织中表达增加,且与临床相关性变量性别、肿瘤分期、淋巴结转移显著相关,其高表达与肝癌预后良好相关,其中SLC31A1低表达与肝癌向肾上腺、肺部转移显著相关。最后筛选出可能与SLC31A1、DBT结合的活性化合物,其中白藜芦醇、叶酸对接分数高。研究认为铜死亡相关基因SLC31A1、DBT在HCC的发生发展中起重要作用,为HCC的诊断及治疗药物研究提供了新思路。     

HMGA1对肝细胞癌的增殖、迁移和细胞周期的作用影响

目的:探究HMGA1对肝癌细胞增殖、迁移及细胞周期的影响。方法:通过生物信息学、qRT-PCR、蛋白质印迹法分析HMGA1在正常肝组织与肝癌组织、正常肝细胞与肝癌细胞中的表达及其表达量与患者生存期的关系;通过GO和KEGG通路分析HMGA1及其相关基因在肝癌细胞生理活动中可能发挥的作用;MTT、克隆形成、Transwell实验及流式细胞术用于分析下调HMGA1对肝细胞癌的增殖、迁移、凋亡和细胞周期的影响。结果:与正常肝组织比较,肝癌组织HMGA1表达上调,且表达水平与患者生存期呈负相关;筛选得出451个正相关基因和398个负相关基因在TCGA-LIHC和GSE15765两个数据集中都具有统计学意义,KEGG和GO分析结果表明HMGA1及其相关基因参与组成细胞组分,并主要影响肿瘤细胞的分裂增殖、转录调控、氧化还原过程和代谢过程等;下调HMGA1抑制肝癌细胞的细胞活力、迁移,诱导细胞凋亡并阻滞细胞周期;敲低HMGA1使肿瘤体积缩小、重量减轻。结论:HMGA1可能作为原癌基因促进肝癌细胞的生长。     

基于生物信息学对肝细胞癌潜在枢纽基因的筛选及验证

目的:筛选网络数据库中肝细胞癌组织与非癌性肝组织中差异表达的基因,并探讨其中适合作为早期筛查肝癌及治疗晚期肝细胞癌(HCC)的分子标记.方法:从GEO数据库中下载3个数据集GSE121248、GSE101685和GSE14520,筛选差异表达显著的基因(DEGs),并对其进行基因功能富集和信号通路富集分析,利用STRING网站构建对应蛋白的相互作用网络,导入Cytoscape软件后用CytoHubb插件筛选处于关键位置前10位的枢纽基因.利用Kaplan-Meier生存分析比较枢纽基因表达差异对肝癌患者平均生存率的影响,并通过GEPIA验证枢纽基因在肝癌组织中的表达变化情况,进一步分析各枢纽基因所涉及的信号通路.结果:数据集GSE121248、GSE101685和GSE14520分别筛选出为187、536和253个DEGs(|log_2FC|2, adj.P0.01).Venn图显示3个数据集中共同包含的DEGs有87个,其所涉及的细胞功能为类固醇代谢和氧化还原酶活性,所涉及的通路为视黄醇代谢及p53信号通路.87个DEGs对应的69个蛋白的相互作用网络中,筛选最大团中心性(maximal clique centrality, MCC)前10位的枢纽基因为CDK1、CCNB1、TOP2A、PRC1、ECT2、RACGAP1、DTL、RRM2、ASPM和ESR1.Kaplan-Meier生存分析提示9个基因(CDK1、CCNB1、TOP2A、PRC1、ECT2、RACGAP1、DTL、RRM2和ASPM)高表达可能导致HCC患者的总生存期(OS)较差,而ESR1基因高表达时患者OS延长(P0.05).GEPIA分析369例HCC组织和160例正常肝组织的结果显示,CDK1、CCNB1、TOP2A、PRC1、ECT2、RACGAP1、DTL、RRM2和ASPM表达升高,而ESR1表达下调(|log_2FC|1,P0.05).这10个枢纽基因所涉及的信号通路主要为p53信号通路、细胞周期和孕酮介导的卵母细胞成熟.结论:9个枢纽基因CDK1、CCNB1、TOP2A、PRC1、ECT2、RACGAP1、DTL、RRM2和ASPM的高表达以及ESR1的低表达与肝癌患者的不良生存率密切相关,提示它们作为检测对象预测肝癌预后及作为干预靶点改善肝癌预后的可能.     

基于网络药理学预测双莲方对肝细胞癌作用的机制

文章通过GEO数据库获取肝细胞癌样本差异表达基因,利用中药系统药理学数据库及 在线分析平台TCMSP收集双莲方的主要成分及作用靶点,通过Cytoscape构建双莲方中主要成分 的作用靶点与肝细胞癌相关基因的关系网络,预测双莲方治疗肝细胞癌的关键靶点基因,并利用 DAVID进行GO和KEGG富集分析,探讨双莲方治疗肝细胞癌的可能机制。结果表明,从双莲方中 筛选出225种活性成分,与肝细胞癌重合的靶点有28个,主要与肝细胞癌细胞中的激素代谢过程、 蛋白激酶复合物、细胞因子活性等关联,可能通过参与TNF信号通路、P53信号通路、Toll样受体信 号通路等发挥治疗肝细胞癌的潜在作用。研究结果为更深入地研究双莲方对肝细胞癌的作用提 供了理论依据。     

基于裸鼠模型研究EGFL9对肝癌细胞增殖、转移能力的调控作用

目的:旨在通过裸鼠模型分析EGFL9对肝癌细胞增殖、转移能力的影响。方法:通过慢病毒介导的小干扰RNA技术构建EGFL9沉默的JHH-7肝癌细胞系。采用MTT生长曲线分析EGFL9对JHH-7肝癌细胞增殖能力的影响。采用裸鼠皮下成瘤实验和尾静脉注射转移实验观察EGFL9基因在动物活体内对JHH-7肝癌细胞增殖、转移能力的影响。结果:荧光显微镜观察结果显示JHH-7^shEGFL9组和JHH-7^shCtrl组肝癌细胞慢病毒感染效率高于80%,qRT-PCR检测结果显示JHH-7^shEGFL9组EGFL9干扰效率达98.3%,提示EGFL9沉默的JHH-7人肝癌细胞系构建成功。MTT生长曲线结果提示,JHH-7^shEGFL9组肝癌细胞的增殖能力明显低于JHH-7^shCtrl组(P<0.05)。裸鼠皮下成瘤实验显示,JHH-7^shEGFL9组裸鼠皮下肿瘤的质量[(0.246±0.104)g vs(0.710±0.221)g]和瘤体体积均显著小于JHH-7     

p53蛋白与肝细胞癌临床病理特征及预后的关系

目的 探讨p53蛋白表达与肝细胞癌的临床病理特征及预后的关系,为术后综合治疗及判断预后提供依据。方法 采用免疫组织化学方法检测88例肝细胞癌组织中p53蛋白的表达,比较阳性患者和阴性患者的临床病理因素和术后累积复发率、术后累积生存率的差异。结果 p53蛋白表达阳性组1、2、3累积生存率分别为75．0％、54.4%、24．2％,阴性组相应的分别为84．3％、77．8％、56．1％。与阴性组相比,p53蛋白阳性组有较高的术前AFP浓度（P=0．005）、有较大的肿瘤最大直径（P=0．042）、肿瘤包膜不完整或无包膜者多见（P=0．023）。结论 p53蛋白是评价肝细胞癌恶性程度及预后的一个有价值的生物学指标。     

抗人PD-L1单克隆抗体的瞬转表达

利用HEK293 6E细胞瞬转表达抗人PD L1单克隆抗体. 将HEK293 6E细胞无血清悬浮培养, 筛选最佳生长培养基; 考察HEK293 6E细胞的筛选表达培养基、 DNA和PEI质量比及转染时细胞密度等转染条件, 并对收获的抗体进行SDS PAGE和ELISA鉴定. 结果表明: 在A无血清表达培养基中, 以2×106个/mL的细胞密度和m(DNA)∶m(PEI)=1的条件转染, 第4天收获抗体的产量最高, 为170.9 μg/mL; 收获PD-L1抗体的重链分子量约为50 000, 轻链分子量约为25 000.     

基于非标记定量技术的肝细胞癌血浆蛋白质组学研究

采用非标记定量蛋白质组学技术获得10例肝细胞癌患者和10例健康人的血浆样本蛋白质组表达谱数据,并对其细胞定位与功能进行注释分析.利用修正t-检验算法对差异蛋白质进行筛选,通过DAVID平台分析软件对差异蛋白质进行功能注释分析,发现了一系列潜在的肝细胞癌血浆诊断生物标志物,包括16个肝细胞癌血浆上调蛋白质和15个下调蛋白...     

PD-1/PD-L1抗体阻断药物的研究进展与临床应用

研究发现在生理状况下PD-1与PD-L1相互识别能产生负向信号,该信号通路一旦被激活后,可诱导抗原特异性效应T细胞凋亡,该生理效应可防止过度免疫反应带来的附加损伤,因此该信号通路又被形象的称为“免疫刹车”.如果利用特异性阻断剂阻断PD-1/PD-L1信号通路,便可以恢复免疫细胞的杀伤抑制功能.截止至2019年12月,全...     

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD-L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP)序列,构建含有PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株。根据CRISPR-Cas9靶点设计原则,针对PD-L1基因终止密码子设计两对sgRNA,退火形成双链后连接至Lenti-V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证。对于正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率。根据靶点位置设计左同源臂+GFP+右同源臂序列合成Donor片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证。将验证成功的Lenti-V2-sgRNA和pUC19-donor-GFP共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP表达情况,菌落PCR及基因测序验证GFP报告基因的靶向插入效果。经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD-L1的Cas9载体Lenti-V2-gRNA和含GFP基因的Donor质粒pUC19-donor-GFP构建成功。两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察、多克隆验证、单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP成功转入HT29细胞并进行了...