N2和H+在固氮酶活性中心金属原子簇中还原位点的分析

目前研究表明, 固氮酶的生理底物氮气(N₂)和质子(H⁺)在钼铁蛋白中的铁钼辅因子(FeMo-co)上被还原, 但其确切的还原位点尚未确定. 对比分析了棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii, Av)野生型(WT)与5种突变株(包括FeMo-co附近2个保守氨基酸α-191^Gln和α-195^His单突变菌株(Qα191K和Hα195Q)、FeMo-co上钼原子相连的高柠檬酸突变株(nifV^−)以及α-191^Gln和α-195^His与高柠檬酸的双突变菌株(Qa191K/nifV ^− 和Hα195Q/nifV^−))固氮酶催化还原N₂和H⁺活性的变化, 结果表明, N2在靠近FeMo-co中心硫原子(S2B)的Fe2和Fe6上络合和还原, FeMo-co上的钼原子是H+还原的位点. 结合生物信息学分析结果显示, [8Fe7S]和FeMo-co之间可能存在两条平行的电子传递通路.     

肺炎克氏杆菌固氮酶双突变株的构建及其对底物还原的特性

通过定点突变及基因替代技术, 将肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae, Kp)野生型菌株的固氮酶钼铁蛋白α亚基中铁钼辅因子(FeMoco)周围多肽链的Glnα190和Hisα194分别置换为Lys和Gln, 并构建成2个单突变株,命名为Kp-Qα190K和Kp-Hα194Q. 将上述2个突变分别引入Kp-nifV突变株(与FeMoco相连接的高柠檬酸被柠檬酸置换)获得另外2个双突变株, 命名为Kp-Qα190K-nifV^−和Kp-Hα194Q-nifV^−. 对上述4种突变株进行诱导培养和细胞的固氮酶活性分析表明, 4种突变株都失去了固氮活性, 乙炔(C₂H₂)还原活性也大幅度降低, Kp-Qα190K单突变株的乙炔还原活性比Kp-Hα194Q单突变株下降得多; Kp-Qα190K-nifV^−双突变株几乎完全丧失了活性, 而Kp-Hα194Q-nifV^−野生型菌株10%的乙炔还原活性. 突变株将氘代乙炔(C₂D₂)还原成氘代乙烯(C₂D₂H₂)的情况是: Kp-Qα190K和Kp-Hα194Q-nifV^−突变株的C₂D₂还原产物中, 反式-1,2-二氘代乙烯比例比Kp野生型增加了1倍, 表明固氮酶催化加氢的立体构型选择性降低. 以上结果表明, 固氮酶活性中心周围多肽环境中Glna190残基, 及与FeMoco相连的高柠檬酸, 可能直接参与质子和/或电子向活性中心FeMoco的传递. 推测Glna190和与FeMoco的Mo原子相连的高柠檬酸, 在质子和/或电子通过Mo位进入FeMoco起关键作用. 这种双突变株所产生的固氮酶, 有利于在体外研究固氮酶的催化机制, 可以通过分析用于还原底物的电子和质子进入活性中心FeMoco的位点, 推测出底物在活性中心中的络合和还原的部位.     

面向固氮酶铁钼辅基加氢模式的柠檬酸钼研究

柠檬酸钼配合物的光谱和结构研究,为固氮酶铁钼辅基中的高柠檬酸和柠檬酸突变种的配位性质提供了重要的信息.本文利用水热法,用钼酸铵、柠檬酸(H_4cit)、α,α,α-三联吡啶(tpy)和盐酸肼在酸性条件下分离得到了两个不同价态的双核柠檬酸钼配合物[Mo_2~(IV)O(Hcit)_2(tpy)_2]·3H_2O(1)和(H_2tpy)_2[Mo_2~(VI)O_5(Hcit)_2]·7.5H_2O(2).通过元素分析、红外光谱、紫外光谱、核磁共振、电子顺磁共振、键价计算和X射线单晶衍射等手段对这两个配合物进行了表征.单晶结构分析表明,1和2中的柠檬酸配体通过α-烷氧基、α-羧基和β-羧基与钼三齿螯合,另一个游离的β-羧酸基团与周围的水分子形成氢键.核磁碳谱表明2在溶液中发生了解离.对1、2和已报道的柠檬酸钼配合物的键长进行统计分析显示,端氧的反位效应、羟基质子化效应和金属钼的价态是影响键长的主要因素.其中,Mo-O(α-烷氧基/α-羧基)键长与金属钼的价态呈现一定的线性关系.线性拟合计算得到的Mo(III)-O(α-羧基)键长与钼铁蛋白结构中Mo(III)-高柠檬酸和柠檬酸的配位键长接近,而计算的Mo(III)-O(α-烷氧基)键长远小于蛋白中的键长,但质子化作用下的Mo-O(α-羟基)键长与之接近.由此进一步支持固氮酶铁钼辅基中的高柠檬酸和柠檬酸通过α-羧基和未去质子的α-羟基与钼配位.该加氢配位模式对于研究高柠檬酸和柠檬酸在固氮和CO还原反应中的加氢作用具有重要意义.     

人工光照条件下深红红螺菌的氢代谢途径

深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)在不同培养条件下分别有多种酶参与氢的代谢. 为研究R. rubrum在人工光照条件下氢代谢途径及各代谢途径对光合产氢的贡献, 分别构建了3个缺失突变株: Fe-固氮酶缺失单突变株、Fe-固氮酶和Mo-固氮酶双缺失突变株以及吸氢酶和Fe-固氮酶双缺失突变株. 比较R. rubrum野生型菌株、吸氢酶缺失单突变株及所构建3个突变株的固氮酶活性及光合氢产量. 结果表明, 在人工光照条件下, Mo-固氮酶和Fe-固氮酶是R. rubrum产氢的关键酶; 除Fe-和Mo-固氮酶外还有第3种途径参与氢代谢, 该代谢途径产生的氢气量较小. Mo-固氮酶、Fe-固氮酶和第3种途径对光合产氢的贡献率分别为93.5%, 4.9%和1.5%; 吸氢酶消耗13.3%的氢气. 甲酸裂解氢酶活性测定表明, 第3种产氢途径并非由甲酸裂解氢酶介导, 而可能是一种未知酶参与人工光照条件下R. rubrum的氢代谢.     

柠檬酸氧钒(V)配合物Na_2(NH_4)_4-[VO_2(cit)_2]·6H_2O的合成和晶体结构

最近,Rees等相继发表了Mo-Fe蛋白0.22和0.27nm分辨率的晶体结构分析结果,揭示了固氮酶金属活性中心FeMo-辅基的结构图象,其中Mo原子处在一端的角落位置上,并且同高柠檬酸的羟基和羧基形成双齿配位.考虑到自然界中钒可取代钼成钒固氮酶,为了了解高柠檬酸在金属酶活性中心中的作用,本文报道含羟基和羧基双齿配位的二聚柠檬酸氧钒(V)配合物Na_2(NH_4)_4[VO_2(cit)]_2·6H_2O(H_4cit=柠檬酸)的合成、光谱和结构.     

原子簇络合物亡(C_2H_5)_4N]_3[Mo_2FeS_8O_2]的合成、结构和性质研究

一、前言化学模拟生物固氮的根本目的是要彻底改革现行合成氨工业催化剂,其关键在于弄清固氮酶的结构与功能。铁钼辅基(简称:FeMo—co)的成功分离使固氮酶活性中心的研究进入了一个新阶段。用外延X-射线吸收精细结构方法(简称EXAFS)对钼铁蛋白和铁钼辅基中     

苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti) nifA基因通过诱导宿主防卫反应调节根瘤的形成

苜蓿中华根瘤菌nifA基因是固氮基因的正调节因子, 本文研究了nifA基因对根瘤形成的调节作用. 在分裂根实验中, nifA突变株对另一侧根的结瘤抑制率比野生型菌下降43.7%, 感染突变株植物合成的植保素和形成的坏死细胞的数量也相应减少, 与植物防卫反应相关的苯丙氨酸解氨酶基因、查儿酮合成酶基因和几丁质酶基因不能表达. 这些结果说明, 苜蓿中华根瘤菌nifA基因通过诱导宿主植物的防卫反应对根瘤的形成进行调节. 虽然nifA突变株在宿主植物上引发根瘤的数量增加, 它合成的结瘤因子的量却比野生型菌株少. 因此, 可以推测nifA基因介导了多种信号途径对根瘤的形成进行调节.     

缺失nifZ棕色固氮菌突变株(DJ194)钼铁蛋白的金属原子簇的组成与分布

经DEAE 52, Q-Sepharose和Sephacryl S-200柱的厌氧层析, 从缺失nifZ基因的棕色固氮菌突变株(DJ194)中纯化得到固氮酶钼铁蛋白(ΔnifZ Av1). 厌氧天然电泳后的Western blotting和SDS-变性凝胶电泳显示, ΔnifZ Av1的电泳迁移率、分子量和亚基组成等与野生种钼铁蛋白(OP Av1)相似; 而且ΔnifZ Av1的Mo含量、EPR信号(g ≈ 4.3, 3.65和2.01)及660 nm附近的圆二色摩尔消光系数(Δε)也都与OP Av1较相似, 表明ΔnifZ Av1除具有α₂β₂四聚体结构组成外, 还含有与OP Av1数量相当的、具有3/2自旋态的还原FeMoco. 然而, ΔnifZ Av1的Fe含量和对底物 (C₂H₂, H⁺和N₂)的还原活性都较低, 分别约为OP Av1的74%和46%~50%, 而反映P-cluster状况的450 nm附近的Δε也明显低于OP Av1, 说明ΔnifZ Av1与OP Av1的差别在于P-cluster, 而不在于FeMoco, 而且是在于ΔnifZ Av1中P-cluster数目的减少(约50%), 而其组成或氧还状态并未改变. 据此推测ΔnifZ Av1(DJ194)的结构为: 一个αβ亚基对含有一个FeMoco和一个P-cluster, 而另一个αβ亚基对只含FeMoco, 无P-cluster. 由于nifZ基因的缺失只造成了钼铁蛋白中2个P-cluster中的一个不能组装, 因此推测P-cluster的组装可能不是受单一基因产物的影响并由此提出了NifZ的可能作用机理.     

普通野生稻(Oryza rufipogon)内生固氮菌多样性及高固氮酶活性

从广东博罗、惠来和海南陵水县普通野生稻中分离到37株内生固氮菌, 并测定其固氮酶活性. 经固氮酶基因(nifH)的PCR扩增检测, 37株内生固氮菌均能扩增出固氮酶基因(nifH)片段. 在80%相似性水平上, IS-PCR指纹图谱聚类分析得到8个类群(Ⅰ~Ⅷ). SDS-PAGE全细胞蛋白电泳聚类分析与IS-PCR的聚类结果相似. 对各类群相应代表菌株(Ls13, Ls8, BL1, BL12, HL6, Ls4)进行脂肪酸含量和成分比较, 结果表明, 这些菌株的脂肪酸成分和含量具有较大的差异. 16S rDNA序列分析表明, 类群Ⅰ~Ⅶ的菌株均属于肠杆菌科(γ-变形菌纲), 其中类群Ⅰ和Ⅱ的菌株属于克雷伯氏菌属不同种群; 类群Ⅲ菌株Ls8与成团泛菌(Pantoea agglomerans)的相似性为96%, 可能代表该属内的一个新种或一个新属; 类群Ⅳ和类群Ⅴ的菌株代表肠杆菌属的不同种群; 类群Ⅵ菌株Ls4和Ls9与无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)有98%的相似性; 类群Ⅶ菌株Ls15与成团泛菌关系最近, 有97%相似性, 属于泛菌属; 类群Ⅷ属于Ideonella属(β-变形菌纲). 这些表明普通野生稻内生固氮菌具有较大的多样性, 且部分菌株具高固氮酶活性, 达42.52 ?mol C2H4·mL^-1·h^-1. 水稻接种实验表明内生固氮菌能明显促进水稻生长.     

荧光假单胞菌G2-EPSP合酶的拆分和intein介导的活性恢复

利用GPS-LS接点扫描系统, 在荧光假单胞菌G2的5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶编码基因aroA中随机插入15 bp (即编码5个氨基酸短肽)的外源片段, 建立含一系列不同插入位点的aroA突变体库. 利用内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER2799对突变体库进行功能互补筛选, 测序后确定了12个可以忍受5个氨基酸插入的位点, 其中位点F295/T296经Ssp DnaE内含肽(intein)介导的蛋白互补技术鉴定为可拆分和蛋白重建的位点. 从位点F295/T296将G2-EPSPS基因一分而二, N-端和C-端片段分别连接在携带Ssp DnaE 内含子元件的原核表达双质粒上, 获得共转化质粒pMEPSN295IN和pKEPSC296IC. 将质粒pMEPSN295IN和pKEPSC296IC分别或共转化内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER2799中, 携带共转化质粒的重组子能够在M9限制性培养基生长, 而携带单一质粒的不能生长, 表明从位点F295/T296拆分的aroA基因在内含肽介导下实现了蛋白重建, 在突变株ER2799中恢复了5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶活性, 酶活水平达到野生型的62.92%,为4.48 U/mg.     

反义核酸对β-地中海贫血基因(IVS-2-654 C→T)剪接缺陷抑制作用的研究

β-珠蛋白基因第2个内含子(IVS-2)中第654位核苷酸(nt654)C→T剪接缺陷型突变是中国人最常见的β-地中海贫血(简称β-地贫)突变类型之一.我们先前的研究表明,该突变在IVS-2第654位(nt654)上出现的单碱基取代产生了一个新的 GT二核苷酸,它联同旁侧序列构成了一个5＇异常剪接位点,同时还激活了IVS-2第579位(nt579)处3＇隐匿剪接位点,从而将 IVS-2nt580至 nt652之间一段73bp内含子序列作为额外的外显子插入外显子2和外显子3之间,产生了异常的β-珠蛋白mRNA,导致β~ -地贫.为了探讨反义核酸治疗β-地贫IVS-2-654 C→T突变的可能性,我们应用体外转录和体外剪接系统,以体外转录产生的特异反义RNA封闭IVS-2-654 C→T突变基因中3＇隐匿剪接位点和5＇异常剪接位点,使之失去活性,从而减少异常加工的mRNA并且部分恢复了正常剪接途径.     

磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense)氢酶基因功能分析及对细胞生长的影响

探讨了磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1)氢代谢与细胞生长、磁小体合成之间的关系. 分别构建了吸氢酶大亚基基因hupL缺失突变株L206和氢酶大亚基基因hyaB与hupL的双缺失突变株B206. 比较了野生型菌株与突变株在摇瓶培养条件下的吸氢量、放氢量、细胞生长曲线和铁的吸收, 并结合电子显微镜观察了细胞内磁小体合成情况. 结果表明, 磁螺菌HupSL为专一性的吸氢酶, HyaAB为专一性的放氢酶; L206在磁小体合成过程中的放氢量相对较高, 其生长速度、铁吸收速度明显快于MSR-1及B206. 推测磁螺菌可通过上述吸氢酶和放氢酶的作用适当调节细胞内还原力的平衡, 促进铁的吸收和磁小体合成.     

控制麻疹病毒血凝集性的重要功能位点

IMA·SMD是经B95a细胞系培养纯化的 2株麻疹病毒 ,其血凝集性 (Hemadsorption ,HAD)呈阴性 .将其在Vero细胞系中培养数代后其血凝集性转变为阳性 .对在 2种细胞中培养获得的病毒进行序列分析发现 :以上 2株病毒H蛋白的第 5 4 6位均由Ser(HAD阴性 )突变为Gly(HAD阳性 ) .利用位点专一性诱变并在COS细胞中对 2种H蛋白进行表达证实 :该突变导致血凝集性的改变 ;进一步利用抗CD46的单克隆抗体证实 :该突变同时导致H蛋白与CD46受体结合功能的改变 .从而确定了第 5 4 6位氨基酸是一个新的决定血凝集性及H蛋白与CD46受体结合的重要位点 .     

[A21~(Ser)-B27~(Arg)-B30~(Thr)-NH_2]-人胰岛素突变体的结晶和四方晶体的晶体学研究

一些实验结果表明,蛋白质位点突变的效应具有加和性.[A21~(Ser)-B27~(Arg)-B30~(Thr)-NH_2]-人胰岛素(以下简称SRN-HI)是根据这种思想,通过蛋白质工程途径制备的一种多位点突变体.实验结果证实,SRN-HI既具有由突变A21(Asn→Ser)产生的高稳定性,同时又具有由     

一个水稻窄叶突变体的鉴定和基因定位

从粳稻品种“中花11”转基因后代中发现了一个窄叶突变体. 突变体表现为植株矮化、生育期延迟、叶片变窄及内卷和结实率降低等一系列突变表型. 窄叶突变体的剑叶在饱和光下净光合速率显著低于野生型, 在灌浆期剑叶的气孔导度和蒸腾速率也明显低于野生型. 遗传学分析表明, 该窄叶突变体表型受一对隐性核基因控制. 通过对突变体T₁代和T₂后代的分子检测发现, 该突变体表型非T-DNA插入引起. 利用籼粳杂交F₂群体对突变体位点进行了基因定位, 将其定位在第12染色体长臂上SSR标记RM7018和RM3331之间. 与经典的形态标记nal3(cul3)位于相同染色体区段, 故将该突变体暂定名为nal3(t). 随后, 利用已公布的水稻序列和SSR标记, 开发了6对新的STS标记, 进一步将窄叶基因nal3(t)定位在NS10和RH12-8之间, 遗传距离分别为0.58和0.26 cM, 物理距离约136 kb, 为进一步克隆nal3(t)打下了基础.     

纯合子人βE-珠蛋白基因转基因鼠系的建立

血红蛋白E(Hb E)是我国常见的异常血红蛋白病,它是由β-珠蛋白基因第26位编码子的G→A点突变引起.因Hb E与β-地中海贫血症状相似,又称之为地中海贫血样综合征;它也常与β-地中海贫血复合存在,危害严重.利用转基因动物技术研究真核基因表达调控已取得重要进展.已发现β-珠蛋白基因簇和α-珠蛋白基因簇上游区的DNase Ⅰ敏感区能明显提高珠蛋白基因的表达水平.其中β-基因簇的HS-2和α-基因簇的HS-40具有典型的增强子作用.     

细菌Ⅱ型分泌途径控制产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes) S2中卵磷脂酶的分泌

从水稻根际分离筛选出1株降解卵磷脂的有机磷降解细菌菌株S2, 通过形态指标、生理生化性状、16S rDNA序列、(G+C)含量以及DNA-DNA杂交分析, 鉴定为产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes). 采用双亲接合的方法将带有Tn5转座子的质粒导入产碱假单胞菌S2菌株中进行转座子插入诱变, 从5000个卡那霉素抗性的Tn5插入突变株中, 筛选到3株丧失解磷能力的突变株(M808, M1329和M1400)和1株解磷能力增强的突变株(M20). 对Tn5插入位点的基因进行DNA测序表明, 丧失解磷能力突变株中被突变的基因分别是xcpS, xcpX和xcpW, 它们分别编码XcpS, XcpX和XcpW蛋白, 这些蛋白是细菌Ⅱ型分泌途径中的主要成分. 将xcpS, xcpX和xcpW基因分别构建在pLAFR3载体上, 通过双亲接合的方式分别导入上述M808, M1329和M1400三个丧失解磷能力突变株中进行功能互补实验, 结果表明这3个基因都能使各自相对应的突变株恢复解磷能力. 以上结果表明, 在产碱假单胞菌中卵磷脂酶的分泌是通过Ⅱ型分泌途径来完成的. 解磷能力的丧失可能是由于Tn5插入xcp基因簇中的某一基因破坏了卵磷脂酶向胞外的分泌, 造成突变株不能降解有机磷. 在解磷能力增强突变株M20中, 被突变的基因与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PAO1中的chpA基因(参与细菌的颤动)同源性达88%.     

水稻线粒体tRNATrp的种属特异性氨酰化

为了研究原核生物和真核生物（细胞质）色氨酰tRNA合成酶（TrpRS）对线粒体tRNA^Trp识别的种属特异性,构建了7个水稻线粒体tRNA^Trp三位点（G73,U72,A68）的单点或多点突变的突变体．这些突变基因,经体外转录后分别用枯草杆菌（B．subtilis）和人色氨酰tRNA合成酶（TrpRS）进行氨酰化反应,并测定它们的动力学常数．结果表明,与野生型水稻线粒体tRNA^Trp相比,7个突变体的转录产物被B．subtilis TrpRS氨酰化的活力分别降低了53．33％-99．79％,被人TrpRS氨酰化的活力却分别提高了4～330倍,其中以MPH7（水稻线粒体tRNA^Trp的三碱基（G73,U72和C68）全部突变为人tRNA^Trp的三碱基序列）的氨酰化活力改变最大．实验结果证明,与真核生物和原核生物细胞质tRNATrp的种族特异性类似,水稻线粒体tRNA^Trp的种属特异性元件也主要处于氨基酸接受茎的识别位碱基、第一和第五对碱基对,亦即识别位碱基G73,氨基酸接受茎上的两个碱基对G1／U72和U5／A68．本研究为线粒体tRNA^Trp起源于真细菌的推论提供了实验依据．     

多肽研究(Ⅵ)——β-转化生长因子3个片段肽(93—102、84—102、25—38)的合成及其生物活性的初步测定

β-转化生长因子(Transforming growth factor-β,TGF-β)是许多正常和肿瘤细胞中普遍存在的具有多重功能的重要调节因子。为了探讨TGF-β的结构与功能的关系,我们合成了它的一系列重要片段,并对这些片段的生物活性进行了研究。本文首次报道其a.(93—102)、b.(84—102)和c.(25—38)片段的固相合成和生物活性的初步测定结果:     

可见光氧化还原催化制备β-硝基酮

胺基酮在天然产物和药物合成方面具有极其重要的价值. Mannich反应是合成β-胺基酮的重要方法,但仍然存在局限性:无法合成-NH₂未被修饰的β-氨基酮或-NH₂连在β-季碳上的酮.本文利用可见光诱导的氧化还原催化,由烯醇三甲基硅醚与偕溴代硝基烃在温和条件下制备各种β-硝基酮,包括硝基连在β-季碳上的酮.这些结构新颖的β-硝基酮很容易转化为β-NH₂酮、1,3-氨基醇、α,β-不饱和酮、β-氰基酮和γ-硝基酮.