抗人尿激酶单克隆抗体的制备

采用常规免疫和脾内免疫相结合的方法，利用杂交瘤技术得到两个能分泌抗人尿激酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株１０Ｈ１０，１０Ｄ１２。它们分泌的单克隆抗体主要识别Ｍｒ．５４，０００的高分子量尿激酶和Ｍｒ．１８，０００的尿激酶Ａ链。两种单克隆抗体与胰蛋白酶，胰蛋白酶原，胰凝乳蛋白酶和胰凝乳蛋白酶原等丝氨酸蛋白酶和酶原无交叉反应。     

抗人体乳腺癌单克隆抗体6C_6杂交瘤细胞株的建立

用乳腺癌患者的原发瘤组织制备的细胞膜抗原免疫BALB/C小鼠,取致敏脾脏细胞与SP_(2/0)骨髓瘤细胞融合。融合率为42％,经克隆化培养后得到一株分泌抗人体乳腺癌单克隆抗体杂交瘤细胞,命名为6C_6。其分泌的抗体和乳腺癌细胞系MCF-7呈阳性反应,与其它5种人癌细胞系,1种人正常细胞系及4种鼠类肿瘤细胞系呈阴性反应。免疫组织化学实验表明:6C_6单克隆抗体(简称6C_6McAb)与乳腺癌的反应多呈阳性(30/36),与7例正常乳腺均呈阴性反应。6C_6McAb类别为IgC_1。其抗体经ZetaPrep大容量离子交换圆盘纯化,对乳腺癌原发瘤组织仍具有较高的活性。     

沙丁胺醇单克隆抗体的研制及初步应用

用沙丁胺醇和牛血清白蛋白的人工偶联物SAL-BSA免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术建立3株分泌抗沙丁胺醇抗体的杂交瘤细胞株,并对抗体进行鉴定.结果表明,3株单克隆抗体对沙丁胺醇的半抑制率分别为1.41、5.53、9.62 ng/m L;单克隆抗体2F7与盐酸克伦特罗、马布特罗、特布他林的交叉率分别为217%、128%、70.5%,与莱克多巴胺、西马特罗、肾上腺素和去甲肾上腺素无交叉反应;3株单克隆抗体均为小鼠Ig G1亚类.用单克隆抗体2F7建立的胶体金免疫层析检测试纸条,对沙丁胺醇标准品的最低检出值达到3 ng/m L.制备的抗沙丁胺醇单克隆抗体有可能应用于沙丁胺醇残留快速检测试剂的研制.     

α-胰凝乳蛋白酶在不同介质中稳定性的研究

测定了α-胰凝乳蛋白酶在不同介质中的活性及稳定性。研究了有机溶剂性质、pH值、离子强度及离子类型对α-胰凝乳蛋白酶活性与稳定性的影响,并通过CD谱初步研究了α-胰凝乳蛋白酶在不同pH值缓冲液中的二级结构变化。研究结果表明,α-胰凝乳蛋白酶在某些有机溶剂中能在较长时间内维持较高的酶活性。α-胰凝乳蛋白酶在3种pH值不同的缓冲液中的CD谱表明其在pH＝10.0的稀溶液中的α-螺旋和（或）β-折叠含量较高。在不同pH值条件下,离子强度对α-胰凝乳蛋白酶的活性与稳定性的影响不同。     

硝基苯胺单克隆抗体的制备和效果评价

为了测定水中硝基苯胺类化合物,进而开发酶联免疫分析法(EL ISA)快速检测方法,制备了抗硝基苯胺单克隆抗体。以合成的硝基苯胺完全抗原,作为免疫原免疫B a lb/c小鼠,采用B细胞杂交瘤技术,经免疫、融合、筛选和克隆等,得到了抗硝基苯胺单克隆抗体。该抗体亚类为IgG1,制备的单克隆抗体腹水效果评价达10-7,与其他硝基苯胺结构类似物无交叉反应。实验结果表明,用本间接竞争EL ISA方法可以精确地检测不同水样中硝基苯胺残留。     

抗土霉素单克隆抗体的制备及其在虾中土霉素残留的检测应用

研究目的：抗土霉素单克隆抗体的制备和特性分析，并用于间接竞争酶联免疫吸附测定法（icELISA）分析虾样品中土霉素的残留。创新要点：本研究建立分泌抗土霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，筛选出对虾中土霉素残留检测具有较高灵敏度的单克隆抗体2．4F。研究方法：重要结论：用细胞杂交技术使土霉素．牛血清白蛋白偶联物免疫的BALC／c雌性小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，建立三株分泌抗土霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株（2—4F、7-3G和11-11A），并制备它们的单克隆抗体。通过ieELISA法分析单克隆抗体对土霉素的半抑制质量浓度（IC-50）和交叉反应率，明确其灵敏度和特异性。实验结果发现单克隆抗体2—4F具有最高的灵敏度，对土霉素的IC50为7．01ng／ml，且该单抗特异性强，仅与罗利环素之间有强烈的交叉反应，而与非相关抗生素不发生交叉反应。当利用单克隆抗体2-4F检测虾样品中的土霉素含量时，其批内和批间回收率分别为82％～118％和96％～113％，变异系数分别为3．9％～13．9％和5．5％～14．9％。因此，单克隆抗体2．4F可用于虾产品中土霉素残留分析试剂盒的开发。     

人乳腺癌细胞（MCF—7）相关抗原超微结构的定位观察

本文以二种免疫电镜法对人乳腺癌细胞系—MCF-7细胞肿瘤相关抗原进行定位观察: 1.直接免疫铁蛋白法。采用戊二醛二步结合法制备铁蛋白偶联人乳腺癌单克隆抗体6C_6B_1B_7A_(12)结合物,并以直接法对MCF-7细胞进行包埋前免疫染色。 2.间接免疫酶标电镜法。以6C_6B_1B_7A_(12)单克隆抗体为第一抗体,过氧化物酶标记兔抗小鼠IgG抗体的结合物为第二抗体对MCF-7细胞进行包埋前免疫染色。 电镜观察结果表明,该肿瘤相关抗原仅分布于MCF-7细胞表面。抗原的存在可能与细胞周期或细胞群体的变异性有关。     

褪黑素单克隆抗体的制备及鉴定

为了获得抗褪黑素(MT)高效价的单克隆抗体,用甲醛将MT连结到BSA上,然后用连结物背部皮下多点免疫Balb／c小鼠,用PEG诱导免疫鼠脾细胞与Sp2／0细胞融合,经ELISA法筛选阳性克隆株及测定效价,用抗体与同类物之间的交叉反应进行特异性鉴定．最后获得5株(4C9D7、3E12C7H11E7、3E12A9D7、6A6A3A2C3、1E1E2H2H6)能稳定分泌高效价抗MT的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞。     

单克隆抗本亲和层析法纯化人尿激酶

含抗人尿激酶单克隆抗本的腹水经ＰｒｏｔｅｉｎＡ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ４Ｂ纯化得到ＩｇＧ纯品，分子量为１５０ＫＤ，与ＣＮＢｒ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ偶联制成抗人尿激酶单克隆抗体－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析介质。     

卡那霉素单克隆抗体的研制及ELISA检测方法的建立

采用EDC法制备卡那霉素(KAN)完全抗原、卡那霉素-牛血清白蛋白(KAN-BSA)、卡那霉素-鸡卵清蛋白(KAN-OVA).用KAN-BSA完全抗原免疫BALB/c小鼠,并通过杂交瘤技术制备能够稳定分泌抗KAN单克隆抗体的杂交瘤细胞(1E1).通过体内诱生腹水大量制备单克隆抗体,鉴定1E1单克隆抗体,其效价为8×10~5,亲和力为2. 8×10~9L/mol,半数抑制浓度(IC50)为1. 09 ng/mL,与妥布霉素(TOB)的交叉反应率为53. 4%,与其他氨基糖苷类化合物没有交叉反应性.利用该单克隆抗体,建立KAN间接竞争酶联免疫吸附试验(ciELISA).ciELISA检测KAN在牛奶中的回收率为64. 4%～89. 6%,最低检测限为1. 92 ng/mL.     

抗CD71人-鼠嵌合抗体的制备及其诱导肿瘤细胞凋亡

目的 :研究在液氮中冻存 2年的转染瘤细胞株 (D2C)复苏后其分泌抗CD71人 -鼠嵌合抗体的特异性、分泌量及诱导肿瘤细胞凋亡的效应。方法 :用ELISA方法检测转染瘤细胞培养上清的抗体分泌量。经DEAE SephadexA 5 0离子交换法纯化产生的抗体 ,并采用SDS PAGE电泳鉴定 ;台盼蓝拒染法观察其对K5 6 2细胞生存的影响 ;细胞计数和MTT试验测定嵌合抗体及鼠源性抗体对K5 6 2细胞的作用 ;琼脂糖凝胶电泳和透射电镜观察K5 6 2细胞凋亡。结果 :Balb/c裸鼠腹腔接种转染瘤细胞后 ,每只裸鼠腹水量在 3～ 5mL。抗体经纯化 ,产量约为 1～ 2mg/mL腹水。经SDS PAGE电泳鉴定 ,在分子量 5 5kD和 2 7kD处 ,可见有抗体IgG重链和轻链的染色条带。抗CD71嵌合抗体及鼠源性抗CD71抗体均可抑制K5 6 2细胞的增殖作用 ,且二者抑制作用无显著性差异 (P >0 .0 5 )。经琼脂糖凝胶电泳和透射电镜观察分别可见抗体诱导的K5 6 2细胞DNA梯形条带和细胞凋亡的形态改变。结论 :液氮中冻存 2年的转染瘤细胞体外生长良好 ,抗体分泌稳定 ,特异性高 ,并可诱导K5 6 2人红白血病细胞凋亡     

单抗Fab片段与抗癌抗生素C1027偶联物对裸鼠移植人肝癌的治疗作用

抗人肝癌单抗3A5用氯化汞合木瓜蛋白酶消化,经SDS-PAGE、ELISA方法检测证实得到Fab活性片段。单抗3AS及Fab片段与抗癌抗生素C1027偶联,得到3A5-C1027和Fab-C1027偶联物。克隆生成测定对肝癌细胞具有极强的杀伤作用,C1027、3A5-C1027和Fab-C1027的IC50值分别为6.5 x10~(-16)、4.2×10~(-14)M和8.6×10~(-16) M。 Fab-C1027对人咽上皮癌细胞与靶细胞的杀伤活性相比,两者相差32倍,呈选择性杀伤作用。观察C1027、Fab-C1027对移植人肝癌裸鼠的治疗作用,其抑瘤率分别为59％和85％。在可耐受剂量下,C1027对人肝癌有明显的抑制作用,而Fab-C1027显示更强的抑制作用。     

尼罗罗非鱼IgM单抗的制备及IgM+B淋巴细胞吞噬能力的研究

采用免疫亲和层析方法纯化尼罗罗非鱼抗TNP特异性IgM，并以此为抗原免疫Babl/c小鼠进行单克隆抗体制备. 免疫的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合成杂交瘤细胞，利用酶联免疫吸附法、蛋白质印迹法(Western blot)和流式细胞术筛选获得两株抗IgM重链的单克隆抗体，分别命名为3B3和9D12. 纯化后的单克隆抗体3B3和9D12在1 mg/mL浓度下其抗体效价分别为740,741和359,712 units/mL. 利用制备的单抗结合激光共聚焦显微镜检测发现，膜结合型IgM位于B细胞膜表面(IgM+ B细胞). 流式细胞术检测尼罗罗非鱼IgM+ B细胞的免疫组织分布，发现IgM+ B细胞分布存在组织差异性，其中在外周血(PBL)所占比例最大，约为37.6%，其次是脾脏(SPL)，占百分比33.7%，头肾(AK)占比例约为23.9%，而后肾(PK)占比例约为20%. IgM+ B细胞荧光微球的吞噬能力分析发现，IgM+ B细胞对0.5 m的荧光微球吞噬能力强于1 m. 另外，IgM+ B细胞的吞噬能力存在免疫组织差异性，其中对于0.5 m荧光微球的吞噬，PBL明显高于其他组织，而AK IgM+ B细胞对1 m荧光微球的吞噬能力最强. 以上结果表明，本研究成功制备了鼠抗尼罗罗非鱼IgM单抗工具，并利用其IgM单抗发现IgM+ B细胞具有吞噬能力且其吞噬能力存在组织差异性，表明IgM+ B细胞在先天性免疫中可能发挥重要作用.     

抗爪蟾角蛋白单克隆抗体的研究

本实验以非洲爪蟾(Xenopus laevis)成体皮肤角蛋白免疫的BALB/c鼠脾细胞与小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞在PEG的作用下进行融合,经HAT选择培养、ELISA筛选、反复克隆化及冻存复苏,获得四株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。对其中一株杂交瘤细胞KD_(10)及其分泌的抗体进行了较全面的研究。     

抗人FXYD6单克隆抗体的制备及鉴定

制备了抗人FXYD6单克隆抗体,并进行初步鉴定.以FXYD6合成多肽作为免疫原,利用单克隆抗体杂交瘤技术建立阳性克隆细胞株;腹水诱导法制备抗人FXYD6单克隆抗体;蛋白A亲合层析法纯化;ELISA测定FXYD6单克隆抗体的特异性和效价;以所得特异性抗体为一抗,利用免疫组化法检测胰腺癌组织中FXYD6的表达.结果成功获得1株稳定分泌特异性抗人FXYD6单克隆抗体的杂交瘤细胞株;腹水诱导法生产抗人FXYD6单克隆抗体2.86 mg;FXYD6单克隆抗体可以与FXYD6合成多肽特异性结合,抗体效价1:5400;免疫组织化学显示胰腺癌组织中胞膜呈阳性染色.成功获得FXYD6单克隆抗体可以为进一步研究FXYD6的组织分布、生物学作用创造条件.     

新型嵌合补体抑制分子HCI-3的设计构建及真核细胞表达的研究

目的：基于抑制补体活化的两个关键环节，即C3／C5转化酶及MAC的形成，设计、构建及制备一种新型、高效的补体抑制剂．方法：首先设计引物，通过PCR技术扩增重组可溶性CD46／CD55／CD59嵌合分子cDNA片段，重组于pcDNA3．1( )真核表达载体上，构建兼有三分子功能的CD46／CD55／CD59嵌合补体抑制分子，命名为HCI-3(Human Chimeric Complement Inhibitor,HCI-3)．分别利用COS-7细胞和CHO细胞进行表达，并用抗人CDl6多抗及抗人CD55，CD59单抗对表达产物进行Western Blotting鉴定．结果：DNA测序结果证实，前端带有CD59信号肽序列，后端融合有编码6个组氨酸碱基的HCl-3 cDNA片段的阅读框完整．免疫印迹结果显示，表达的重组蛋白分别能与抗人CD46多克隆抗体和抗人CD55，CD59单抗结合．结论：成功构建并在真核细胞内表达了重组可溶性HCl-3分子，为进一步研制和开发新一代多功能、多靶点补体抑制剂奠定了基础．     

导向溶栓分子scFv-UK32中连接肽的引入和在昆虫细胞中的表达

为了提高重组导向溶栓分子scFv-UK32的溶纤活性,通过重组PCR方法在编码scFv与UK32的碱基之间引入编码KLGGGG连接肽的碱基序列,并克隆到转移载体pBacPAK9上,通过与线性病毒DNA BacPAK6/Bsu36I digest共转染到昆虫细胞Sf 9内,进行表达。表达产物分泌到上清中,共转染后第5d(天)用纤维平板法测得Sf 9细胞上清溶纤活性达到107 IU/mL,比未引入连接肽的scFv-UK32的表达活性(25 IU/mL)高。ELISA实验表明共转染上清具有明显对活化血小板特异结合能力。Western Blotting实验表明共转染上清可与Pro-UK的单抗特异结合。     

人型结核杆菌H_(37)Rv株菌体特异性抗原TB4单克隆抗体的纯化

采用硫酸铵法、辛酸二步法、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０ 离子交换柱层析法,从杂交瘤小鼠腹水中纯化人型结核杆菌Ｈ３７Ｒｖ 株特异性抗原ＴＢ４ 的单克隆抗体,从回收率、纯度和活性３ 个方面进行比较。结果显示,硫酸铵法回收率最高,层析法纯度最高,３ 种方法对单抗的活性均无大的影响。认为：辛酸二步法可有效地去除白蛋白,适用于大量腹水中单抗的提取、纯化,具有简单、省时等优点;柱层析法适用于小量腹水单抗纯化及分析用途     

抗人癌胚抗原单克隆抗体的研制及其在免疫组化中的应用

以高纯CEA为抗原,免疫BALB／c小鼠．取其脾细胞和小鼠SP2／0-Ag14骨髓瘤细胞融合．经2次亚克隆。建立3株稳定分泌抗CEA特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。应用经纯化的该单克隆抗体进行了结肠癌组织切片的免疫组织化学实验．结果显示全部3种抗CEA单克隆抗体对结肠癌亚细胞组分均呈现特异性结合。表明已筛选出适于制作癌胚抗原临床诊断试剂盒所需的特异性单克隆抗体。