HMGA2的结构、功能及调控机制

前言 核小体是染色质的基本单位, 由DNA和核心组蛋白八聚体 (H2A、H2B、H3和H4各两分子)组成,并由不同的蛋白质〔包括组蛋白H1和高迁移率组(HMG)蛋白〕组成高级结构.     

细胞自噬与高迁移率族蛋白B-1(HMGB1)介导肿瘤耐药的研究进展

恶性肿瘤可通过多种细胞机制,产生对抗癌药物和放疗的抗性,即所谓耐药现象.细胞自噬是肿瘤细胞耐药的一个重要原因.高迁移率族蛋白B-1(HMGB1)是高度保守的非组蛋白DNA结合蛋白,在DNA结构、基因转录、基因重组、DNA损伤修复以及细胞存活等方面发挥重要的调控作用;HMGB1在细胞内的功能,与其氧化还原状态和细胞定位息...     

绿草履虫Paramecium bursaria大核染色质组份和组蛋白的研究

绿草履虫P.bursaria是在接有产气杆菌Aerobacter aerogems的无菌稻草提取液中进行克隆培养后取得的。在非离子去污剂NP-40(含有二价阳离子Ca~(2 ),Mg~(2 ))的溶液中裂解细胞,经蔗糖梯度离心分离、提纯细胞大核,并制备染色质,测定其中组蛋白、非组蛋白、DNA和RNA的相对含量。用稀酸抽提绿草履虫大核和大核染色质,得到的酸溶性蛋白(即组蛋白),经PAGE、SDS-PAGE、PAGIF和氨基酸分析等方法测定。得到的结果是:绿草履虫大核染色质中DNA:RNA:组蛋白:非组蛋白=1:0.02:1.30:0.59;组蛋白占染色质蛋白质的68.8％;大核和大核染色质的酸溶性蛋白是相同的,都具有相当于高等动物的全组蛋白的五条组蛋白带,只在其相对含量及电泳迁移率上,与高等动物的全组蛋白略有差别;由16种氨基酸组成,20％是酸性氨基酸,不存在色氨酸和半胱氨酸;五条蛋白带的分子量为1.1000～21000道尔顿,也类似于哺乳动物细胞组蛋白;这是一类碱性很弱的蛋白质,等电点为pH8.02～9.4;碱性氨基酸和酸性氨基酸的比为1.03:1,这一点却更接近酵母全组蛋白。     

绿草履虫Parameciumbursaria大核染色质组份和组蛋白的研究

绿草履虫P.bursaria是在接有产气杆菌Aerobacter aerogenes的无菌稻草提取液中进行克隆培养后取得的.在非离子去污剂NP-40(含有二价阳离子Ca~(2+),Mg~(2+))的溶液中裂解细胞,经蔗糖梯度离心分离、提纯细胞大核,并制备染色质,测定其中组蛋白、非组蛋白、DNA和RNA的相对含量.用稀酸抽提绿草履虫大核和大核染色质,得到的酸溶性蛋白(即组蛋白),经PAGE、SDS-PAGE、PAGIF和氨基酸分析等方法测定.得到的结果是:绿草履虫大核染色质中DNA:RNA∶组蛋白∶非组蛋白=1∶0.02∶1.30∶0.59;组蛋白占染色质蛋白质的68.8%;大核和大核染色质的酸溶性蛋白是相同的,都具有相当于高等动物的全组蛋白的五条组蛋白带,只在其相对含量及电泳迁移率上,与高等动物的全组蛋白略有差别;由16种氨基酸组成,20%是酸性氨基酸,不存在色氨酸和半胱氨酸;五条蛋白带的分子量为11000～21000道尔顿,也类似于哺乳动物细胞组蛋白;这是一类碱性很弱的蛋白质,等电点为pH 8.02～9.4;碱性氨基酸和酸性氨基酸的比为1.03∶1,这一点却更接近酵母全组蛋白.     

原生动物四膜虫(TetrahymenaS1)高迁移率非组蛋白的研究

利用原生动物四膜虫(Tetrahymena shanghaiensis S1)作材料,经高氯酸抽提,丙酮沉淀等方法,制备取得高迁移率的非组蛋白。在高分辨率的乙酸一脲电泳图谱上,具有小牛胸腺所具有的典型的全部蛋白带。此外还含有一些未经检测的蛋白带。作者认为这些多余蛋白带可能是四膜虫所特有的高迁移率的非组蛋白。     

原生动物四膜虫(TetrahymenaS1)高迁移率非组蛋白的研究

利用原生动物四膜虫(TetrahymenashanghaiensisS1)作材料,经高氯酸抽提,丙酮沉淀等方法,制备取得高迁移率的非组蛋白。在高分辨率的乙酸一脲电泳图谱上,具有小牛胸腺所具有的典型的全部蛋白带。此外还含有一些未经检测的蛋白带。作者认为这些多余蛋白带可能是四膜虫所特有的高迁移率的非组蛋白。     

四膜虫有性生殖过程中特异表达基因TCD3的序列分析

含有CHROMO(chromatin organization modifier)结构域的蛋白参与了染色质结构的调节.本研究从嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)全基因数据库(www.ciliate.org)和基因表达数据库(tged.ihb.ac.cn)中筛选到有性生殖特异表达TCD3(Tetrahymena chromo domain-containing protein 3)基因.该基因ORF为1 005bp,大核染色体中基因全长1 241bp,含有两个内含子.5′-RACE和3′-RACE表明5′端非编码区(5′-UTR)长度为40bp,3′端非编码区(3′-UTR)长度为90bp.TCD3基因预测编码334个氨基酸构成,含有一个CHROMO结构域.CHROMO结构域聚类分析表明四膜虫Tcd3蛋白可能与线虫CeCDP功能类似,参与异染色质的形成和DNA序列删除.     

八肋游仆虫中ECD1基因的克隆及序列分析

含有CHROMO(chromatin organization modifier)结构域的蛋白参与了异染色质的形成及转录沉默复合物的形成.原生动物游仆虫细胞中既含有转录活跃的大核也含有转录沉默的小核.本实验应用PCR技术从八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)中获得了一个编码含有CHROMO结构域的基因ECD1(Euplotes chromo domain-con-taining protein 1)(GeneBank登录号为FJ357578).大核中含有该基因的微小染色体全长1105 bp.小核中该基因内无内部删除序列IES的存在.通过RT-PCR,证实该基因开放阅读框为645 bp.大核基因中含有三个内含子,转录过程中这些内含子均符合一类内含子GU-AG剪切规则.DNAstar软件分析,该基因编码的蛋白质包含214个氨基酸,分子量24.7 kDa,等电点为5.48.结构域聚类分析表明Ecdl蛋白可能执行与四膜虫异染色质蛋白Pddlp和Pdd3p相似功能,参与大核发育过程中异染色质的形成和IES序列的删除.     

Cis-platin去似织毛虫Histriculus similes 小核的研究

用4种浓度的cis-platin(顺式二胺二氯铂)处理似织毛虫的G1期细胞，共建立无小核细胞系7个。所有被处理的细胞都要经历一个生长抑制期，无小核细胞的获得率与cis-platin的浓度和处理时间有密切的关系。所有失去小核的细胞核，约70％的细胞的大核形态和数目异常。结果表明：似织毛虫的小核对于保持大核形态和数目的稳定性发挥着明显的作用。     

四膜虫锌指结构蛋白Zfp1影响离子胁迫下金属硫蛋白基因的表达

金属硫蛋白对细胞的环境应激起到重要的调节作用,在重金属离子胁迫下上调表达。然而其具体的表达调节机制并不清楚。本研究从嗜热四膜虫克隆了锌指蛋白基因ZFP1(TTHERM-01002770),ZFP1基因无内含子,全长2 160bp,编码719aa。构建了ZFP1敲除载体pN-ZFP1,通过同源重组的方法敲除ZFP1基因获得ZFP1敲除的突变细胞。ΔZFP1对Cu2+和Cd2+的EC50值分别为53.0μmol/L和25.3μmol/L,低于野生型细胞83.1μmol/L和32.8μmol/L.Cu2+胁迫下,ΔZFP1突变细胞中MTT2、MTT3、MTT4和MTT5的转录水平降低,MTT1转录水平上调;Cd2+诱导下,MTT4转录水平降低,MTT1、MTT2、MTT3和MTT5的转录水平上调,敲除ZFP1基因影响了细胞对Cu2+和Cd2+的耐受性,ZFP1的缺失导致Cu2+和Cd2+诱导下金属硫蛋白基因转录水平变化。结果表明Zfp1参与了金属离子胁迫下嗜热四膜虫金属硫蛋白基因的表达水平。     

参附注射液通过调节核内HMGB1和NF-κB结合发挥抗炎活性的机制

探讨参附注射液（Shenfu injection,SFI）对脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）诱导的RAW264.7细胞的抑炎作用及其潜在机制。采用LPS诱导野生型RAW264.7细胞制作炎症细胞模型,经参附注射液不同剂量进行干预,RT-qPCR、WB和ELISA检测细胞内促炎因子,包括诱导型一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase,iNOS）、白介素?1β（interleukin-1β,IL-1β）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α,TNF-α）的转录、翻译和分泌水平,评价参附注射液的抗炎作用;构建高迁移率组蛋白B1（high mobility group protein B1,HMGB1）过表达RAW264.7细胞（HMGB1+-RAW264.7）和HMGB1点突变RAW264.7细胞（HMGB1m-RAW264.7）,通过免疫荧光检测野生型、HMGB1+和HMGB1m-RAW264.7细胞中HMGB1的核移位情况,采用哺乳动物双杂交法和免疫共沉淀法检测HMGB1、P65和P50的结合率,以探讨核内HMGB1在炎症反应中的作用及SFI抗炎的潜在分子机制。结果表明：SFI可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中iNOS、IL-1β和TNF-α的转录、表达和分泌（P＜0.01）。SFI能抑制HMGB1向核外迁移,使其高表达于核内。核内高表达HMGB1可使RAW264.7细胞对LPS的耐受度增加。在1μg/mL浓度LPS诱导下,HMGB1+-RAW264.7细胞中TNFα和IL-1β的转录和表达水平均升高,且SFI能逆转这一现象。HMGB1m-RAW264.7细胞中TNFα和IL-1β与对照组无差异。SFI可增加核内HMGB1与P65、HMGB1与P50的结合率（P＜0.01）,减少P50与P65的结合率。试验结果表明：SFI可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应;其作用途径可能是通过抑制HMGB1出核,竞争性结合P65和P50合,减少P65-P50二聚体的形成,进而抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路的激活。     

组氨酸对DNA电荷逆转和凝聚的影响

以组氨酸为研究对象，通过动态光散射观察到当组氨酸浓度为1 mg/mL时，电泳迁移率由负变为正，DNA发生电荷逆转。同时通过原子力显微镜可以观察到，随着组氨酸浓度的升高，DNA分子逐渐堆积折叠，直至在组氨酸浓度为1 mg/mL时凝聚成球，说明了组氨酸可以导致DNA凝聚和电荷逆转。由于组氨酸的等电位点为7.59，相信组氨酸侧链的质子化和去质子化对其带电状态起调节作用。作为生物体内的基本遗传物质，DNA影响着生物的生长发育，与细胞癌变、突变等异常活动也息息相关。在细胞中，组蛋白是DNA染色体的重要组成部分，在DNA的转录和复制等过程中调节DNA的凝聚状态。组氨酸是组蛋白的主要成分，研究组氨酸对DNA凝聚以及相关的电荷逆转过程的影响，对于理解组蛋白的调控作用有重要的基础意义。     

似织毛虫的小核体功能的研究

用四种浓度的Cis-platin（顺式二胺二氯铂）处理似织毛虫的G1期细胞，共建立无小核细胞系7个。所有被处理的细胞都要经历一个生长抑制期，其无小核的得率与Cis-platin的浓度有着密切的关系。活体观察表明，所有失去小核的细胞体积变小，活动能力减慢。蛋白银染色观察显示，无小核细胞口围带变短，约30％的细胞的口围带小膜数比对照组减少，约70％的细胞其大核形态和数目异常。结果说明；似织毛虫的小核对于保持其正常的大核数目和形态结构以及口围带结构的正常大小起着明显的作用。     

对于核小体定位检测方法的比较研究

在真核细胞中,核小体是组成染色质的基本结构单位,是由DNA紧密缠绕在组蛋白八聚体上所形成的一个复合体结构。而DNA与组蛋白的结合并不是固定不变的,没有核小体结合的DNA区域易于各种调节蛋白的接近与结合。因此人们怀疑核小体的定位与基因的转录调节之间存在某种内在联系。对现行的核小体定位的检测方法进行了归类,并对其优缺点进行了分析整理。对更深入的探索核小体定位检测方法的应用有一定意义。     

中枢神经系统来源的HMGB1表达模式和释放特征

目的:阐明生理病理状态下,中枢神经系统(CNS)来源的高迁移率族蛋白1(HMGB1)细胞定位、亚细胞定位和释放特征.方法:使用Western Blot和细胞免疫荧光双标记法检测HMGB1在细胞株(U87, BV2和N2a)和原代星形胶质细胞、神经元的表达模式和释放特征.用PTX和/或ATP处理培养细胞,Western Blot检测浓缩上清中HMGB1蛋白表达,台盼蓝拒染法检测细胞的生存率.结果:HMGB1定位于U87、BV2、N2a,原代星形胶质细胞和神经元的细胞核,位于目的条带25 KDa位置. PTX和/或ATP能诱导U87和BV2主动分泌HMGB1,N2a细胞被动释放HMGB1.结论:生理状态下,星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元细胞核表达HMGB1,属于HMGB1来源,HMGB1具有CNS释放特征.     

双元载体提供组蛋白H3/H4拷贝1的elp3Δ菌株的构建

人Elongator是在转录中有功能的组蛋白乙酰转移酶(HAT)复合物,为研究其催化亚基Elp3功能,构建了酵母组蛋白H3/H4拷贝1的双元表达载体pRS316CFT,通过PCR介导的基因敲除,获酵母基因组H3/H4缺失由双元载体提供单拷贝H3/H4的elp3Δ菌株.敏感性实验表明该载体提供H3/H4可维持酵母正常生长.本工作为构建H3/H4乙酰化位点突变菌株,用功能互补在体内研究人Elp3 HAT活性功能奠定了基础.     

纤细裸藻褪色突变株的残留质体及其对核基因表达的影响

用氧氟沙星(Ofl)和链霉素(Sm)分别处理纤细裸藻获得褪色突变株.电子显微镜观察显示细胞中存在残留质体,其中一个Ofl突变株质体有原初类囊体膜形成,而两个Sm突变株质体内有异常致密、发达的膜结构.用PCR方法检查了质体DNA的9个基因,显示所有突变株均有核糖体蛋白基因丢失,其中一个Sm突变株仍保留质体DNA的大部分基因,其余突变株质体DNA则基本丢失.通过差异显示和RT-PCR方法证明叶绿体的退化在完全黑暗异养条件下也可导致某些核基因转录的变化.     

布鲁氏菌043强毒株BR0524基因缺失突变株的构建与毒力的初步评价

为研究BR0524基因对羊种布鲁氏菌043毒力的影响,本研究利用同源重组的原理,以BR0524基因外侧的同源臂序列构建重组质粒,将其电转化至布鲁氏菌043感受态细胞,通过卡那抗性筛选和检测引物鉴定之后进而获得羊种布鲁氏菌043-ΔBR0524缺失突变株,且该缺失突变株在15代内未发生回复性突变,遗传性稳定。将羊种布鲁氏菌043-ΔBR0524缺失突变株、羊种布鲁氏菌043和M5以106 CFU剂量腹腔接种小鼠,进行体内感染试验,并以布鲁氏菌与小鼠巨噬细胞为100∶1的感染比例侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7。结果表明:与羊种布鲁氏菌043相比,羊种布鲁氏菌043-ΔBR0524缺失突变株的载菌量几乎没有下降(P0.05),对小鼠脾脏重量变化的影响也趋于相似(P0.05);侵染小鼠巨噬细胞试验结果与动物感染试验结果也趋于一致(P0.05),这表明BR0524基因的缺失不会对羊种布鲁氏菌043毒力功能的发挥产生显著的影响。     

结核分枝杆菌标准株mazEF6缺失株的构建

为构建结核分枝杆菌标准株H37Rv毒素-抗毒素系统maz EF6基因缺失突变株。采用聚合酶链反应(PCR)技术,分别从H37Rv和PUC-19K质粒上扩增出maz EF6基因的同源臂及卡那霉素抗性基因kan基因;应用融合PCR技术将maz EF6基因的同源臂和kan基因进行杂交拼接,获得目的融合片段,并将该融合片段克隆于p MD-19T(simple)载体形成自杀质粒p MD-19T-Δmaz EF6-kan,将构建的自杀质粒转化至大肠杆菌DH5a中;利用电穿孔技术将自杀质粒电转至H37Rv标准株中;并将该菌株涂于卡那霉素抗性改良罗氏培养基,培养3-4周后,刮取能在卡那霉素抗性培养基中生长的结核分枝杆菌单个菌落,以提取的阳性菌株全基因组DNA为模板,PCR扩增克隆片段,并测序。对所获得H37RvΔmaz EF6缺失突变株进行遗传稳定性检测。结果显示,该缺失株在15代内未发生回复性突变,成功获得H37RvΔmaz EF6缺失突变株。由此可知,本研究为今后研究毒素-抗毒素系统maz EF6基因的生物学功能奠定基础。     

构建HMGB1/PEI非病毒载体介导高效基因传递的研究

 研究了以聚乙烯亚胺（PEI）为骨架复合高迁移率族蛋白 B1 (HMGB1 )的复合型载体HMGB1/PEI的性能,以期提高非病毒基因载体的转染效率。透射电镜观察pDNA/HMGB1/PEI复合物粒子形态呈球形;动态光散射法测定粒径与表面电位,结果显示复合HMGB1后,复合物粒径降低,且随HMGB1加入量的增大表面电位有增大的趋势;凝胶电泳阻滞试验表明HMGB1可协助PEI与pDNA结合;MTT试验结果显示HMGB1/PEI复合载体的细胞毒性低于PEI;HMGB1/PEI复合载体的转染率较PEI的转染率增大2.9~4.0倍,且HMGB1可以弱化血清对转染的阻碍作用。所以HMGB1被证实能有效提高PEI的体外转染效率。