粗毛栓菌漆酶基因的克隆、序列分析及荧光定量PCR分析

本研究通过提取不同培养条件下的粗毛栓菌总RNA,利用RT-PCR的方法克隆到1个新的漆酶基因,命名为Tglac3,编码区长1,560bp,预测编码519个氨基酸残基,其分子量为56.6kDa,理论等电点为5.77.用荧光定量RT-PCR法分析了该漆酶基因在不同培养条件下的表达水平,结果显示,高浓度的碳源和氮源均能诱导Tglac3基因的表达.     

灵芝漆酶的分离纯化及其部分酶学性质研究

将灵芝（Ganoderma lucidum）漆酶经过Sephadex G-75和DEAE-Sepharose Fast Flow两步纯化,获得具有3个同工酶的组分,并且纯度提高了81倍,酶活回收率高达83.9%。以ABTS为底物,漆酶最适pH值是2.2～2.6,在pH值4.6～7.8范围内稳定;最适温度45℃,在低于45℃时较稳定。大部分金属离子、酸根离子对灵芝漆酶普遍有抑制作用,除盐可以提高漆酶活力。     

粗毛栓菌(Trametes gallic)基因启动子的分离与鉴定

粗毛栓菌 (Trametesgallic)总DNA经Sau3AI酶切后插入到启动子探针型载体pSUPV8的BamHI位点 ,在含氨苄青霉素与潮霉素双抗平板上筛选到 8个潮霉素抗性(Hygr)重组子 (命名为 pTP1～ 8) ,其插入片段大小为 0 .5～ 1.7kb ,抗性水平为 0 .15× 10 - 3 ～0 .35× 10 - 3 g/mL .对 pTP6进行酶切分析表明 ,插入片段中含有KpnI ,XbaI和SacI位点各一个 ,用限制酶SacI和XbaI去掉其 5’端 0 .7kb和 1.2kb片段后 ,其潮霉素抗性由 0 .2 5×10 - 3 g/mL均降为 0 .15× 10 - 3 g/mL .将TP5片段与粗毛栓菌总DNA进行Southern杂交 ,结果证明 ,TP5片段来源于粗毛栓菌总DNA .对片段TP5的 3’端进行序列分析 ,发现它存在真核生物和原核生物基因启动子的保守序列     

云芝漆酶同工酶的分离纯化及酶学性质

采用DEAE-Sephrose Fast Flow和Sephadex G-100两步柱层析,得到2种漆酶同工酶,分别命名为LccA和LccB.以ABTS为底物在适当条件下与酶带反应呈绿色谱带鉴定出漆酶谱带.LccA的纯化倍数和回收率分别为53.88和7%,LccB的纯化倍数和回收率分别为208.21和29%.用SDS-PAGE测定两漆酶的分子量分别为64.2 ku和60.7 ku;LccA和LccB的最适作用温度分别是40℃和50℃;最适反应pH值为3.5和4.0;其N-末端部分氨基酸序列为AIGPK和GIGPV,与其他真菌漆酶相比显示很高的同源性,以ABTS为底物的Km值分别为68.96μmol/L和76.92μmol/L.Cu2 对两同工酶都有明显的激活作用,Fe2 ,Ag 完全抑制两同工酶的活性.     

多孔菌漆酶性质研究

研究了多孔菌漆酶的产酶曲线及酶作用最适条件;结果表明在该培养条件下,多孔菌第9天达产酶高峰,峰值酶活为412u/ml,酶作用的最适pH值为4.2,最适酶解温度为25℃,Mg2 、Mn2 对漆酶有激活作用,而Ag 、Fe3 和Cl-则能明显抑止漆酶活性.     

硫酸盐还原菌氢化酶的分离纯化及酶学性质研究

硫酸盐还原菌氢化酶上清液经硫酸铵沉淀、透析、DEAE 52阴离子交换层析和Sephadex G-150凝胶过滤层析纯化出氢化酶,纯化倍数为34.7,酶回收率为34.1%.对纯化酶性质进行研究,结果表明:该酶是由分子量为46KD和34KD的两个亚基构成的总分子量为80KD的αβ异二聚体;酶催化最适温度和pH值范围分别为45℃和6.5～8.5,在34~55℃和pH=6～9.2范围内具有较稳定的催化放氢活力;光谱扫描分析和激活剂及抑制剂测定表明该酶属含铁硫中心的唯铁氢化酶.     

亚热带木腐真菌产漆酶及其酶学性质

对选育的一株木腐真菌Psathyrella candolleana进行液体深层发酵生产漆酶,通过硫酸铵盐析和离子交换色谱等纯化技术分离发酵酶液后,得到纯度较高的漆酶,并对其酶学性质进行研究.结果表明:P.candolleana在发酵罐中的漆酶产量最高可达9 100 U/L;分离纯化后得到漆酶活性组分,其比活力达到438...     

海洋来源褐藻胶裂解酶分离纯化及酶学性质研究

以假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.zb7-4)发酵制备褐藻胶裂解酶粗酶液,采用弱阴离子DEAE交换层析分离褐藻胶裂解酶,分析纯化褐藻胶裂解酶Alg L的酶学特性.结果表明:Alg L的表观分子质量约为32 ku,比活力为(208.26±5.87)U·mg-1;其最适反应pH为7.0,在pH为6.0~10.0范围内稳定性较好,保温1 h仍能保持80%以上的相对酶活力;最适反应温度50℃,在40℃保温30 min,其残余酶活力高于80%;Cu2+、Cr3+、Co2+、Ba2+、Sr2+、Hg2+对该酶具有不同程度的抑制作用,Hg2+抑制作用最为明显;该酶具有较好的盐耐受性,在3 mol·L-1Na Cl反应体系中保温2 h,仍残余66%酶活力.动力学参数Km、Vmax、Kcat测定表明,该酶对聚古罗糖醛酸钠(PG)亲和力较高,为偏好聚甘露糖醛酸钠(PM)裂解作用的双功能酶.     

白毒鹅膏菌胞外漆酶的部分酶学性质研究

从威海市玛珈山上获得白毒鹅膏菌,在对其产酶条件研究的基础上,研究了pH值、温度、无机离子对白毒鹅膏菌漆酶活性和稳定性的影响,测定了漆酶的Km值。结果表明：Ba^2＋、Cu^2＋、、SO4^2-离子对漆酶有激活作用,而Ag^2＋、Cl^-、Fe^3＋离子则有抑制作用,该酶最适pH为4.6,在pH 5.0-5.4表现出较强的稳定性;最适反应温度为20℃,低于60℃时有较好的热稳定性;以邻联甲苯胺为底物的表观Km值为66.7μmol/L。     

野生革耳菌组成型漆酶的生成条件及性质研究

首次发现野生革耳菌 (Panusrudis)在 39℃液体振荡培养条件下 ,不需诱导剂的诱导 ,能持续产生漆酶 .优化后培养基的碳氮源分别为 2 %蔗糖和 2 6mM酵母抽提物 ,最高酶活达 1 .6× 1 0 4U/L ,属于目前已知的组成型漆酶高产菌株 .发酵液经硫酸铵沉淀 ,DEAE Sepharose ,SephacrylS 2 0 0 ,MonoQ柱层析分离纯化后 ,可得电泳纯漆酶蛋白 .该酶为单体蛋白 ,分子量为 58kDa .以愈创木酚为底物 ,该酶的最适作用pH为4 5,最适反应温度为 50℃ ,Km值为 0 .2 1mM ,并表现出较好的热稳定性 ,具有良好的基础研究和工业应用价值     

云芝产漆酶发酵条件的研究

研究了培养基初始pH值、通气量、温度、表面活性剂、诱导剂、金属离子对云芝(Trametes versicolor)HS-03产漆酶发酵条件的影响.研究发现培养基的初始pH、培养温度、表面活性剂、诱导剂和金属离子等因子对该菌漆酶产量均有明显的影响.结果表明,云芝摇瓶产漆酶的最佳培养条件为培养基初始pH为3.5,转速150 r/min,培养温度28℃,另加1 mL/L吐温-80,1 mL/L愈创木酚,终浓度为0.5 mmol/L的Cu2 .在该条件下,该菌的漆酶酶活力达到291 U/L,比优化前提高了8倍,同时产酶高锋也提前了5 d.     

粗毛栓菌atp9基因的克隆、表达及序列分析

ATP合酶是生物体内能量代谢的关键酶,参与多种氧化磷酸化和光合磷酸化反应.atp9基因是ATP合酶的重要组成部分,其编码了ATP合酶A亚基上第9亚单位,与呼吸作用和光合作用密切相关.本研究利用atp9基因在进化过程中高度保守的特点,据已知近缘真菌基因序列,设计并合成了一对引物,以粗毛栓菌mRNA反转录得到的cDNA第一链为模板,PCR扩增得到atp9基因完整序列,并连接于原核表达载体pET32a(+)上.测序与序列分析表明:该克隆片段全长222 bp,共编码73个氨基酸,翻译的蛋白质分子量是7.35 kDa.转化大肠杆菌后经IPTG诱导,可高效表达外源融合蛋白,分子量大小与预测结果一致.经过同源比对和进化树分析,该克隆基因编码的氨基酸序列与可可丛枝病菌(Crinipellis perniciosa)和瓣环栓菌(Trametes cingulata strain ATCC 26747)中相对应的氨基酸序列相似度最高.本实验为未来进一步研究粗毛栓菌atp9基因和其蛋白功能,阐明其调控和作用机制奠定了基础.     

对硝基酚磷酸酶的原核表达、纯化及性质研究

克隆到脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus中的对硝基酚磷酸酶(p-nitrophenylphosphatase，pNPPase)基因，将其编码区eDNA连接到pQE30表达载体中，在E．coli M15中经IPTG诱导得到高效表达．用Ni-NTA Superflow层析柱对表达产物进行了分离纯化，初步测定了pNPPase的酶学性质．发现它的反应最适pH是10．0，最适反应温度是55℃，热稳定性Tm值为52℃，Mg^2 、Mn^2 和Co^2 对pNPPase的活性有一定的促进作用，而Zn^2 和Ni^2 对pNPPase没有影响．纯化后其比活为120U／mg．     

烟草过氧化物酶Ⅰ的分离纯化及部分光谱特性研究

烟草过氧化物酶同工酶Ⅰ (TOPⅠ )的分离纯化过程 ,主要包括匀浆、超声破碎、过滤、(NH4) 2 SO4分级沉淀、DE 5 2纤维素阴离子交换层析、SephadexG 75凝胶层析、DEAE SephadexA 5 0阴离子交换层析 .经纯化的TOPⅠ ,纯化酶的比活力为 482 6U/mg ,在SDS PAGE上显示出一条蛋白带 ,分子量在 2 1 0 0 0左右 ,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI$CTOF MS)测得TOPⅠ分子量为 2 1 888.5 ,等电点pI为 3.5 ;光谱学分析揭示 ,在 40 2nm处有一典型的Soret带 ,在 498nm和 636nm处有特征吸收峰 ,表明TOPⅠ为一含血红素的酸性蛋白酶 .酸度对TOPI的在紫外可见区的特征吸收峰及荧光光谱均产生一定的影响 ,反映了TOPⅠ分子独特的光谱学特性     

糙皮侧耳Ax3产漆酶条件及部分酶学性质研究

对糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)Ax3菌的漆酶产生条件进行了研究，该菌产漆酶较高的条件是：培养温度25℃，培养基pH5．5，每升C／N含量0．252g／0．021g；加入0．05％～0．1％的吐温可提高漆酶酶活12倍。对漆酶的部分生化性质研究表明：最适反应温度25℃；最适反应pH2．8；琥珀酸缓冲液效果最好；金属离子：Mn^2 ，Cu^2 ，Zn^2 对漆酶有较强的激活作用，其中Mn^2 相对活性最高，Ag^ ，K^ ，Ca^2 ，Fe^2 对漆酶活性有抑制能力，其中Ag^ 的抑制作用明显。