鞭毛蛋白毒素导致的黑松超微结构病理学变化

【目的】以松材线虫、致病细菌荧光假单胞菌及其鞭毛蛋白毒素、非致病细菌缓慢葡萄球菌等材料对3年生黑松进行接种试验,通过其样枝切片的超微结构病理学变化,了解致病细菌毒素在松萎蔫病中的作用。【方法】分别以野生松材线虫悬液、荧光假单胞菌菌株GcM5-1A无细胞滤液、无菌松材线虫+荧光假单胞菌菌株GcM5-1A、荧光假单胞菌菌株GcM5-1A的鞭毛蛋白毒素Flg、无菌松材线虫+缓慢葡萄球菌菌株AM2C、无菌松材线虫悬液接种黑松,以健康松树为对照。对于发病的处理,在接种后病程的第2或第3阶段取样; 对于未发病的处理,则在接种11 d后取样。取样时,在距离接种点不同位置进行,然后制备透射电镜样品,观察这些切片的超微结构变化。【结果】野生松材线虫、GcM5-1A无细胞滤液、无菌松材线虫+GcM5-1A、GcM5-1A鞭毛蛋白毒素等4种处理下黑松树体组织的超微结构均遭受严重破坏,病理学变化趋势一致。无菌松材线虫、无菌松材线虫+AM2C等两种处理下树体组织基本未遭受破坏,超微结构观察结果与健康松树的基本一致。GcM5-1A无细胞滤液与野生松材线虫的处理中,在靠近接种点处,前者处理下切片的超微结构受害比后者严重; 在远离接种点处,前者受害反而比后者轻。通过GcM5-1A无细胞滤液与野生松材线虫接种观察结果比较,发现松材线虫在树体内的移动加速了致病菌的扩散,导致毒素的增产和扩散,加速了松树的死亡。【结论】在接种处理的第2阶段是松萎蔫病发展的关键阶段。无菌松材线虫不能致死松树,而松材线虫携带的致病细菌产生的毒素是致死松树的真正原因,验证了松萎蔫病是松材线虫与其携带致病细菌的复合侵染导致病害的假说,而松材线虫在树体内的移动加速了致病菌的扩散,最终导致松树加速死亡。     

松材线虫携带细菌的鉴定和毒性研究

从松材线虫病致死的松材木质部和松材线虫体表分离到3个出现频率较高的细菌菌株，菌株Nji、Njt和Njw。经鉴定3种细菌分别为荧光假单胞菌I型（Pseudomonas fluorescens biotype I)荧光假单胞菌Ⅱ型（Pseudomonas fluorescens biotype Ⅱ）和泛菌属某种（Pantoea sp.)。用牛肉膏蛋白胨液体培养基振荡培养细菌，培养液直接处理黑松愈伤组织，测定各细菌的产毒能力。与对照（空白培养液）相比，3种细菌的培养原液都可对黑松愈伤组织产生明显影响，其中菌株Nih和菌株Njt可以在2d内使愈伤组织明显变色，菌株Njw处理变色较慢。表明菌株Nij和Njt培养液内有大量致萎毒性物质存在。     

松萎蔫病病原的研究

为了探讨松萎蔫病与松材线虫的关系,笔者研制了一种简单试验装置"冷闸",使接种的线虫被隔离在松树接种枝内而不能迁移.用该装置进行接种试验的结果表明:在松材线虫被局限于接种枝内而不能移动到寄主其他部位的情况下,接种无菌松材线虫与致病荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescerns(GcM5-1A),以及该致病细菌体外培养的无细胞滤液,同样能诱发该病.该致病细菌又从接种无菌线虫和致病细菌后病死寄主中分离到并被鉴定,证明符合柯赫法则.致病荧光假单胞菌GcM5-1A体外培养的无细胞滤液接种试验结果说明,该致病菌株培养物中的内吸性毒素导致了寄主的萎蔫和死亡.由此,松萎蔫病经实验证实为首例由细菌和线虫互惠共生复合体引起的植物病害.     

松材线虫携带的荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens GcM5-1A菌株分泌的毒素及其对黑松的毒性

从松材线虫携带的致病细菌荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens GcM5-1A菌株的培养液中分离、纯化得到一种50 ku的蛋白质,其N-末端氨基酸顺序为ALSVNTNITS,证明其为荧光假单胞标准菌株P.fluorescens Pf-5的鞭毛蛋白相似,同时该蛋白能与Pf-5菌株鞭毛蛋白抗体反应,证明其为相同的鞭毛蛋白。两个环二肽同时从GcM5-1菌株培养液中被分离和鉴定,它们是cyclo(-Pro-Val-)和cyclo(-Pro-Tyr-)。生测表明此次分离鉴定的鞭毛蛋白和两个环二肽对黑松愈伤组织及幼苗均具毒性。采用细胞免疫荧光分析、细胞染色观察、电导率测定、基因组DNA电泳分析技术对上述鉴定的鞭毛蛋白与黑松愈伤组织的作用及致死方式进行了研究,结果表明：鞭毛蛋白与黑松细胞之间存在直接的互作;鞭毛蛋白处理的细胞其细胞膜皱缩变形、细胞质浓缩、细胞核变形,形成若干小核,细胞质中的RNA降解;处理细胞着色力增强,细胞培养液的电导率增加,说明鞭毛蛋白科增加细胞膜的透性;基因组DNA电泳分析证实处理细胞的DNA发生断裂,但无明显的梯子形成,推测鞭毛蛋白对黑松细胞的致死方式为非典型的细胞凋亡。     

荧光假单胞菌GcM5-1A溶血素的基因克隆及其活性研究

利用基因克隆技术探究了松材线虫携带的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)GcM5-1A是否含有溶血素基因以及溶血素活性。根据荧光假单胞菌疑似溶血素的基因序列设计一对引物,通过PCR技术扩增得到疑似溶血素基因Hly。将该基因克隆到表达载体pET-15b上,构建了pET-15b-Hly。重组质粒pET-15b-Hly转化E.coli BL21(DE3)构建了工程菌,工程菌经过异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,SDS-PAGE分析表明,疑似溶血素在大肠杆菌中得到了表达。利用Ni-Sepharose 6(FF)亲和树脂纯化了重组蛋白,溶血实验显示,纯化的重组蛋白可使鸡的红细胞发生溶血,证实本研究所克隆基因确实编码溶血素,利用黑松切根苗的生测表明,重组荧光假单胞菌溶血素对黑松幼苗有致萎活性,这为深入研究松材线虫携带细菌在松材线虫病病理进程中的作用打下了基础。     

荧光假单胞菌的应用与展望

植物根际促生菌(PGPR)中的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)对植物病原体具有潜在的拮抗作用,同时具有促进植物生长的能力.阐述了荧光假单胞菌在实际生产中的应用潜力.荧光假单胞菌可以通过产生生长素,增强土壤中磷、钾的可用性,促进植物叶绿素含量的增加,及产生谷胱甘肽、ACC脱氨酶等形式促进植物的生长.通过产抗生素(吩嗪、2,4-二乙酰基间苯三酚、藤黄绿脓菌素、硝吡咯菌素)、拮抗线虫等方式帮助植物体抵抗病虫害的侵袭.除此之外,荧光假单胞菌所具有的定殖与产铁载体能力在植物的促生与抗病方面皆发挥着重要作用.荧光假单胞菌在农业生产方面具有巨大的应用潜力.     

松材线虫与其携带细菌之间的相互影响

笔者研究了从松材线虫体上分离的2 株强致病菌和1 株弱致病菌与松材线虫的相互影响。结果表明:强致病菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) GcM5 1A菌株、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ZpB1 2A菌株能够明显地促进无菌松材线虫的产卵量增加、繁殖速度加快和成虫虫体生长;同时,松材线虫也能促进强致病菌荧光假单胞菌GcM5 1A菌株、恶臭假单胞菌ZpB1 2A菌株的繁殖。而泛菌(Pantoea sp.)ZM2C菌株完全抑制了无菌松材线虫的繁殖,无菌松材线虫对泛菌ZM2C菌株的繁殖亦具有显著抑制作用。由此说明松材线虫与其携带的某些致病菌之间存在互惠共生现象,松材线虫携带的致病菌并不是偶然的污染,它们之间的互惠共生现象是在长期共生进化中形成的。笔者还讨论了互惠共生现象在松材线虫致病过程中的作用。     

对虾池中紫色非硫细菌的分离及初步鉴定

利用特异性培养基对采自宁波地区虾池泥水样品进行富集、分离和纯化，得到了11株紫色非硫细菌（PNSB），依据形态特征观察、活细胞吸收光谱测定及碳源利用等实验，初步鉴定这些光合细菌分属于3个属中的4个种，即红假单胞菌属的沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）、红细菌属的荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）、类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）和红微菌属的万尼氏红微菌（Rhodomicrobium vannielii）．     

松材线虫携带细菌的致病性

用松材线虫携带的3种细菌（菌株Njh,菌株Njt和菌株Njw)和2种线虫（松材线虫和拟松材线虫）为接种体，以黑松愈伤组织和黑松无菌苗为接种对象，分别用无菌线虫单独接种，细菌单独接种，细菌和无菌松材线虫混合接种，细菌和无菌的拟松材线虫混合接种等，测定对黑松愈伤组织和黑松无菌苗的致病能力，接种试验结果表明，单独用无菌松材线虫或松松材线虫接种，均不能使黑松愈伤组织褐变和无菌黑松苗枯萎，而用无菌线虫与上述3种细菌分别混合接种均能使黑松无菌苗发生枯萎及愈伤组织严重褐变，其中线虫和菌株Njh，线虫和菌株Njt致萎活性很强，线虫和菌株Njw致萎活性较弱，在自然界致病力弱的拟松材线虫与细菌混合接种同样能引起松苗严重萎蔫及愈伤组织褐变，实验室条件下，人工接种幼苗病害的发生与松材线虫携带的细菌密切相关，而与线虫的在关系不大，松材线虫所携带的细菌在这一病害过程中起至关重要的作用。     

不同松树与松材线虫互作中超氧自由基差异与病变的关系

为探讨松树感染松材线虫后超氧自由基(O2)动态变化与寄主组织病变的关系,对黑松、马尾松和火炬松与松材线虫互作中的O2、超氧化物歧化酶(SOD)及组织病理学变化进行了研究.结果表明,3种松树在接种早期(接种后4 h)O2含量增幅和SOD活性大小依次为:火炬松、马尾松、黑松,且抗性松树上升幅度大,抗性松树受害较感病松树轻;至接种后期(接种后72 h至120 h)3种松树体内O2含量和SOD活性从高到低依次为:火炬松、马尾松、黑松,火炬松病程发展较黑松和马尾松慢(马尾松慢于黑松),受害轻.这表明不同抗性松树感染松材线虫后其体内O2和SOD酶活变化与寄主组织病变密切相关,超氧自由基可能是松树受松材线虫侵染后介导抗病信号转导的重要信号物质.     

松材线虫病死木中真菌和细菌的分离

从来自江苏省和浙江省几个疫区的松材线虫(PWN)病病死木的木质部中分离出111个真菌菌株，经鉴定种类为木霉(Trichoderma spp．)、轮枝霉(Verticillium spp．)、青霉(Penicillium spp．)、镰孢霉(Fusarium spp．)、曲霉(Aspergillus spp.)、毛壳菌(Chaetomium spp．)、茎点菌(Phoma spp．)、短梗单孢霉(Dicoccum sp．)、头孢霉(Cephalosporium sp．)、交链孢霉(Alternaria sp．)，这些真菌约占分离真菌总数的60％；在43％的未鉴定菌中，除3个菌株为有孢菌外，其余均是无孢菌。可以分离出真菌的病死木占56．42％，从病死木中可分离出细菌的比例达86％，可同时分离到真菌和细菌的比例为43．6％。     

不同真菌对松材线虫繁殖及致病力的影响

利用3年生黑松为接种材料,研究在9种不同真菌上取食的松材线虫的繁殖和致病力变化。结果表明,真菌对松材线虫的繁殖和致病力有显著影响。松材线虫在9种真菌上取食后,松材线虫繁殖力和致病力从大到小而依存的真菌依次为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、拟盘多毛孢(Pestalotiopsis sp.)、盘多毛孢(Pestalotia sp.) 、拟茎点霉(Phomopsis sp.)、茎点霉(Phoma sp.)、头孢菌(Cephalosporium sp.)、交链孢(Alternaria sp.) 、炭疽菌(Colletotrichum sp.)、长喙壳(Ceratocystis sp.)。实验表明松材线虫的繁殖力与其致病力变化相一致。     

中国江苏、浙江和甘肃与松树相关的线虫种类调查

于2008年5月至11月在中国江苏、浙江和甘肃省进行了与松树相关的线虫种类调查。对马尾松、黑松、湿地松、赤松、油松健康树及病树和死亡树的122个样木进行了检测,将分离到的线虫进行了线虫形态学光镜和扫描电镜的研究。结果共鉴定出5个属的10个种,它们分别是Bursaphelenchus xylophilus Nickle, B. mucronatus, B. aberrans , B. hofmanni, B. sp., Aphelenchoides macronucleatus Baranovskya, A. vaughani Maslen, A. bicaudatus, Ektaphelenchoides pini, Laimaphelenchus sp. Fuchs。大部分线虫发现于死亡或濒死的松树上,只有Aphelenchoides bicaudatus存在于健康黑松树种。Laimaphelenchus sp.存在于油松树皮下,这是该种线虫在中国和Seinura wuae以黑松为寄主的首次记录。     

日本松干蚧综合防治试验初报

<正>1973-1982年在南京、杭州、无锡等地建立了试验林,对日本松干蚧进行了一系列综合防治试验。制定了日本松干蚧生命表,分析了松干蚧花蝽、大赤螨、瘿蚁等捕食性天敌的作用。试验表明,促使松干蚧种群数量下降的关键是在具备一定数量捕食性天敌条件下的苏云金杆菌蜡螟变种松干蚧品系的流行,这种杆菌的流行可导致松干蚧种群急剧下降至“经济允许水平”以下。秋季喷菌时间离10月上旬越迟,感病越低;喷菌时间在5-7月或11月及其后,效果都不好;春季3-4月效果中等。翌春温高湿低,特别是干旱,松干蚧杆菌病流行速度减慢。其机理主要是对雌成虫和初孵若虫喷菌时湿度要很高,喷菌后松干蚧虫体要积水才易感病。对松干蚧其他虫态用喷杆菌方法还不易使其感病。 试验还证明,六六六丁体对此菌有强烈抑制作用。过去各地使用过量六六六防治松毛虫,是招致松干蚧大发生的原因之一。     

干旱胁迫对松材线虫病发生的影响

从感染松材线虫后，用不同干旱胁迫（ＰＥＧ）处理，包括干旱（不浇水）与浇水对松树的蒸腾作用，树体内过氧化氢酶（ＣＡＴ）活性变化及干旱对发病进程松树死亡影响的系统观察，结果表明，干旱能明显地加快感染松材线虫后黑松的死亡速度，干旱胁迫和松材线虫的杂能迅速破坏松苗体内保护酶（ＣＡＴ）的活民生，而加快其死亡速度；高温干旱年份能加快提高黑松，马尾松的发病死亡率，多雨年份马尾松的发病率则较轻，但黑松仍能大量发病     

松材线虫病致病机理和防治技术研究进展

在松材线虫病的研究方面,目前比较一致的观点是松材线虫在整个病程中起着重要作用,其中多数学者认为松材线虫是唯一病原,还有认为松材线虫携带的细菌与松材线虫一起导致发病。在致病机理的研究中,有三种主要观点:(1)松材线虫分泌的酶破坏了松树薄壁细胞的壁和膜,导致松树死亡;(2)松材线虫入侵松树后,松树体内出现了导致松树死亡的毒素;(3)松树感染松材线虫后,木质部内挥发性物质增加,管胞中形成了空洞,致使松树体内水分输导受阻,松树萎蔫死亡。在松树对松材线虫的抗性方面,树种之间抗性的差异性较显著,而同种松树不同地理种源之间抗性的差异性的显著程度因树种而异。     

环境变化对几个树种在北方田间条件下气体交换的影响

1994年和1995年夏季在加拿大Saskatchewa n省Prince Albert市北部森林测定环境条件对欧洲杨(Populus tremuloides Michx.), 胶杨(Populus balsamifera L.),榛子(Corylus cornuta Marsh.),短叶松(Pin us banksiana Lamb.)和黑云杉(Picea mariana (Mill) BSP)气体交换的影响.气体交换率的测定使用便携式气体交换系统(LI-6200).结果表明光合作用光流动量(PPFD)、气温(Ta)、蒸气压差(VPD)和体内二氧化碳浓度(Ci)均对气体交换有显著影响,但对不同树种影响程度不同.在大气二氧化碳浓度(Ca)和相对稳定的气温和蒸气压差下,欧洲杨比短叶松和黑云杉有较高光饱和点、同化量子产量(Φ)、在饱和PPFD下最高同化率(Pm)和较低的光补偿点(LCP).对欧洲杨树,幼龄树比老龄树有较高光合能力,且生长季早期光合能力比后期高.欧洲杨和短叶松的气孔导度(gs)随PPFD增加而增加.但黑云杉gs不受PPFD影响.在高光强下(PPFD>1 000 μmol*m-2s-1),欧洲杨幼树被光叶片比曝光叶片表现较低的净二氧化碳同化率(A)、gs和暗呼吸(Rd).短叶松和黑云杉Pm、Φ和Rd没有统计上差异.在高光强下,当气温从15℃增至35℃时,欧洲杨A和gs增加,黑云杉的降低,而短叶松没有明显变化.欧洲杨A和gs最高值的适宜的气温是24℃～29℃,短叶松是22℃～28 ℃,黑云杉是21℃～27℃.VPD明显影响欧洲杨、短叶松和黑云杉的气体交换,A和gs 均随VPD降低而增高.短叶松和黑云杉当年生树枝A通常比一年龄和二年龄树枝低.两个针叶树种一年龄和二年龄树枝的气体交换没有明显差异.A-Ci反应的斜率(即羧化效率(CE))取决于PPFD、树种和树龄.一般情况下,CE遵循以下模式:欧洲杨>胶杨>榛子>短叶松, 欧洲杨幼树>老树.总的结果表明尽管Ci、Ta和VPD改变光合作用效率,但光是最主要的因子 .在高光强下,影响气体交换的环境因子是气温和蒸气压差.     

松树两种病原菌拮抗微生物的筛选

采用组织分离法从健康的和感染松枯梢病的松树针叶上分离了叶栖微生物1 862株.选取有代表性的菌株通过室内平皿对峙培养,初步筛选出对松枯梢病菌和松赤枯病菌具有较好生防潜力的菌株12株.其中,拮抗细菌菌株6株、酵母菌3株、丝状真菌木霉(Trichoderma sp.)3株,拮抗效果由强到弱依次为细菌、木霉、酵母菌,细菌无菌滤液的拮抗效果明显好于菌体本身.拮抗菌的筛选以相对抑菌效果为准,同时应考虑被抑制率和菌种本身具有的致病性.     

黑松林根际土壤微生物区系及其养分研究

为了探讨山东低山丘陵区黑松林林地土壤肥力综合评价方法,对不同树龄和生长代数的林地根际与林间土壤微生物及其主要几种生理类群的数量分布和土壤理化性质的差异进行了研究．结果表明：①黑松林地土壤微生物以细菌占绝对优势,其次为放线菌．②随着树龄的增加,除氨化细菌外,林地土壤中细菌、真菌、放线菌、微生物总数量及各生理类群均表现出先升高后降低的趋势．③头栽林地土壤的细菌、放线菌、微生物总数量及各生理类群（氨化细菌、硝化细菌、固氮菌、纤维素分解菌和磷细菌）都不同程度高于连栽林地,平均数量分别约是连栽林地的1．43倍、1．08倍、1．18倍及（1．37倍、1．94倍、1．45倍、1．31倍和1．24倍）,但真菌平均数量（1．33×10^6个／g土）比连栽林地（1．48×10^6个／g土）的低11．3％．④除放线菌R／S值小于1．0外,土壤其余2大类和各生理类群的R／S值均在1．0以上,其中硝化细菌的R／S值最小,固氮菌的R／S值最高．⑤连栽引起土壤有机质、全氮、全磷、速效氮、速效磷含量及pH值分别下降9．42％、14．3％、19．9％、14．7％、20．4％及7．3％．