大豆灰斑病抗病基因RAPD标记的分子特征及抗、感种质的SCAR标记鉴定

与大豆灰斑病抗病基因连锁的共显性标记ＯＰＳ０３６２０＆５８０的２个特征片段ＯＰＳ０３６２０和ＯＰＳ０３５８０的全序列分析表,共显性分离的主要原因在于引物扩增区域内３０ｂｐ的插入Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交显示,ＯＰＳ０３６２０来源于大豆基因组中的单拷贝序列,可用作ＲＦＬＰ探针。     

大豆对灰斑病菌7号小种抗性的遗传分析及抗病基因的RAPD标记

对杂交组合东农91212（感7号小种）×东农9674（抗所有小种）的抗性分析表明,大豆对7号小种的抗性受单显性基因控制。运用BSA法筛选到3个与抗病基因连锁的RAPD标记。其中引物OPSO3扩增的2个标记OPSO3_(620)和OPSO3_(580)具有共显性的分离特点。OPSO3_（620）与抗病基因的遗传距离为8.7cM。根据该标记选择基因型纯合和杂合的抗病植株,其符合率分别达到100％和97.6％。     

大豆中NBS类抗病基因同源序列的分离与鉴定

植物抗病原克隆研究对于植物抗病育种和抗病机制的理解具有重要意义。根据预测结构域可将已知植物抗病基因分为4类,其中以NBS（nucleotide binding site)结构域为主。NBS结构域包括P环（激酶1a)、激酶2a和激酶3a。这为利用同源技术克隆植物抗病基因提供了可能。根据烟草抗花叶病毒N基因和拟南芥抗丁香假单孢杆菌RPS2基因设计兼并引物,从大豆抗花叶病毒品种科丰1号的基因组中扩增获得358个克隆,鉴定出4个能读的且与抗病基因NBS结构域同源的片段：KNBS1,KNBS2,KNBS3和KNBS4.Southern杂交表明NBS类抗病基因在大豆中为多拷贝家族;RFLP分析将KNBS4定位于F连锁群,而NBS2则与大豆抗花叶病毒基因Rsa的SCAR标记同位于J连锁群。Northern分析表明KNBS2类在大豆的根、茎和叶中为低丰度组成型表达,这为最终克隆大豆抗病基因打下了基础。     

水稻品种Jasmine85抗纹枯病主效QTLs的分子标记定位

对水稻抗病品种Ｊａｓｍｉｎｅ８５与感病品种Ｌｅｍｏｎｔ的杂交组合构建Ｆ２世代的单株无性系群体,以牙签嵌入法对１２８个无性系群体进行纹枯病菌接种,选择极端抗感无性系构建抗感近等基因池。用９４个均匀分布于１２条染色体上的多态性探针,与抗感近等基因池进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,从池间筛选出３个阳性多态性分子标记,进而检测到３个主效抗病ＱＴＬｓ。     

玉米大斑病抗性基因Ht2的精细定位

精细定位玉米大斑病抗性基因Ht2对于图位克隆该基因和探讨玉米基因组中抗病基因的分布规律及分子标记辅助选择有重要意义。以大斑病的感病自交系“获白”为母本，抗病自交系“77Ht2”为父本，构建了F2作图群体。通过RFLP分析知，Ht2基因定位在第8染色体的UMC89和BNL2．369之间，与BNL2．369相距0．9cM。然后选用在该区域的SSR标记进行了加锁分析，确定了SSR标记UMC1202，BNLG1152，UMC1149与Ht2基因紧密连锁，其中UMC1149与Ht2基因的距离为7．2cM。利用BSA法从450个RAPD引物的扩增产物中筛选出7个可能与Ht2基因连锁的标记，并将其中单拷贝标记转换为SCAR标记。连锁分析表明，一个SCAR标记（定名为SD－06633）距Ht2基因0．4cM。在此基础上，构建了Ht2基因所在区域的分子标记连锁图。     

两个来源于野生稻的抗褐飞虱新基因的分子标记定位

选用抗源来自药用野生稻（Oryza offcinalis Wall)的抗褐飞虱品系B5为父本,与感虫品种台中本地1号（TN1）杂交,随机选取167个F2单株构成定位群体。运用RFLP技术,采用集团分离分析法（bulked segregant analysis,BSA),对水稻抗褐飞虱基因进行分子标记定位。于第3和第4染色体找到与抗褐飞虱基因连锁的RFLP标记。构建了连锁标记附近区域的RFLP遗传连锁图谱,对这两个抗位点进行了QTL（quantitative trait locus)分析,将这两个抗褐飞虱基因分别定位于第3染色体的G1318和R1925,第4染色体的C820和S11182之间。与已报道的水稻抗褐飞虱基因位点相比较,表明这两个抗褐飞虱基因是新的抗性位点。抗褐飞虱基因新位点的发现和分子标记的建立,为水稻抗虫分子标记辅助育种和抗褐飞虱基因克隆打下了良好基础。     

豌豆种传花叶病毒抗病基因sbm-1的RAPD标记

与抗病性状连锁的DNA标记对抗病后代的选择和抗病基因的克隆提供了非常有用的工具。豌豆种传花叶病毒(PSbMV)是由种子,并经蚜虫非持久性传播的病毒,有3个株系:P-1,L及P-4,其中以P-1株系分布最广。系列研究表明:4个隐性基因控制着对3个株系的抗性,其中sbm-1对P-1,sbm-2及sbm-3对L及其相关的L-1,而sbm-4则对P-4。1993年新西兰的Timmerman首次报道了sbm-1的RFLP(restriction fragment length polymorphism)标记,但遗传距离较大,为8cM。本研究根据BSA(bullked segregant analysis)方法,鉴定了与sbm-1连锁的RAPD(random amplified polymorphic DNA)标记。     

水稻全基因组R基因鉴定及候选RGA标记开发

用45个已知功能的植物抗病(R)基因序列对粳稻全基因组序列进行搜索, 共找出2119个R基因同源序列或类似物(RGA), 表明RGA在水稻基因组中成簇存在, 呈非随机分布. 采用隐马尔柯夫模型(HMM), 将这些RGA按其功能域分成了21类. 将粳稻的RGA与籼稻的基因组序列进行比较, 共找到702个两亚种间等位的RGA, 并发现其中有671个(占95.6%)RGA的基因组序列(包括编码区和非编码区)在两亚种间存在长度差异(InDel), 表明水稻RGA在两亚种间存在很高的多态性. 通过在InDel两侧设计引物并进行e-PCR验证, 共开发出402个基于PCR的、表现为共显性的候选RGA标记. 这些候选标记在两亚种间的长度差异在1~742 bp之间, 平均为10.26 bp. 有关数据均可从我们的网站(http://ibi.zju.edu.cn/RGAs/index.html)上获得.     

国外种质拓宽中国大豆品种遗传基础的SSR标记分析

利用系谱追踪与SSR (simple sequence repeats)标记分析了大豆品种绥农14号和合丰25号的遗传组成, 旨在揭示国外种质在拓宽中国大豆优良品种遗传基础的贡献, 为有效利用国外种质培育大豆优良品种提供依据. 聚类分析结果表明, 利用日本种质十胜长叶和美国种质Amsoy作亲本育成的、包括绥农14号和合丰25号在内的中国大豆品种与其系谱中其他品种存在明显差异. 与其他祖先亲本相比, 十胜长叶与绥农14号或合丰25号有较大的亲本系数, Amsoy与绥农14号有较大的亲本系数. 绥农14号和合丰25号的遗传相似性高达60.58%, 在20个LG中, 以I, L和C2这3个LG上相似的染色体片段较长. 在两个国外种质特有SSR变异位点中, Amsoy有5个传递给绥农14号, 十胜长叶有3个传递给绥农14号. SSR标记与农艺性状的关联分析发现, 十胜长叶的 satt513与百粒重显著相关, Amsoy的satt192, satt545与油份显著相关, satt499与百粒重相关, 推测与国外SSR特有等位变异相关的优异性状经合丰25号传给绥农14号在我国大豆品种改良中发挥了重要作用.     

利用绿色荧光蛋白研究大豆疫霉与大豆的互作

利用卵菌Bremia lactucae的hsp70启动子和ham34终止子序列, 将外源绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因转化进大豆疫霉. 利用荧光显微镜观察了gfp基因在大豆疫霉不同发育阶段的表达. 另外, 利用该报告基因系统观察了大豆疫霉在寄主大豆叶片、下胚轴和根部的侵染行为以及显微分析了不同抗性的大豆品种抗大豆疫病在根部的差异. 结果表明, gfp基因能够在大豆疫霉中稳定表达, 在菌丝、游动孢子囊、游动孢子、休止孢、卵孢子阶段都能够观察到绿色荧光; 以GFP作为标记可以实时地观察到大豆疫霉在寄主体内的侵染过程, 发现大豆疫霉在抗性大豆品种根部表面萌发的芽管明显长于在感病品种根部萌发的芽管长度. 结果表明, GFP可以作为大豆疫霉遗传研究中有价值的分子标记.     

利用微卫星标记扩充水稻双单倍体群体的遗传图谱

微卫星标记已在人类与动物的遗传作图中得到了广泛应用.微卫星标记所揭示的是简单顺序长度多态性(Simple Sequence Length Polymorphism,SSLP),可利用PCR方法检测,因而快速简便,而且所需DNA量少.微卫星标记在遗传分析中表现为共显性,具有高度的多态性,往往有多个等位形式存在,信息含量很高,目前,在植物中微卫星标记主要用于基因型分析,品系分析及基因定位,尚未大规模用于遗传作图,在水稻中,通过筛选基因组文库和检索DNA序列库,已经获得了58个微卫星标记.本研究对一个水稻双单倍体(DH)群体进行了微卫星标记遗传作图工作,将89个微卫星标记较均匀地定位在已有的遗传图谱上,为今后应用微卫星标记定位水稻基因和标记辅助育种奠定了基础     

中国和美国大豆疫霉群体遗传结构的RAPD比较分析

为探究中国和美国大豆疫霉的遗传关系, 采用随机扩增DNA多态性(RAPD)的方法, 对来自中国黑龙江省、福建省和美国的3个大豆疫霉地理群体的遗传多样性进行了分析. 通过使用21个RAPD引物对供试的111株大豆疫霉菌株进行扩增, 共得到223个RAPD标记, 其中多态性标记为199个, 占89.23%. 遗传变异分析表明, 美国群体具有更高的遗传变异度; Nei’s遗传相似性和主成分分析均显示, 中国福建群体与美国群体间的遗传相似性最高, 而福建群体与黑龙江群体间遗传相似性最低; 聚类分析显示, 供试菌株在88%的相似性水平上可被区分为7个聚类, 且美国群体分布于更多的聚类组中; Shannon-Wiener多样性指数也表明美国群体的遗传多样性最为丰富. 综合分析表明, 本研究的结果不支持关于美国的大豆疫霉可能来源于中国的推测.     

水稻抗白叶枯病基因Xa-4的精细定位及其共分离分子标记

利用Ｘａ－４的近等基因系ＩＲ２４和ＩＲＢＢ４构建Ｆ_２群体,通过抗性鉴定筛选出感病植株,利用水稻高密度图谱上的分子标记和候选抗病基因片段进行分析,构建了抗白叶枯病基因Ｘａ－４的遗传图谱,并获得了与 Ｘａ－４共分离的分子标记 ＲＳ１３．构建的遗传图谱还包含另外５个紧密连锁的分子标记,其中１个是ＰＣＲ标记,４个是国际通用的水稻高密度图谱上的ＲＦＬＰ标记．为图位克隆Ｘａ－４打下了基础,也为分子标记辅助选择育种提供了有效的分子标记。     

水稻抗白叶枯病基因Xa—4的精细定位及其共分离分子标记

利用Ｘａ－４的近等基因系ＩＲ２４和ＩＲＢＢ４构建Ｆ２群体,通过抗性鉴定筛选出感病植株,利用水稻高密度图谱上的分子标记和候选抗病基因片段进行分析,构建了抗白叶枯病基因Ｘａ－４的遗传图谱,并获得了与Ｘａ－４共分离的分子标记ＲＳ１３。构建的遗传图谱还包含另外５个紧密边锁的分子标记,其中 １个是ＰＣＲ标记,４个是国际通用的水稻高密度图谱上的ＲＦＬＰ标记。为图位克隆Ｘａ－４打下的基础,也为分子标记辅助选择育     

玉米抗纹枯病QTL分子标记定位

用抗玉米纹枯病自交系CML270和感病自交系478的(CML270×478)×CML270 BC_1∶2群体共322个株系为作图和定位群体, 构建了125个SSR标记位点的遗传连锁图谱, 覆盖玉米基因组1939.0 cM, 平均图距15.5 cM. 采用复合区间定位分析, 检测到玉米纹枯病抗病指数主效QTL位点3个, 2个位于第1染色体, 1个位于第7染色体上, 它们分别能解释表型变异的18%~20%; 控制株高的QTL位点7个, 分别位于第3~6染色体上, 控制“穗位高”的QTL位点5个, 分别位于第3, 4, 6染色体上. 自交系CML270玉米纹枯病抗性主效QTL真实存在, 抗性与植株高度遗传上不存在连锁关系, 为玉米纹枯病分子标记辅助选择(MAS)和抗性基因分离与克隆提供了技术和材料支撑.     

从大豆疫霉菌ESTs中发掘SSR标记

通过对5800条大豆疫霉菌EST进行电子查询, 在369条EST中发现415个SSR. 在筛选的EST序列中SSR平均密度为每 8.9 kb含有1个SSR. 在鉴定的SSR中, 三核苷酸重复基元的SSR类型最多, 占鉴定总数的50.1%, 四核苷酸重复基元的SSR类型最少, 为8.2%. 设计40个SSR引物对对5个大豆疫霉菌菌株基因组DNA进行PCR扩增, 有33个引物对扩增出SSR特征条带, 其中有28个引物对扩增出在预期片段大小范围之内的条带. 在33个功能性引物对中, 有15个引物对在5个大豆疫霉菌菌株间扩增出多态性, 多态性引物对占45.5%. 基于SSR标记进行聚类分析, 可将5个检测大豆疫霉菌菌株划分为不同的3个组. 本研究建立了大豆疫霉菌的SSR标记, 为大豆疫霉菌及相关属种的鉴定、遗传变异、分子作图等研究提供了一种更加有效的分子标记系统.     

水稻受稻瘟病菌诱导基因的分离和克隆

利用一对抗瘟性近等基因系(Near-isogenic lines, NILs)H7R(抗病)和H7S(感病),经稻瘟病菌小种早期诱导,提取RNA,进行mRNA差异显示(Differential display,DD)分析.在获得多个DD片段的基础上,经PCR重扩增、Sourthern杂交粗筛及Northern blotting进一步鉴定.阳性片段克隆于PGEM-T载体,经序列测定,国际联网查询,已获得两个受稻瘟病菌诱导的水稻新基因cDNA片段克隆. 在我国,Magnaporthe grisea是水稻稻瘟病的主要病害菌,由于生理小种的复杂性,抗病品种的抗性丧失已成为传统育种的一大难题.国际上对采用基因工程改良水稻的抗瘟性越来越重视并已成了各国竞争的热点.然而期望通过RFLP基因定位,并借助图谱克隆抗瘟性基因尚需多年的工作和大量的投入.此外,对于水稻与稻瘟病菌之间“基因对基因”的互作在分子水平上尚缺乏了解.本研究采用了本实验室完善的mRNA差异显示技术体系,在国际上首次用DD方法,鉴定和克隆受稻瘟病菌诱导的新的水稻抗瘟性和防卫反应候选基因.     

大豆花叶病毒抗性基因Rsa的分子标记

大豆花叶病毒病危害严重,世界大豆产区的均有发生,以广谱抗源材料科丰１号为母本,感病品种南农１１３８－２为父本配制杂交组合,针对南方强毒株系Ｓａ进行了抗病性遗传学分析。通过接种鉴定亲本,Ｆ１,Ｆ２和Ｆ３代的抗性表现,Ｘ＾２测验结果表明,对Ｓａ的抗性是由单显性基因Ｒｓａ决定的采用ＢＳＡ法,利用ＲＡＰＤ技术在抗感染池间寻找多态性标记。     

用RAPD方法获得与小麦BYDV抗性基因连锁的分子标记

由大麦黄矮病毒(BYDV)感染引起的小麦黄矮病(WYD)能使小麦产量减少20%～30%,是小麦的主要病害之一.控制发病的因素集中于三点,即病毒、传播源和寄主.目前认为比较有效的方法是创造抗病的品种.虽然小麦中有些种质被报道具有BYDV耐性,但真正具有BYDV良好抗性的品种仍未发现.相反,小麦的一些近缘属如中间偃麦草(Thinopyrum inter-medium,TI)具有BYDV抗性的报道很多,而且目前通过远缘杂交的方法已将中间偃麦草的抗BYDV的基因转移到小麦.然而用常规的田间方法检测中间偃麦草的BYDV抗性基因是     

利用SSR标记揭示我国夏大豆(Glycine max (L.) Merr)种质遗传多样性

利用67个SSR标记, 分析了来自我国栽培大豆初选核心种质中的158份夏大豆, 旨在阐明其遗传多样性特点, 为育种利用提供理论依据. 结果表明, 在所有供试夏大豆中共鉴定出等位变异460个, 平均每个位点有6.9个; 其中, 80份黄淮夏和78份南方夏大豆的等位变异数分别为414个和419个, 平均每个位点均接近6.2个. 所有供试夏大豆平均每个位点多样性(D)为0.735, 变化范围为0.414~0.905, 其中黄淮夏大豆D值平均为0.708, 变化范围为0.387~0.886; 南方夏大豆D值平均为0.687, 变化范围为0.189~0.884. 黄淮夏大豆和南方夏大豆在特异等位变异数、等位变异频率、遗传相似性系数均存在差异, UPGMA聚类分析也可将黄淮夏大豆和南方夏大豆基本分成2类. 这表明黄淮夏大豆和南方夏大豆可划为2个不同的基因池. 在夏大豆育种中, 两种夏大豆类型间可以通过种质资源相互利用来拓宽类型内育成品种的遗传基础.