功能型DNA重组修复蛋白质RecR的体内分布示踪

RecR是参与大肠杆菌（E．coli）同源重组的蛋白质,在真核生物中存在功能保守性组分．通过构建recR-yfP融合基因及其表达载体,对大肠杆菌菌体内RecR蛋白的分布情况进行了活体观察．显微镜观察结果表明,RecR蛋白一般在菌体的拟核区起作用．通过对比紫外线敏感性,Re—cR—YFP在重组质粒上提高了recR缺陷型大肠杆菌的抗紫外线能力,表明重组质粒表达的融合蛋白RecR—YFP具有生物活性,能够提高recR缺陷型大肠杆菌的存活率．     

RadA： A protein involved in DNA damage repair processes of Deinococcus radiodurans R1

RadA is highly conserved in bacteria and belongs to the RecA/RadA/Rad51 protein su-perfamily found in bacteria,archaea and eukarya. In Archaea,it plays a critical role in homologous re-combination process due to its RecA-like function. In Escherichia coli,it takes part in conjugational recom-bination and DNA repair but is not as important as that of archaea. Using PSI-BLAST searches,we found that Deinococcus radiodurans RadA had a higher similarity to that of bacteria than archaea and eukarya. Disruption of radA gene in D. radiodurans resulted in a modestly decreased resistance to gamma radiation and ultraviolet,but had no effect on the resistance to hydrogen peroxide. Complementa-tion of the radA disruptant by both E. coli radA and D. radiodurans radA could fully restore its resistance to gamma radiation and ultraviolet irradiation. Further domain function analyses of D. radiodurans RadA showed that the absence of the zinc finger domain resulted in a slightly more sensitive phenotype to gamma and UV radiation than that of the radA mutant,while the absence of the Lon protease domain exhib-ited a slightly increased resistance to gamma and UV radiation. These data suggest that D. radiodurans RadA does play an important role in the DNA damage repair processes and its three different domains have different functions.     

一种改良的DNA沉淀法在重组DNA转化大肠杆菌中的应用

以构建pUC18-EGFP载体为例,通过对DNA连接产物进行沉淀处理,对普通的DNA沉淀法进行了改良.实验证明,采用改良的DNA沉淀法处理后的连接产物,转化大肠杆菌的效率约是对照组的10倍,并且大肠杆菌感受态细胞用量减少到10μL.这一改良的DNA沉淀法用CaCl_2替代TE作为溶解沉淀DNA的溶剂,省略了用70%乙醇洗涤DNA沉淀的步骤,较普通的DNA沉淀法操作起来更为简便.     

同源重组在染色体DNA基因克隆中的应用方法

同源重组是生物界普遍存在的现象，从噬菌体、细菌到真核生物都有能发生同源重组的种类。如何把同源重组应用到基因克隆中成为近年来生物学家研究的热点。本文从宿主细胞的改造、重组功能的诱导、感受态细胞的制备、线性同源载体的获得及重组体的鉴定等几个方面具体叙述这种基因克隆的新方法，从分子水平上较为详尽地介绍了同源重组在染色体基因克隆中的应用、前景展望及存在的局限性。     

基于分子重组技术的DNA计算

DNA计算是计算科学和分子生物学相结合的新领域。目前关于DNA计算的研究主要是抽象的计算模型和简单的原理性试验。DNA剪接计算模型是以生物DNA分子重组技术为基础的文法系统。本文主要介绍DNA剪接计算模型的文法结构及计算方法,证明了DNA剪接模型可以计算所有图灵机可计算函数。     

不用接头进行异末端DNA重组的方法

用过渡载体通过两次重组进行不同粘性末端之间的ＤＮＡ重组。该方法不需要替换接头，从而省去昂贵的试剂和平末端连接这种较难的操作。即经济，简单又有效，易于操作。     

重组包涵体蛋白质复性

基因工程技术的发展掀开了人类生命科学研究的崭新篇章，开辟了现代生物工业发展的新纪元。重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了可能，E．coli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，是生产重组蛋白的首选表达系统。但外源基因在E．coli中的高表达常常导致包涵体的形成，如何高效地复性包涵体蛋白是基因工程技术面临的一个难题。随着人类基因组计划的完成和蛋白组计划的实施，人们将会更多地面临这一问题的挑战。     

DNA损伤修复研究的新进展及其重要意义

1953年沃森（Wotson）和克里克（Crick）提出DNA结构的双螺旋模型,使人类对生命遗传和变异的认识发生了质的飞跃。人们进而试图从分子水平上准确无误地复制出与母本完全一致的子代DNA双链。然而,DNA复制的精确性也是相对的。由于种种原因,任何生物的DNA在复制过程中其碱基都     

亮氨酸拉链结构蛋白在大肠杆菌重组子中的表达

酵母转录因子GCN4是通过亮氨酸拉链(bZIP)结构结合DNA的蛋白质之一，当GCN4二聚体与DNA结合时，亮氨酸拉链区的2个单体结合为平行的卷曲螺旋结构，而其基区由无规线团结构变为α螺旋．为探讨亮氨酸拉链蛋白与DNA的结合机理，设计了含有GCN4亮氨酸拉链蛋白基区结合DNA的必需氨基酸的折叠片段，并将其克隆到Escherichia coli BL21，讨论了此亮氨酸拉链蛋白的表达条件．在蛋白质的小量表达试验中，重组子Escherichia coli BL21于5mL含有50μg／mL氨节青霉素和34μg／mL氯霉素的LB液体培养基中培养至对数期，加入不同浓度的IPTG，继续培养以诱导蛋白质的表达，在不同的时间(如：诱导前，诱导2，4，6，8h)取样100μL到1．5mL离心管中、离心收集沉淀，将沉淀悬浮于样品缓冲液中，用10％SDS-PAGE检测；在10L含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中进行了大量表达，根据小量表达的试验结果确定了IPTG的浓度和诱导时间．结果表明：含有这种拉链蛋白质的重组子Escherichia coli BL21在37℃下小量培养时，0．1-0．8mmol的IPTG均可在2-10h内诱导该蛋白质表达；而大量培养时，0．2mmol和0．4mmol的IPTG在37℃均不可能诱导表达，只在28℃时才表达；小量培养和大量培养的最佳诱导时间为4-6h，诱导剂IPTG的浓度为0．2mmol，大量表达的温度为28℃而不是37℃．     

重组DNA技术在酿酒酵母遗传操作中的应用

在传统的食品和酿造工业中，酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）占有十分重要的地位。如今，这种简单的单细胞真核生物已成为遗传研究的一种模式。本文简要综述了重组DNA技术应用于酿酒酵母遗传操作的研究进展，并指出了重组DNA技术作为新的遗传操作的手段，其应用性明显优于经典的遗传操作方法.     

DNA损伤和修复的生物标记物的探讨

某些物理化学因子，如紫外线，电离辐射和化学诱变剂等，都有引起生物突变和致死的作用。这些物理化学因子均能作用于DNA，造成其结构和功能的破坏。熙而在一定条件下，生物泪L体能使其DNA的损伤得到修复。本文主要介绍几种修复系统和生物标记物。     

DNA碱基烷基化的损伤机理及修复研究

本文系统地综述了烷基化试剂对DNA碱基不同位点的修饰、由修饰而产生的DNA损伤机理及相应的修复过程。     

含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的家蚕同源重组质粒载体的构建

以含家蚕丝心蛋白重链基因同源片段的质粒pG350为出发质粒，插入增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因，构建成以EGFP为报告基因的同源重组质粒载体pMD-Fib-IE-EGFP，通过PCR及酶切鉴定表明EGFP以正确的方式插入到原始质粒中，通过脂质体介导法转染胃癌细胞能发出很强的绿色荧光，表明该质粒能够在真核细胞中表达，为进一步建立完善的家蚕转基因系统平台提供基因材料。     

GFP标记的GDNF重组腺病毒载体的构建和体内外表达

通过构建绿色荧光蛋白(GFP)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)共表达的腺病毒载体,讨论其在治疗脊髓和脑有关神经系统疾病的潜在应用价值,了解腺病毒载体在大鼠体内的分布及在体外分泌外源基因产物能力,并对其生物安全性作了初步考察,为GDNF重组腺病毒载体在临床和基础研究中的应用作了一定准备．     

蜀本草多糖对植物DNA损伤的修复

研究蜀本草多糖对植物DNA损伤的修复作用,以蜀本草为原料,通过热水提法提取蜀本草多糖。经过浓缩、脱色、脱蛋白获得蜀本草多糖粗品。用不同浓度重金属溶液处理生长中的蚕豆幼苗,72 h后通过单细胞凝胶电泳检测蚕豆幼苗DNA损伤情况;采用不同浓度的蜀本草粗多糖溶液培养受损的蚕豆幼苗,检测其对蚕豆幼苗DNA损伤的修复作用。结果:20μmol CuSO_4对蚕豆幼苗叶片细胞诱导出了明显的DNA迁移。用蜀本草多糖溶液培养此浓度CuSO_4胁迫受损的蚕豆幼苗,其DNA受损情况得到一定改善,当蜀本草多糖浓度为200μmol时,彗星图像尾部明显缩短,修复效果明显。蜀本草多糖对植物DNA损伤修复存在一定的作用,但其作用的具体机制需要更进一步研究。     

基因组DNA编码的蛋白质中氨基酸分布的分析

各种蛋白质中氨基酸残基的组成是由编码该蛋白质的结构基因的序列决定的,分析这些序列中有义密码子使用频率,就可以看出蛋白质的氨基酸组成情况。我们利用文献中90种生物的11415个基因中有义密码子使用频率,统计出了每种氨基酸在该种生物基因组DNA编码的蛋白质中的相对丰度。把这些丰度值按(1)90种生物,(2)真核生物33种,(3)原核生物27种(包括F质粒、Ti质粒、转座子各1种),(4)病毒类24种(含噬菌体6种),(5)细胞器(叶绿体5种和线粒体1     

一种酿酒酵母同源重组载体的筛选

将携有mTn-3xHA／LacZ转座子的酿酒酵母文库质粒pHSS6转化大肠杆菌DH5α,挑取单菌落并提取其质粒．将纯化质粒分别用Not Ⅰ酶切后,转化尿嘧啶缺陷型(ura^-)酿酒酵母菌株INVScl,使其同源重组到酿酒酵母基因组中,于SC／ura^-平板上筛选．取长有单菌落酵母的平板进一步筛选重组后上游有强启动子酿酒酵母文库质粒,用近300个质粒转化酵母菌株INVScl,最终得到2株前端有强启动子的酿酒酵母质粒,这2个质粒可作为酿酒酵母同源重组载体广泛应用．     

人同源异型框Csx及其变体的克隆、在大肠杆菌中的表达及其DNA结合性能研究

人心脏同源异型框基因Csx是同源异型框基因家族NK2的成员之一，也是心脏早期发育必须的转录因子之一。虽然目前关于Csx基因在发育中的作用及其与先天性心脏病的关系得到了广泛的关注，并研究得较为深入，然而Csx本身的结构与功能的关系仍不十分清楚，Csx包含了3个保守的结构域：TN结构域、同源异型框结构域和NK2-SD结构域。通过选择合适的酶切位点，构建了Csx的5个变体，分别缺失了不同的结构域，并将Csx及这5个变体克隆到pFT32系列载体中，将这6个构建好的质粒转化E．coli BL21(EE3)，在IPTG的诱导下，得到了Csx基因及5个变体在大肠杆菌中的可溶性表达．凝胶阻滞实验显示：同源异型框是Gx与DNA相互作用的区域，缺失了同源异型框结构域，Csx就无法和靶序列结合．其它结构域的缺失对Csx和其靶DNA序列的结合影响不大。     

一种少量λ噬菌体重组DNA的快速抽提方法

用DEAE-纤维素(二乙氨乙基纤维素)和聚乙二醇(PEG 6000)纯化的体外重组λ噬菌体,经SDS(十二烷基磺酸钠)裂解和酚/氯仿抽提等处理,得到了重组DNA。该DNA纯度高,适用于限制性内切酶分析。     

温度对重组大肠杆菌生长及外源蛋白表达的影响

对重组大肠杆菌（E.coli）BL21（DE3）发酵生产rhCu/Zn-SOD的诱导温度进行了优化，考察了37℃和30℃下重组菌的生长规律及产物表达。在5L自控发酵罐中的发酵结果表明：较低温度时菌体的比生长速率较低，菌体活性与质粒稳定性有很大程度的改善，外源蛋白稳定性与可溶性也有一定的提高；30℃诱导时rhCu/Zn-SOD的酶活性最高，每毫升发酵液的酶活力为4757U，约为37℃诱导时的2.7倍。