基于不同底物筛选内蒙古大青山低温纤维素降解细菌

分别以微晶纤维素、羧甲基纤维素(CMC)和D-水杨苷三种不同底物为唯一碳源在10℃下对内蒙古大青山土壤中的低温纤维素降解细菌进行筛选并测定纤维素酶活.结果共分离到13株具有低温降解纤维素能力的细菌.经16SrDNA序列分析显示分属于9个不同的属,其中,以微晶纤维素为底物分离到的有4株,降解能力较强的菌株为QW-C,外切葡聚糖酶活性可达28.22U/mL,属于不动杆菌属(Acinetobacter);以CMC为底物分离到的有5株,降解能力较强的菌株是QC-A和QC-B1,内切葡聚糖酶活性可达10.67U/mL,分别属于短杆菌属(Brevibacterium)和类芽孢杆菌属(Paenibacillus);以D-水杨苷为底物分离到的有4株,降解能力较强的菌株是QS-B,β-葡萄糖苷酶活性可达20.22U/mL,属于罗河杆菌属(Rhodanobacter).其中,菌株QC-B1与相近菌种的相似性小于97%,可能为新种.     

克鲁维酵母中外切菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达研究

用PCR的方法从克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)ATCC12424中克隆出外切菊粉酶基因.将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pHBM905C、pHBM906上,构建了外切菊粉酶毕赤酵母表达载体pHBM1200、pHBM1201.将两者转化毕赤酵母GS115,得到重组菌株GS115(pHBM1200)、GS115(pHBM1201),将这两种重组菌株进行摇瓶发酵,测得带α-信号肽的菌株GS115(pHBM1200)表达的外切菊粉酶最高酶活为89.43 U/mL,带自身信号肽的菌株GS115(pHBM1201)表达的外切菊粉酶最高酶活为14.828 U/mL.SDS-PAGE电泳表明,外切菊粉酶的表观分子量为90 kD.将外切菊粉酶用去糖基化酶endoH处理后,SDS-PAGE电泳表明,分子量为60 kD,和预计的分子量一致.     

高活性秸秆降解菌群的构建及产酶条件优化

纤维素的开发与利用在当今资源紧缺的社会下是当务之急,秸秆含有大量的纤维素,木质素.它从一个农业废弃物逐渐变为了再生资源开发的焦点.为了将秸秆资源充分利用起来,我们以牛粪,羊粪及含腐烂树叶土壤的混合物为材料,利用限制性培养技术,对其中能够降解纤维素的微生物进行驯化培养,并得到一组高效降解纤维素的菌群.利用CMC糖化力法和滤纸酶法测定该菌群的纤维素降解能力.对菌群进行菌种的分离,并进行生理生化试验分析各个菌株的特性.通过正交试验对该菌群的最佳产酶条件进行优化.得到的菌群CMCase酶活的高达80U/mL,滤纸酶活高达152U/mL.得到的最佳产酶条件为蛋白胨纤维素培养基以滤纸为碳源,pH 5.0条件下35℃静置培养.筛选性能稳定的高产秸秆降解菌群,为充分利用秸秆等农业废弃物提供了新的方向.     

南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母的表达及酶学性质研究

为提高南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarcticalipase B,CALB)的表达量,根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏好性设计合成CALB基因,插入表达载体pPIC9K构建重组质粒pPIC9K-CALB.重组质粒转化毕赤酵母GS115,经过G418抗性筛选得到多拷贝转化子.摇瓶发酵120 h后上清液酶活力达到46 U/mL,通过金属螯合层析纯化发酵液将CALB纯化了5.23倍,比活力达到856.7 U/mg,去糖基化实验显示重组CALB比野生型CALB大5 ku.实验考察了不同反应温度、pH值和金属离子对重组CALB活性和稳定性的影响,发现重组CALB最适反应温度和pH分别为30℃和6.5,在pH 5.0~8.0之间以及40℃以下有较好稳定性,金属离子(10 mmol/L)Ca2+,Zn2+,Mn2+有助于CALB酶活力的提高,而Cu2+,Ag+,Fe3+强烈抑制酶催化反应.     

内切菊粉酶基因在毕赤酵母中的高水平表达研究

低聚果糖(Fructooligosaccharides,FOS)具有改善胃肠道环境、刺激和加强机体免疫反应、抑制肠道特定肿瘤的发生等生物活性.内切菊粉酶能够水解菊粉获得低聚果糖.为了实现内切菊粉酶的高表达,从无花果曲霉(Aspergillus ficuum ATCC16882)中克隆了内切菊粉酶编码基因INU2,并实现了在毕赤氏酵母中的重组分泌表达,摇瓶表达的酶活力为570.4U/mL.去除内切菊粉酶的内源性信号肽序列后,其重组表达水平显著提高,摇瓶表达的酶活力为1013.8U/mL,提高幅度77.7%.TLC分析表明:毕赤酵母重组表达的内切菊粉酶(不含内源性信号肽序列)能将2%长链菊粉水解为2～3个聚合度的低聚果糖.     

重组人β防御素-3表达条件的优化及其对抑菌活性的影响

探讨表达条件对重组人β防御素-3(rhβD-3)表达量和抑菌活性的影响.对重组酵母菌的摇瓶发酵条件,如pH、发酵温度、甲醇的添加量等进行优化.结果表明,适宜的表达条件为BMMY培养基pH为6.0,装液量50mL/500mL锥形瓶,28℃,290r/min培养48h,每24小时加0.5%(V/V)甲醇.优化后rhβD-3的表达量可提高到340μg/mL,抑菌活性也有所提高.     

人ω干扰素在毕赤酵母中的表达和纯化

ω干扰素(IFN-ω)是同IFN-α功能相近但抗原性不同的一类干扰素分子,它具有同IFN-α、IFN-γ以及肿瘤坏死因子α相似的抑制病毒复制的作用.采用5L发酵罐发酵表达IFN-ω,发酵培养液经超滤膜浓缩、SP层析柱梯度分离,得到糖基化的IFN-ω,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF-TOF MS)和N端蛋白序列分析仪分析其分子质量和N端序列,用细胞病变抑制法测定活性.结果表明,诱导约48h时,目的蛋白表达量最高,通过SP梯度洗脱,可将糖基化和非糖基化的IFN-ω分离,质谱分析糖基化蛋白样品,质谱峰为糖基化蛋白特有的峰.纯化后糖基化的IFN-ω抗病毒活性为1.46×108 U/mL.     

Shewanella haliotis BP-1海藻酸裂解酶基因的克隆表达

【目的】了解海洋细菌Shewanella haliotis BP-1中海藻酸裂解酶降解海藻酸钠的生物活性。【方法】应用基因克隆和大肠杆菌异源表达技术,过量表达海藻酸裂解酶,将粗酶液通过DEAE Sepharose FF柱分离纯化后检测其酶活性。【结果】从S.haliotis BP-1菌株的基因组DNA中克隆得到一个大小为2 157bp的海藻酸裂解酶基因Alg17S,该基因编码的海藻酸裂解酶Alg17S属于PL17家族的蛋白,大小为79 726Da,其中包括N端26个氨基酸的信号肽,与Saccharophagus degradans 2-40菌株产生的海藻酸裂解酶Alg17C具有高度同源性,相似性为52%。经纯化后获得的重组酶Alg17S和△snAlg17S(N端不含26个氨基酸的信号肽)均具有降解海藻酸钠的活性,但△snAlg17S对海藻酸钠的催化活性比Alg17S高,其酶比活力高达9 635U/mg。【结论】重组海藻酸裂解酶△snAlg17S兼具高表达水平及高酶活性,是进一步研究海藻酸盐糖化和生物燃料生产的潜在的优势酶。     

黑曲霉内切葡聚糖酶系的基本酶学特征解析

基于黑曲霉(Aspergillus niger)CBS 513.88的基因组信息,以黑曲霉CICIM F0510作为基因来源,本研究成功将其17个内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母(Pichiapastoris)中进行了克隆表达.重组酶En4gA和En4gG对羧甲基纤维素钠具有较高酶活力,分别为11.67 U/m L和7.45 U/mL;而其他重组酶的酶活力为0.83～1.62 U/m L.此外,En3gA、En3gB、En3gC、En4gA和En4gB还可以水解茯苓多糖.酶学性质的研究表明,这些重组酶的最适作用温度和最适作用pH分别为45～65℃、pH 3.5～6.0,且分别在40～80℃和pH 2.0～7.0具有较好的热稳定性和pH稳定性.进一步通过底物水解特征、进化树以及碳水化合物活性酶(CAZy)分类系统将这些内切葡聚糖酶分为4类.良好的耐热性和耐酸性为这些重组酶在麦芽糖化、饲料颗粒化、纤维素乙醇、食品、纺织以及医药等行业的应用奠定了良好的基础.     

纤维素酶在酿酒酵母中的表面展示

利用木质纤维素进行生物法生产燃料乙醇在解决世界能源危机上有十分广阔的前景,但该产业受到预处理的限制,因此以酿酒酵母表面展示技术为依托,构建纤维素酶全细胞酶,既能水解木质纤维素又能利用水解木质纤维素得到的糖类发酵生产乙醇.将编码絮凝素锚定蛋白基因flo1与纤维酶基因cbh2串联整合在同一个开放阅读框中并构建p HBM368-PGK-flo1-cbh2重组表达载体.线性化重组表达载体后再导入尿嘧啶缺陷型酿酒酵母INVSc细胞,经由功能筛选及流式细胞法验证纤维素酶成功地展示表达在酿酒细胞表面.通过DNS法测得该全细胞酶在50℃反应1 h酶活为66. 75 U/mL.成功构建了以酿酒酵母为宿主菌的全细胞酶,为后期全细胞酶协同降解秸秆等系列研究奠定基础.     

一株细菌降解蒽芴的酶活特性研究

本研究采用单因素实验以降解温度、pH、PAHs/活性炭百分数为自变量,降解蒽芴后的脱氢酶活性为因变量进行酶活研究.结果表明,在培养24 h后,菌株降解蒽、芴后脱氢酶活性的变化具有相似性,且降解芴的脱氢酶活性均高于蒽.其中蒽的最适降解条件为PAHs/活性炭百分数3%,温度35℃,pH=7,脱氢酶活性最高达41.91(μg/mL)·h;芴的最适降解条件为PAHs/活性炭百分数3%,温度36℃,pH=8,脱氢酶活性最高为89.17(μg/mL)·h.可见,相同条件下该细菌对芴的降解效果高于对蒽的降解.     

南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母中的分泌型表达及酶学性质初探

将南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA(含pAOX1启动子)和pGAPZαA(含pGAP启动子)中,转入毕赤酵母表达宿主KM71H,经三丁酸甘油酯平板活性筛选获得高效表达的酵母工程菌株.分泌型表达CLAB酵母工程菌的酶活较高,经摇瓶发酵96h后,CLAB活力达到11.1U/mL.经发酵罐高密度发酵84h后,CLAB活力达到179.2U/mL,蛋白质量浓度为1.36mg/mL.体积分数12%SDS-PAGE凝胶电泳显示重组CALB相对分子量为36kDa.该酶最适温度为40℃,最适pH值为8.0.在pH7.5~9.5较稳定,经55℃保温1h,残余酶活还有48.5%.5mmol/LMg2+、Ni+、Co2+和体积分数0.10%SDS对CALB酶活影响很小,而Zn2+强烈抑制酶催化反应,体积分数0.05%TritonX-100对CALB稍有激活作用.     

重组锰超氧化物歧化酶工程菌摇瓶发酵条件的优化

通过单因素试验对重组锰超氧化物歧化酶(Recombinant Manganese Superoxide Dismutase,rMn-SOD)工程菌的摇瓶发酵的培养基(碳源、氮源、无机盐)和培养条件(接种量、乳糖浓度、时间、温度、摇床转速、pH值等)进行了初步优化.结果表明,工程菌发酵的优化培养基组分(质量分数)为:1.5%蛋白胨、1.5%酵母提取物、1.0%NaCl、0.4%KH2PO4、0.8%K2HPO4、1.5%(体积分数)甘油、0.2%NH4Cl和5 mmol/L MnCl2.乳糖诱导表达的优化条件为:以5%接种量培养5 h后,加入质量分数为0.25%的乳糖进行诱导表达6 h.当发酵温度为37℃、摇床转速为180 r/min、培养基的初始pH值为7.0时,表达的rMn-SOD的酶活力高.在优化条件下,工程菌的SOD活性达1 969.9 U/mL,比活力达1 081.8 U/mg.     

平菇菌渣厌氧消化产气潜力

为了拓展厌氧消化原料的来源,以平菇菌渣为研究对象进行沼气发酵试验.在中温(35±1)℃条件下,采用批量式发酵工艺,对其产气特性及有机质含量变化与厌氧消化之间的关系进行分析.试验结果表明,平菇菌渣是一种较佳的发酵原料,其原料产气率为464 mL/g、TS产气率为619 mL/g、VS产气率为720 mL/g.在沼气发酵过程中,纤维素、半纤维素、木质素、粗脂肪、粗蛋白、总糖、低聚糖、还原糖和淀粉均不同程度的发生降解,其中纤维素和低聚糖的降解率远高于其他有机质,纤维素几乎全部降解,低聚糖降解率达到了90%以上.该试验结果为平菇菌渣的无害化、资源化利用提供理论研究基础和数据支持.     

产耐热α-葡萄糖苷酶重组大肠杆菌的构建及发酵条件优化

以非解朊栖热菌HG102基因文库筛选的重组质粒pUC18-atgly为模板PCR扩增α-葡萄糖苷酶结构基因,与表达载体pET28α(+)连接,转入大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.对重组菌的产酶条件进行了初步优化,最终酶活由4.25U/mL提高到40.85U/mL.     

重组精氨酸脱亚胺酶的表达、纯化及其抗癌活性

克隆了ADI并在大肠杆菌中表达重组蛋白,得到的ADI重组蛋白通过离子交换层析纯化并进一步复性.复性后的重组ADI蛋白经分析与天然ADI蛋白具有相近的分子量(大约46 kD)和相似的酶活性(38 U/mg),可以将L-精氨酸转换成瓜氨酸.在蛋白酶降解实验中,发现重组ADI具有比天然ADI更稳定的抗胰蛋白酶降解活性,重组ADI的半衰期比天然ADI的更长.重组ADI能抑制肿瘤细胞HepG2的生长,同时具有抑制HepG2细胞迁移的作用.     

重组肠激酶催化亚基在毕氏酵母中的高密度发酵、纯化及活性鉴定

应用RT-PCR和搭桥PCR技术,扩增肠激酶催化亚基的cDNA,测序正确后克隆至酵母分泌型表达质粒p9K中.将重组质粒p9K/EKLC转化至表达宿主pichia pastoris GS115,筛选得到高效表达重组牛肠激酶催化亚基工程菌.经甲醇诱导,目标蛋白肠激酶催化亚基(EKLC)表达并分泌至酵母培养基中.高密度发酵后,经超滤浓缩,采用SP Sepharose F.F一步纯化得到纯度达98%以上的重组目的蛋白,活性达到2.3 U/uL.上述结果表明,本实验成功获得了肠激酶催化亚基,它是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶.     

肺炎克雷伯杆菌表达吡咯喹啉醌依赖性聚乙烯醇脱氢酶

聚乙烯醇脱氢酶（PVADH）是降解聚乙烯醇（PVA）的关键酶,大肠杆菌或毕赤酵母生产PVADH需额外添加辅酶吡咯喹啉醌（PQQ）才具活性。为了降低添加PQQ的成本,在PQQ天然生产菌肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae）中表达全酶PQQ-PVADH。首先通过外源基因密码子优化实现PVADH的高效表达,PVADH酶活达到45 U/mL;进而通过辅酶再生提高PQQ产量,双质粒重组菌Kp（pvadh+pqq）的PVADH酶活达到68 U/mL;最后经发酵优化,PVADH酶活达到81 U/mL,为PQQ-PVADH的生产提供了另一种选择方案。     

人Cu，Zn-SOD在重组毕赤酵母中表达的发酵工艺研究

以表达人Cu,Zn-SOD的重组毕赤酵母为出发菌株,通过摇瓶实验研究发酵初始pH值、诱导剂浓度、诱导温度和培养基组成等因素对目的蛋白表达水平的影响.实验结果表明,培养基组分对目的蛋白表达水平的影响最大.与YPG培养基相比,菌株在FM22培养基(含0.15%组氨酸及PTM4)中目的蛋白表达量提高5.5倍.在优化摇瓶发酵条件下(诱导剂浓度1%,诱导温度27℃,FM22培养基(含0.15%组氨酸及PTM4),初始pH值为6.0),发酵液上清酶活水平为895 U/mL,较初始提高8.5倍;以摇瓶实验结果指导5 L罐发酵,得到13 539 U/mL酶活,为摇瓶试验的15倍.     

桐粕降解菌DBTM6培养条件及降解酶活性的研究

采用单因素试验法对桐粕降解菌DBTM6菌发酵的主要影响因素碳源、氮源、温度、转速、初始pH值等进行了研究,通过正交试验对其发酵培养基在摇瓶阶段进行了优化,并在优化后的条件下测定了该菌的生长曲线及其产生的蛋白酶、果胶酶和纤维素酶的活性.结果表明:该菌株最适培养基各成分质量分数为:玉米粉2.0%,蛋白胨0.5%,NaCl 0.5%,最适条件:温度为40℃,pH为6.0,转速为200 r/min.在最适培养条件下测定了DBTM6菌的纤维素酶活力为3.5717 U/mL,果胶酶活力为1.1415 U/mL,蛋白酶活力为36.358 3 U/mL,比活力分别为13.8545U/mg,4.4279 U/mg,141.0331 U/mg.