抗牙周病厌氧菌单链抗体基因的构建与表达

从牙周病厌氧菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株出发，通过基因工程方法－ＰＣＲ技术，调出其抗体的重链和轻链基因可变区序列，体外重组后得到单链抗体片段，克隆到了ｐＣＡＮＴＡＢ５载体上，在ＴＧ１中得到了成功表达。     

抗膀胱癌单链抗体基因在烟草中的表达

以抗膀胱癌单链抗体（ｓｃＦＶ）基因为目的基因,构建植物表达载体,转化烟草,研究医用治疗性工程抗体基因在植物中的表达,结果表明,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定出的转基因植株,叶片提取物的蛋白电泳有特异带出现,其分子量约为２７ｋｕ,同预期的单链抗体分子量一致,表达量最一株,抗体含量占可溶性蛋白的１．４％,竞争性抑制ＥＬＩＳＡ测定结果显示,该抗体有抗原结合活性。     

鼠源单抗3G1单链抗体基因的构建及序列分析

利用Rr—PCR方法，从分泌抗汉滩病毒mAb的杂交瘤细胞系3Gl中扩增出抗体VH和VL基因，通过PCR方法获得1inker—VL基因，进而利用加端PCR技术，在扩增出的单抗体VH和1inker—VL基因两端加上限制性酶切位点，分别克隆入pUCl8中并测序．3Gl VH基因长360bp，编码120个氨基酸；VL基因长324bp，编码108个氨基酸．在pUCl8载体中将VH和1inker—VL基因连接成ScFv基因．     

人源抗HBsAg单链抗体与干扰素嵌合基因的构建及表达

采用重叠PCR技术，将人源性抗HBsAg单链抗体基因与干扰素γ基因用柔性肽段碱基连接成单一基因。序列测定结果表明，克隆的基因与理论上的一致，并将此基因成功构建到酵母表达载体pPICZa上，进而转化到巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)X33中。筛选出的菌落经甲醇诱导培养，对上清液进行SDS—PAGE和WESTERN BLOT分析，在42000处可见蛋白表达带，这为进一步纯化目的蛋白和提高目的蛋白表达水平奠定了基础。     

抗PAF单链抗体的基因构建及蛋白质3D模建

构建抗PAF单链抗体的基因并通过计算机模建分析几种不同连接类型的单链抗体空间结构差异。采用重叠延伸PCR方法扩增了VH和VL基因,形成抗PAF的VH-Linker-VL(ScFv)基因产物,并经菌落PCR和测序分析鉴定,通过Internet对其3D结构进行了模建与分析,研究结果表明：PCR产物电泳可见一条与目的基因大小一致的片段,经菌落PCR和测序分析鉴定,抗PAF单链抗体的基因构建成功;VH和VL在单链抗体中的顺序对单链抗体3D的空间结构有影响。     

抗人端粒酶逆转录酶单链抗体基因在烟草中的表达

构建了含抗人端粒酶逆转录酶单链抗体基因ScFv-hTERT的植物表达载体p1304-SH,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草.转基因烟草植株叶片总DNA的PCR,Southern b lot检测结果表明,ScFv-hTERT基因已整合进了转基因烟草植株基因组中;RT-PCR,SDS-PAGE分析证实目的基因已在烟草叶片中成功表达,竞争性ELISA的结果表明,表达的重组抗体与其抗原有良好的结合活性.     

两种抗α毒素单链抗体基因的序列分析

应用RT－PCR技术,从两株分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜酸菌α毒素单克隆抗体（McAb)的杂交瘤细胞株2E3和1A8中,分别扩增出抗体VH和VL基因,用Linker(Gly4Ser）3基因,将VH和VL基因连接成ScFv基因2E3－ScFv和1A8－ScFv,并将其克隆至pGEM-T载体中,经核苷酸序列分析证实,VH和VL基因以及Linker基因拼接正确,2E3－ScFv基因全长为729bp,经计算机分析,VH和VL基因均为新发现的基因序列,符合功能性重排的鼠抗体可燮区基因特征,2E3－ScFv的VH和VL基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ（B）和轻链kⅢ家簇;而1A8－ScFv的VH和VL基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ（A）和轻链кⅥ家簇。     

人源性抗HBc单链噬菌体抗体库的构建

利用RT－PCR和噬菌体表面展示技术，直接从乙肝病毒核心抗体（抗HBc）阳性患淋巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA；合成全套人抗体可变区引物扩增抗体可变区基因，并将重、轻链可变区基因进行拼接装配成单链抗体（ScFv）基因，重组于噬菌粒载体pHEN1，转化抑制型大肠杆菌E.coliTG1，以辅助噬菌体援救后，构建成人源性单链噬菌体库。库容量达106。     

抗汉坦病毒单链抗体双元载体的构建

利用PCR方法,从含有1A8 scFv基因的重组质粒中扩增出抗体基因,并使基因两端携带合适的限制性酶切位点。经多步连接将其克隆入植物表达载体pBI121或pCAMBIA1305．2。酶切结果证明1A8 scFv基因被成功克隆入植物表达载体pBI121及pCAMBIA1305．2,构建获得1A8 scFv-p BI121及1A8 scFv pCAMBI A1305．2重组质粒,并将其转入农杆菌GV3101。抗汉坦病毒mAb 1A 8scFv植物双元表达载体的获得,为进一步在植物中表达该抗体片段奠定了基础。     

抗克伦特罗噬菌体单链抗体库的构建、筛选及鉴定

利用噬菌体展示技术构建克伦特罗(CBL)单链抗体(scFv)库,从中筛选CBL特异性噬菌体scFv,从而成功扩增出抗CBL的VL,VH基因片段并采用重叠延伸PCR拼接为全长的scFv基因片段,抗体库库容约为1.6×104,经4轮吸附—洗脱—扩增的富集,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法筛选到6个具有CBL结合活性的噬菌体scFv,为进一步大量表达CBL单链抗体奠定了基础.     

抗α毒素单链抗体基因表达载体的构建

将 2种抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体 (ScFv)基因ScFv - 2E3和ScFV - 1A8分别克隆至表达质粒pUC119,pET - 2 0b ,pET - 2 8a和pHOG2 1中 ,构建了重组质粒PUC -2E3和pUC - 1A8,pET2 0b - 2E3和pET2 0b - 1A8,pET2 8a - 2E3和pET2 8a - 1A8以及pHOG - 2E3和pHOG - 1A8,然后分别转化至大肠杆菌中 ,提取质粒 ,并进行酶切鉴定和核苷酸序列分析 ,结果表明构建的重组质粒中均含目的ScFv基因片段 ,说明已成功构建了 8个含ScFv基因的表达质粒     

一种导向性溶栓剂的基因构建及其在大肠杆菌中的表达

以针对人活化血小板表面糖蛋白GMP140的单克隆抗体SZ51的单链抗体作为导向分子,以单链尿激酶32kd变体(scu-PA-32k)作为效应分子,构建了一种新型的导向性溶栓剂。通过聚合酶链式反应(PCR),分别从SZ51的Fab片段基因中扩增出V_K和V_H区;从尿激酶原基因中扩增出scu-PA-32k基因。通过合适的linker及酶切位点,将V_K, V_H及scu-PA-32k基因相连接并装入表达载体pET-5a中的Nde I位点,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达了重组蛋白。Western-Blotting检测到在8mol/L尿素存在下,该重组蛋白与抗尿激酶的多克隆抗体之间仍有弱的结合反应。表达产物经变复性处理和部分分离纯化后,在纤维蛋白平板上表现有较好的纤溶活性,且这种活性是通过激活纤维蛋白溶酶原为纤溶酶而实现的。重组蛋白纤溶活性的比活达到17500IU/mg,较好地保留了尿激酶的纤溶活性,重组蛋白的产率约每100g湿菌为1.5mg。     

溶藻弧菌HY9901鞭毛蛋白flaC基因的克隆和序列分析及真核表达质粒的构建

参照GenBank上登录的副溶血弧菌鞭毛蛋白flaC基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaC全长基因,序列分析结果显示该基因为1 155 bp,编码384个氨基酸.与GenBank中其他弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaC基因与副溶血弧菌flaC基因的同源性最高(87%).将该基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,获得带溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因的真核表达重组质粒pcDNA-flaC,为其DNA疫苗的进一步研究奠定了基础.     

从噬菌体抗体库中淘选人绒毛膜促性腺激素的单链抗体

由鼠源噬菌体抗体库淘选到展示有人绒毛膜促性腺激素单链抗体的噬菌体克隆。用ELISA方法进行检测,从结合力最强的克隆中分离单链抗体基因,插入经改造的高效表达载体pET-21a(+)中,转化大肠杆菌,诱导表达。从培养基中可检测到可溶性抗人绒毛膜促性腺激素的单链抗体。     

密码子的碱基关联与表达增强网络

提出了基因表达水平与碱基顺序关系的表达增强网络（ＥＥＮ）模型，认为ＥＥＮ与编码区中密码子的某些特定位点相关联，这些位点称为ＥＥＮＳ．用统计分析的方法证实了ＥＥＮＳ的存在，并对Ｅ．ｃｏｌｉ和Ｙｅａｓｔ找出了这些位点．发现表达水平不仅与同义密码子的使用、且与密码子第１第２位点（特别是１位点）有关，因此Ｉｋｅｍｕｒａ的ｔＲＮＡ丰度说是不完全的。发现ＥＥＮ在编码区中可能具有很大的尺度，而不局限于相邻密码子，因此ｔＲＮＡ－ｔＲＮＡ相互作用说是不完全的．     

抗CPAα毒素单链抗体基因的克隆和表达及其生物学特性研究

应用RT—PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌 (CPA)α毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞中 ,扩增出单链抗体 (ScFv)基因 ,并将其定向克隆于表达载体 pHOG2 1中 ,构建重组表达载体 pHOG 2E3,转化至大肠杆菌XL1 Blue中 ,筛选出表达菌株XL1 Blue(pHOG 2E3)。SDS PAGE分析结果表明 ,在 2 0℃用IPTG诱导培养时 ,表达的ScFv蛋白占菌体总蛋白的 2 5 %,ScFv蛋白主要以包涵体的形式存在 ,但在胞周质和培养上清中也能检测到ScFv蛋白 ,其中在胞周质中表达的ScFv蛋白占菌体可溶性蛋白的 4 %。生物学试验结果表明 ,ScFv基因表达产物不仅能够中和α毒素的磷酯酶C活性 ,而且对攻击致死剂量α毒素的小鼠产生良好的被动保护作用     

大黄鱼Rnd1基因表达载体构建及表达模式分析

为探究Rnd1基因在大黄鱼免疫应答过程中的作用,采用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）对该基因的表达模式进行分析,同时构建原核表达载体pET-28a-Rnd1,并转化进大肠杆菌后诱导该蛋白的融合表达。研究结果表明:大黄鱼Rnd1基因ORF为699 bp,编码232个氨基酸;经序列多重比对和进化树构建发现,Rnd1的氨基酸序列高度保守;在健康大黄鱼的8个免疫组织中,Rnd1在肝脏中相对表达量最高,其次为脑,而在肠中表达量最低;变形假单胞菌攻毒后,Rnd1在肝脏中48 h时达到最高值,为对照组的25倍;在脾脏中则持续上调表达,尤其在48 h后升高更为明显。