细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

为了表达、纯化细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白及制备多克隆抗体,本研究构建细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白原核表达载体p ET30a-M26,转化至大肠杆菌BL21(DE3)内进行诱导表达,SDS-PAGE切胶纯化的副肌球蛋白,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,并用Western blotting和ELISA对副肌球蛋白及抗体进行检测。结果显示:成功表达并纯化了细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白,重组蛋白分子质量约41 k D,纯化后目的蛋白纯度可达85%,蛋白浓度为0.5mg/ml。副肌球蛋白可与所制备的多克隆抗体结合,ELISA测定的抗体效价为1∶12800,结果表明,成功表达并纯化了六钩蚴副肌球蛋白。本研究可为研究包虫病早期诊断奠定了基础。     

猪链球菌乳酸脱氢酶基因的原核表达及重组蛋白的反应原性研究

为了验证双向电泳筛选出的7型猪链球菌WH分离株免疫相关蛋白乳酸脱氢酶的反应原性,本实验采用克隆表达的方法对其进行研究。根据质谱鉴定的NCBI登录号查找乳酸脱氢酶基因序列,并设计特异性引物,对乳酸脱氢酶基因进行扩增,克隆入p ET30a载体,构建重组质粒p ET30a-LDH,测序后转化入大肠埃希氏菌中。用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。SDS-PAGE分析结果显示表达的重组融合蛋白相对分子量为41ku;Western blot分析结果显示该重组蛋白可与7型猪链球菌WH分离株多克隆抗体发生特异性血清学反应。这表明表达的重组LDH蛋白具有良好的反应原性,为预防和控制猪链球菌病提供有效的疫苗候选分子奠定基础。     

细粒棘球绦虫新疆株胆汁酸钠协同转运蛋白基因的克隆及序列分析

 从新疆株细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)原头蚴中克隆胆汁酸钠协同转运蛋白(sodium-bile acid co-transporter,EgSBACT)基因,进行序列测定和生物信息学分析。首先设计EgSBACT 基因特异性引物,用RT 及PCR 方法从新疆株细粒棘球绦虫原头蚴提取总RNA,将其反转录成cDNA 后扩增EgSBACT 基因并将其克隆至原核表达载体pET30a 中,测序鉴定序列并进行生物信息学分析。结果显示,RT-PCR 扩增出一长度约650 bp 的基因,测序显示其长度为654 bp,序列与Gen-bank 公布的EUB59978.1 完全一致,其编码217 个氨基酸,预测其等电点为9.28。同源性分析发现,EgSBACT 蛋白序列与中华枝睾吸虫SBACT(GenBank:GAA57409.1)同源性最高,达到43%。进化树分析表明,细粒棘球绦虫的SBACT 蛋白与吸虫纲的SBACT 相聚集,在进化树上处于一枝,而与其他物种亲缘性较远。由此表明,本研究成功克隆出细粒棘球绦虫EgSBACT 基因。     

细粒棘球绦虫重组pET30a-EgA31疫苗的构建和诱导表达

克隆细粒棘球绦虫EgA31抗原基因,构建pET30a-EgA31原核表达载体,并在大肠埃希菌宿主系统中表达EgA31重组蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE分析.从细粒棘球绦虫成虫组织中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板RT-PCR 克隆获得EgA31抗原基因,将其克隆至pUCm-T载体,测序确定其正确性.利用定向克隆技术将EgA31抗原基因片段克隆至原核表达质粒pET30a上,转化E coli DH5α,根据选择标记的卡那霉素抗性基因筛选到阳性克隆,通过PCR分析和酶切鉴定筛选出阳性克隆.IPTG初步诱导和表达pET30a-EgA31重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测,并经凝胶图像分析确定目的蛋白的表达水平.测序表明选取的pET30a-EgA31阳性克隆均为正确连接EgA31抗原基因的重组质粒.经IPTG诱导后重组蛋白得到成功表达,在相对分子量约为31 kDa处有表达条带,表达量约占菌体总蛋白质的26%.成功克隆并构建了pET30a-EgA31原核表达质粒.初步诱导表达出EgA31重组蛋白,为进一步研究其免疫特性奠定了基础.     

青岛文昌鱼促甲状腺激素受体(TSHR)蛋白的融合表达及鉴定

为表达青岛文昌鱼促甲状腺激素受体(the thyrotropin receptor,TSHR),构建了TSHR基因的原核表达载体pGEX-4T-1-TSHR,并将其转化入大肠杆菌DH5α中.采用IPTG诱导蛋白表达,并用SDS-PAGE分析表达蛋白.利用抗TSHR多克隆抗体进行Western blot检测.结果表明重组质粒在大肠杆菌DH5α中表达,融合蛋白的分子大小约为76kDa,Western blot检测说明得到的融合蛋白为TSHR蛋白,成功构建了文昌鱼TSHR基因的原核表达载体.     

细粒棘球蚴重组蛋白14-3-3和Eg10免疫差异的初步研究

表达纯化细粒棘球蚴重组蛋白14-3-3(rEg14-3-3)和Eg10(rEg10),分别免疫小鼠,8w后进行细粒棘球蚴原头蚴攻击感染.计算免疫保护力,检测脾组织中CD4+T、CD8+T细胞亚群以及T细胞增殖情况.实验结果表明,rEg14-3-3免疫组小鼠具有85.3%抵抗细粒棘球绦虫感染的能力,而rEg10免疫组小鼠与对照组小鼠相比无免疫保护力;与PBS对照组相比,只有rEg 14-3-3免疫组的CD4+T细胞亚群的分布有明显差异,且rEg 14-3-3抗原能诱导淋巴细胞显著增殖.因此rEgl4-3-3蛋白能抑制细粒棘球蚴的生长,诱导小鼠产生高水平的免疫保护力,可作为疫苗候选分子.     

细粒棘球蚴线粒体ND1基因的克隆与序列研究

为了研究细粒棘球蚴(Echinococcus granulasus)种间遗传标记特点,在内蒙古地区采集羊肝脏中的细粒棘球蚴,或通过手术将患者的包虫剥离囊包后采集细粒棘球蚴,提取虫体DNA,扩增线粒体细胞色素氧化酶1(ND1)基因,将其克隆到PGM-T载体后,用PCR技术鉴定阳性菌落,并进行测序.研究结果表明,细粒棘球蚴DNA扩增出的羊株、人株ND1基因序列片段长度为895bp,ND1基因序列稳定保守,无宿主特异性,可作为细粒棘球蚴理想的种间遗传标记.     

布鲁氏菌磷酸葡萄糖变位酶基因的原核表达与鉴定

对布鲁氏菌磷酸葡萄糖变位酶(pgm)蛋白进行了表达与纯化,为研究该基因的功能提供了物质基础。首先利用PCR方法从羊种布鲁氏菌基因组DNA中PCR法扩增pgm基因,并将该基因亚克隆至pET-28a(+)载体中,转化入大肠杆菌(DE3),诱导表达融合蛋白;表达产物经Ni-NTA Agarose亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示:扩增了pgm的全基因,成功构建了布鲁氏菌pgm基因的原核表达载体pET-28a(+)-pgm,并且在大肠杆菌中进行了表达,经Western blot鉴定,该蛋白可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应,且具有良好的免疫反应性。本研究为进一步研究布鲁氏菌pgm蛋白的生物学功能提供基础物质,也为进一步开发基因工程疫苗提供理论基础。     

布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白基因VceA的原核表达、纯化及功能分析

本研究对布鲁氏菌分泌蛋白VceA基因进行了原核表达与纯化,并分析其反应原性,致炎特性和分子特性。应用PCR技术从布鲁氏菌2308基因组中扩增VceA基因,亚克隆至PMD19-T载体后,进行测序,构建重组表达质粒PGEX-4T-1-VceA,然后转化至E.coli BL21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析,Western Blot检测其反应原性;用重组蛋白作用于细胞,检测炎症相关细胞因子的分泌量;并对该蛋白进行生物信息学分析。结果显示:PCR扩增出VceA基因,SDS-PAGE显示纯化的VceA融合蛋白大约在37 kD处,Western Blot也出现了杂交带。细胞实验表明重组蛋白刺激细胞后产生的IL-18,IL-1β,TGF-β1的含量均显著高于BSA对照组(P0.05)。生物信息学分析显示,该蛋白无跨膜区结构,存在信号肽,属于分泌型蛋白,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,并利用Phyre2软件成功构建了该蛋白的三维模型。结果表明,成功克隆并表达了布鲁氏菌Vce A蛋白,该蛋白具有良好的反应原性,并具有致炎作用。这为进一步研究布鲁氏菌分泌蛋白的致病机制奠定了基础。     

IL18-IL2融合基因的克隆及其在大肠埃氏菌(E.coli)中的表达

构建IL-18和IL-2成熟区的融合基因IL18-IL2,并实现其在大肠埃氏菌中的大量表达.抽提经PHA刺激增殖的人淋巴细胞总RNA,RT-PCR法获得IL-18和IL-2基因的成熟区序列,并通过一段Linker相连得到融合基因IL18-IL2;将IL18-IL2克隆至原核表达载体pBV220,并转化至大肠埃氏菌BL21(DE3);阳性克隆经42℃温度诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白的表达情况及正确性.经SDS-PAGE分析,融合基因IL18-IL2在宿主菌中能够表达,其相对表观分子质量约为34.5 kD;Western blot进一步证明重组蛋白正确.实验结果表明,已成功构建了表达人IL18-IL2的菌株,为进一步研究融合蛋白IL18-IL2体内外抗肿瘤活性提供了基础.     

BVDV-2 E2基因的原核表达及重组蛋白反应原性的研究

为了对BVDV进行诊断,根据GenBank登录的BVDV-2 E2基因序列,设计特异性引物,对BVDV-2新疆分离株SWE2基因进行扩增,克隆入T载体中测序,然后亚克隆入BL21（DE3）表达载体pET-28a中,构建重组表达载体pET-28a-E2,并转化人大肠埃希氏菌中。用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Westernblot分析表达产物。SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白相对分子量为32ku;Westernblot分析表明该重组蛋白可与BVDV-2多克隆抗体发生特异性血清学反应,证实表达的重组E2蛋白具有良好的反应原性,为BVDV-2诊断试剂研发奠定基础。     

单核细胞增生性李斯特菌srtA基因的克隆与原核表达

为了探究从新疆发病绵羊中临床分离的单核细胞增多性李斯特菌(简称LM90SB2)srt A基因的特异性及其在原核表达质粒p ET32a中的表达,本研究利用PCR技术扩增LM90SB2的srt A基因,测序后并进行序列比对分析,将其克隆到原核表达质粒p ET32a中构成重组表达质粒p ET32a-srt A。重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导使其表达,SDS-PAGE电泳检测,同时采用Western-blotting对表达产物进行了鉴定。结果表明:Srt A蛋白在BL21(DE3)中大量表达,表达产物经SDS-PAGE电泳和Western-blotting检测分析其为1个分子量为47 ku的融合蛋白,与预期的大小相符合,成功的构建了重组质粒p ET32a-srt A,并使其在BL21(DE3)中获得了高效的表达。本研究为下一步研究其对李斯特菌致病性的影响及制备单克隆抗体奠定了基础。     

人RACK1基因的克隆及原核表达

克隆人RACK1基因,构建原核表达载体pET-30a(+)-RACK1,诱导表达重组蛋白,纯化后Western blot鉴定目的蛋白.根据GeneBank提供的RACK1基因序列及pET-30a(+)载体上的多克隆位点设计引物,以人胎肝cDNA文库为模板,钓取RACK1cDNA全长序列.将目的片段与原核表达载体pET-30a(+)连接,转入E.coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆.将测序正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)细胞,IPTG诱导表达,利用镍柱对表达的蛋白进行纯化,Western blot法检测纯化的蛋白.结果显示,克隆得到的目的基因序列与GeneBank中已报道的序列完全一致,成功构建了pET-30a(+)-RACK1原核表达载体.重组蛋白主要以包涵体形式存在,经镍离子亲和层析柱纯化后,Western blot检测证实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应.本研究获得了人RACK1蛋白,为深入研究RACK1的功能奠定基础.     

粉尘螨过敏原脂肪酶的表达、纯化及生物信息学分析

为克隆原核表达并纯化出粉尘螨过敏原脂肪酶蛋白,鉴定其免疫学活性,并分析其分子特征.通过重组合成粉尘螨新过敏原脂肪酶基因,与p ET-28a载体连接后转化大肠埃希菌E.coli Top10,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组新过敏原脂肪酶蛋白;经镍柱亲和层析纯化出粉尘螨重组脂肪酶蛋白,用Western Blot、ELISA方法检测其免疫原性.用生物信息学软件预测其理化性质、二级结构,并构建分子进化树.成功表达纯化出高纯度的粉尘螨重组脂肪酶蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示表达重组产物分子质量约为40 k Da,与理论值一致,纯化后的表达产物经Western blot印迹检测有明显条带显示.信息学分析显示蛋白二级结构由α螺旋(16.38%)、延伸主链(18.93%)、无规则卷曲(64.69%)组成.成功原核表达出粉尘螨过敏原脂肪酶蛋白,并纯化获得较高纯度及较强免疫学活性的重组脂肪酶蛋白,为尘螨过敏性疾病的特异性诊断和免疫治疗奠定理论基础.     

纹皮蝇Hypodermin B基因在大肠杆菌中的表达

从纹皮蝇Ⅰ期幼虫中提取总RNA,RT-PCR扩增纹皮蝇Hypodermin B(HB)基因.将扩增基因进行克隆测序,构建原核表达载体pET30-HB,转化大肠杆菌BL21(DE3).用IPTG诱导表达后,得到表达量达全菌蛋白30%以上的特异性蛋白.SDS-PAGE分析表明表达产物主要以包涵体形式存在.Western blotting检测结果表明,获得的重组蛋白为重组Hypodermin B,具有较好的反应原性.     

绵羊ISG15基因的克隆表达与纯化

为了克隆并表达绵羊ISG15,且对其表达产物进行纯化,首先从绵羊外周血单核细胞(PBMC)中提取总RNA,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增出ISG15的基因;再通过基因克隆技术,构建ISG15在pET28a中的重组表达质粒pET28a-ISG15,在大肠杆菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达,得到ISG15的原核表达蛋白;最后采用Ni 2+-NTA亲和层析方法纯化目的蛋白。结果显示:克隆的绵羊ISG15基因序列长度为541bp,编码157个氨基酸。重组表达产物通过SDS-PAGE可检测到相对分子质量为25ku的重组蛋白,且表达的目的蛋白能被Ni 2+-NTA亲和层析方法所纯化。该研究为后续深入研究绵羊ISG15奠定基础。     

猪表皮生长因子在大肠杆菌中的串联表达

根据Gen Bank中猪表皮生长因子(p EGF)基因信息设计引物,通过PCR、亚克隆、基因重组等技术,构建得到p EGF拷贝数分别为1、2、3的原核重组表达质粒.用重组质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,在37℃诱导条件下,1、2、3拷贝p EGF重组质粒均能表达p EGF蛋白,灰度值分析表明:表达的融合蛋白占菌体蛋白总量分别为9.54%、20.37%、26.79%,表明在原核表达中,对p EGF进行同向串联,增加其拷贝数,可以提高p EGF在表达后融合蛋白中所占比例,相应提高p EGF蛋白产量.本研究为p EGF重组蛋白的高效表达和批量生产提供可靠的依据.     

人全长Notch1基因的克隆及其在HEK293 T细胞中的表达

目的:克隆人全长Notch1基因,构建人全长Notch1/p CMV6-Entry真核重组质粒并在HEK293 T细胞中进行瞬时表达.方法:采用PCR公知不认方法扩增人全长Notch1基因并克隆到真核表达载体p CMV6-Entry中并用限制性内切酶分析和DNA测序鉴定重组质粒.将该重组质粒转染HEK293 T细胞24h后,通过实时荧光定量PCR(q-PCR)和Western blot检测鉴定人全长Notch1的表达.结果:成功构建了人Notch1/p CMV6-Entry重组真核表达质粒,人全长Notch1基因在mRNA和蛋白水平上的表达显著高于p CMV6-Entry载体对照组和HEK293 T细胞对照组.结论:克隆获得人全长Notch1基因并验证在HEK293 T细胞中表达.     

人脑金属硫蛋白3(MT-3)原核载体的构建、表达及纯化

为探讨采用基因工程技术构建小分子人MT-3蛋白原核表达载体的可能性,以MT-3 c DNA序列为模板,采用聚合酶链式反应引入双酶切位点,定向亚克隆至pho A分泌型原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞构建重组工程菌,经0.05 mmol/L低磷培养基培养诱导重组MT-3表达,利用金属螯合柱分离纯化后,利用SDS-PAGE、Western blot、紫外光谱扫描及金属结合能力分析对其进行鉴定。结果成功构建了pho A-MT-3原核表达载体,重组工程菌经诱导后以可溶形式表达重组MT-3蛋白。SDS-PAGE、Western blot和紫外光谱扫描分析证实重组MT-3表达成功。金属结合能力分析结果显示目的蛋白仍具有结合金属离子的生物学功能,实现了小分子MT-3的体外分泌重组表达。本研究成功实现了小分子人MT-3蛋白的重组制备,为MT-3的规模化应用奠定基础。     

GST-SDF-1α融合蛋白的原核表达及纯化

构建融合重组表达载体并对其进行诱导表达蛋白以获得大量重组融合蛋白。通过PCR方法扩增出小鼠SDF-1α基因,克隆入pMD18T载体中,进行测序分析。将该基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T11中GST的下游构建重组质粒pGEX-4T1-SDF-1α,转化受态细胞BL21中,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳检测分析。在约Mr36×103处出现一新生的蛋白条带。经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的30%,纯化后得到了目的蛋白。成功克隆了小鼠的SDF-1α基因,并纯化融合基因GST-SDF-1α的原核表达产物。