巴西固氮螺菌NifA与PⅡ蛋白之间的相互作用

利用酵母双杂合系统研究了巴西固氮螺菌(Azospirillum brasielense)NifA与P_Ⅱ蛋白之间的相互作用. 结果表明: P_Ⅱ蛋白能和完整NifA蛋白自身或其N-端结构域特异结合, 不能与NifA的中间或C-端结构域相互作用; 与P_Ⅱ 蛋白高度同源的Pz蛋白(即GlnK)也不能与NifA结合. 将编码P_Ⅱ蛋白的glnB基因进行移码突变后, 突变的P_Ⅱ蛋白失去了与NifA蛋白结合的功能. 这说明NifA确实可与P_Ⅱ蛋白特异地结合, 但它们之间相互作用的机制尚待进一步研究分析.     

巴西固氮螺菌NifA与PⅡ蛋白之间的相互作用

利用酵母双杂合系统研究了巴西固氮螺菌（Azospirillum brasielense）NifA与PⅡ蛋白之间的相互作用。结果表明：PⅡ蛋白能和完整NifA蛋白自身或其N－端结构域特异结合，不能与NifA的中间或C－端结构域相互作用；与PⅡ蛋白高度同源的Pz蛋白（即GlnK）也不能与NifA结合。将编码PⅡ蛋白的glnB基因进行移码突变后，突变的PⅡ蛋白失去了与NifA蛋白结合的功能。这说明NifA确实可与PⅡ蛋白特异地结合，但它们之间相互作用的机制尚待进一步研究分析。     

过氧化氢抑制蓝光诱导的14-3-3蛋白与向光素的结合

向光素(phototropins)是继光敏色素(phytochro- mes)[1,2]、隐花色素(cryptochromes)[3,4]之后发现的一种蓝光受体. 该受体蛋白含有2个重要的功能区: (ⅰ) 具有能与FMN结合的位于N端的2个LOV(light, oxygen, voltage), 即LOV1和LOV2, 该功能区与对光照、氧气及电压差敏感的一大类蛋白在序列上相似[5]; (ⅱ) 位于C末端的Ser/Thr蛋白激酶区域[6]. 目前, 愈来愈多的研究表明, 向光素在植物气孔开放[7]、向光性反应[6,8]、叶绿体移动反应[9,10]和弱光下植物生长[11]等过程中起重要的调节作用. 向光素作为一个自身磷酸化的Ser/Thr蛋白激酶受体, 可被蓝光诱导磷酸化, 继而和14-3-3蛋白结合, 启动一系列蓝光介导的信号转导过程[12]. 但其具体的信号转导细节及调节机制还很不清楚........     

PAS结构域介导Org35蛋白与NifA之间相互作用

在巴西固氮螺菌中, 氧和铵是调节固氮基因表达的主要环境因子, 即高浓度的氧和铵抑制固氮作用. NifA蛋白(nifA基因的产物)是所有固氮基因(nif基因)的转录激活蛋白. 目前, 在该菌中, 氧和铵对NifA蛋白的表达和活性的调节机制仍然不清楚. 本研究从巴西固氮螺菌中克隆到编码含有PAS结构域蛋白的org35全基因, 将根据org35的核苷酸序列推测的Org35蛋白氨基酸序列在NCBI网上进行同源性比较, 结果表明, Org35蛋白属于杂合双组分调节系统, 包括3个结构域, 即N-端PAS结构、中间组氨酸激酶结构域(HPK)和C-端响应调节蛋白结构域(RR). 并通过酵母双杂交系统证明了Org35蛋白与NifA蛋白之间的相互作用是由PAS结构域介导的.     

Na~ /H~ 逆向转运蛋白NhaH短的C末端亲水域介导盐抗性和pH感应

Na /H 逆向转运蛋白在维持细胞质低的Na 浓度和pH稳态等生命活动过程中扮演重要角色,然而,到目前为止,对原核微生物Na /H 逆向转运蛋白的C末端亲水域的结构和功能还知之甚少.我们曾从达坂喜盐芽孢杆菌(Halobacillus dabanensis)D-8菌株中克隆得到第一个中度嗜盐菌来源的Na /H 逆向转运蛋白基因nhaH.疏水性分析表明,NhaH的C末端亲水域只包含9个氨基酸残基(395PLIKKLGMI403),大大短于与之高度同源的SynNhaP1和ApNhaP的C末端亲水域.本研究采用PCR方法,构建NhaH蛋白的C末端亲水域缺失突变体nhaH-C.耐盐性实验表明,C末端亲水域的缺失显著地抑制大肠杆菌缺陷株KNabc的互补能力.基于荧光强度的翻转膜活性测定结果显示,NhaH?C的Na /H 和Li /H 逆向转运蛋白活性显著低于NhaH,而且前者的Na /H 逆向转运蛋白活性向酸端偏移,表明Na /H 逆向转运蛋白NhaH短的C末端亲水域在阳离子结合、转运和pH感应上起重要作用.     

蛋白质翻译后修饰在蛋白质-蛋白质相互作用中的调控作用

蛋白质-蛋白质相互作用是蛋白质发挥功能的主要机制之一,在DNA损伤修复、自噬和代谢等过程中都扮演着非常重要的角色,蛋白相互作用异常便会导致肿瘤等疾病的发生.在蛋白质的赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸等氨基酸残基上,可发生甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等200多种翻译后修饰,这些修饰通常能改变蛋白质的电性、疏水性和空间结构等属性,为与之结合的蛋白提供结合的锚定或产生位阻效应,像一把开关在时空上精确调控蛋白质-蛋白质相互作用的发生以及动态变化.结构研究表明,蛋白质之间的相互作用通常由临近的几个氨基酸残基直接结合,替换该区域的氨基酸残基,通常能破坏结合,使其失去部分功能或酶活性,可以针对性地开发和设计抑制剂或激活剂,用于肿瘤等疾病的治疗.本文简要介绍了蛋白质翻译后修饰在蛋白质-蛋白质相互作用中的调控作用,以及发挥的重要生理功能.     

2’,3’-双脱氧-3’-叠氮-5-甲基-2-N-烷基异胞苷的合成及抗HIV-1活性

自2′,3′-双脱氧-3′-叠氮胸苷(简称AZT(1))作为艾滋病的第一个治疗剂在80年代初在美国面世以来,为了提高它的疗效,改善它的毒副作用,各国化学家和药学家合成并评价了它的许多衍生物和类似物.我们从1989年开始,以AZT.为原料,制备了一系列2′,3′-双脱氧-3′-叠氮-5-甲基-2-N-烷基异胞苷(4a—f),并以AZT为对照化合物,在HIV-1感染的MT4细胞株上观察了它们的抗HIV-1活性.本文报道我们的研究结果.     

一种新的有机磷降解酶基因ophc2的克隆与表达

将来源于假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的有机磷降解酶OPHC2进行了N端及内肽的氨基酸序列测定, 根据得到的氨基酸序列设计合成了简并引物, 通过PCR和反向PCR从Pseudomonas pseudoalcaligenes中克隆出有机磷降解酶基因ophc2. 编码基因全长975 bp, (G+C)含量为63%, 有一个可读框, 编码324个氨基酸, 酶蛋白理论分子量为36 kD. 编码基因的核苷酸序列分析表明,与目前发表的有机磷降解酶基因相比同源性很低, 最高的只有46.4%, 说明这是一个新的有机磷降解酶基因. 将克隆得到的带有信号肽编码序列的和不带信号肽编码序列的有机磷降解酶基因, 分别与载体pET-30a构建重组表达质粒, 得到的表达产物具有正常的生物学活性.     

T-DNA插入稻瘟病菌Gγ亚基基因启动子的突变体A1-412丧失形成附着胞、穿透和致病能力

用TAIL-PCR的方法获得了A1-412突变体的T-DNA侧翼基因组序列, 测序结果表明, 外源T-DNA插入到稻瘟病菌G蛋白γ亚基基因MGG1 (Magnaporthe grisea G protein Gamma亚基)的启动子区域. MGG1编码93个氨基酸, 具有典型的G蛋白γ亚基结构域(GGL)和C末端CAAX框, 并与其他丝状真菌G蛋白γ亚基有较高的一致性. 外加cAMP能诱导部分A1-412分生孢子形成附着胞, 但这些附着胞的形态不正常, 不能穿透洋葱内表皮或水稻叶片. 另外, A1-412与相对应交配型的菌株杂交时几乎不产生子囊壳. 将MGG1基因重新导入A1-412突变体可部分恢复上述表型. 这些结果表明, G蛋白γ亚基MGG1可能涉及稻瘟病菌形态分化、有性生殖、致病性等方面的调节作用.     

Nelin的肌动蛋白结合特性及与其相互作用蛋白质的筛选

为了研究人新基因nelin及其心肌表达产物Nelin蛋白的生物特性, 并寻找能够与其发生相互作用的蛋白质, 对Nelin蛋白的全长及其部分结构域进行了肌动蛋白结合共沉淀实验, 并在真核细胞内进行了免疫荧光共定位实验. 结果发现, 在体外共沉淀和细胞内共定位实验中Nelin均表现出同肌动蛋白相结合的能力. 进一步采用酵母双杂交的方法将Nelin与人心脏cDNA文库进行杂交筛选, 得到了3个阳性克隆分别为细丝蛋白(Filamin)C亚型、肌联蛋白(Titin)N2B亚型和α胰蛋白酶抑制物重链前体 (ITIH). 通过免疫共沉淀实验, 验证了Nelin能够同Filamin的羧基末端免疫球蛋白样结构发生相互作用. 通过上述实验证明了Nelin为一个新的肌动蛋白结合蛋白, 并且能够同Filamin相结合. 由此推论新基因nelin的心肌表达产物Nelin是一个细胞骨架相关蛋白并且很可能作为一个膜-细胞骨架连接蛋白, 起到了参与细胞黏着斑形成的过程.     

Nelin的肌动蛋白结合特性及与其相互作用

为了研究人新基因nelin及其心肌表达产物Nelin蛋白的生物特性, 并寻找能够与其发生相互作用的蛋白质, 对Nelin蛋白的全长及其部分结构域进行了肌动蛋白结合共沉淀实验, 并在真核细胞内进行了免疫荧光共定位实验. 结果发现, 在体外共沉淀和细胞内共定位实验中Nelin均表现出同肌动蛋白相结合的能力. 进一步采用酵母双杂交的方法将Nelin与人心脏cDNA文库进行杂交筛选, 得到了3个阳性克隆分别为细丝蛋白(Filamin)C亚型、肌联蛋白(Titin)N2B亚型和a胰蛋白酶抑制物重链前体 (ITIH). 通过免疫共沉淀实验, 验证了Nelin能够同Filamin的羧基末端免疫球蛋白样结构发生相互作用. 通过上述实验证明了Nelin为一个新的肌动蛋白结合蛋白, 并且能够同Filamin相结合. 由此推论新基因nelin的心肌表达产物Nelin是一个细胞骨架相关蛋白并且很可能作为一个膜-细胞骨架连接蛋白, 起到了参与细胞黏着斑形成的过程.     

一种新的微管相关蛋白JWA对细胞内氨基酸平衡有重要调节作用

探讨了JWA蛋白在细胞内的确切定位、与微管蛋白的相互关系及对细胞内氨基酸平衡的调节作用. 应用4~37℃(微管解聚-聚合)交替作用法提取纯化大鼠脑组织中微管及其相关蛋白; 用免疫共沉淀法研究JWA蛋白与微管蛋白的相互作用; 应用基因转染和免疫荧光等实验方法研究低温(4℃)、秋水仙素(1 × 10^-5, 5 × 10^-5 mol/L)等处理的HBE细胞/ NIH3T3细胞中JWA和微管的动态变化及相互关系. 应用反义寡核苷酸技术结合氨基酸分析技术探讨JWA蛋白对PC12细胞内氨基酸平衡的调节作用. 结果表明, JWA蛋白是一种新的微管相关蛋白, 与微管蛋白分布基本平行, 在绝大多数情况下伴随微管动力学改变(聚合或解聚)而同步发生变化, 并且可能参与了细胞有丝分裂的过程. JWA蛋白是细胞内氨基酸总量的一种重要负性调节蛋白, 并选择性地调节细胞内谷氨酸和牛磺酸含量.     

苜蓿膜联蛋白MtAnn3基因的鉴定及其在根毛发育中的功能

通过5′RACE扩增了苜蓿膜联蛋白MtAnn3基因cDNA的5′末端序列.典型的膜联蛋白由一个N端结构域和一个C端保守的核心结构域组成,核心结构域一般含有4或8个由70个氨基酸组成的重复单元,而MtAnn3蛋白的核心结构域仅有1个重复单元.在洋葱表皮细胞中瞬时表达MtAnn3蛋白,揭示其具有细胞膜结合的特性.借助农杆菌介导的苜蓿转化实验表明,过表达MtAnn3的根部在不含Ca2+的培养基上生长,改变了根毛的极性,根毛顶端膨大变形,有时出现分叉现象.在农杆菌介导的MtAnn3启动子-GUS实验中,外源植物细胞分裂素可以诱导MtAnn3启动子的增强表达;接种苜蓿中华根瘤菌进行结瘤实验,启动子在根瘤原基和幼嫩根瘤中有较强的活性,而在成熟根瘤中活性较低,在衰老的根瘤中检测不到启动子活性.虽然MtAnn3在根瘤中的表达具有一定的时序性,它却不是瘤特异性的,它在苜蓿的根、茎、叶中都有高水平的转录表达.     

Na+/H+逆向转运蛋白NhaH短的C末端亲水域介导盐抗性和pH感应

Na⁺/H⁺逆向转运蛋白在维持细胞质低的Na+浓度和pH稳态等生命活动过程中扮演重要角色, 然而, 到目前为止, 对原核微生物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的C末端亲水域的结构和功能还知之甚少. 我们曾从达坂喜盐芽孢杆菌(Halobacillus dabanensis) D-8菌株中克隆得到第一个中度嗜盐菌来源的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因nhaH. 疏水性分析表明, NhaH的C末端亲水域只包含9个氨基酸残基(³⁹⁵PLIKKLGMI⁴⁰³), 大大短于与之高度同源的SynNhaP1和ApNhaP的C末端亲水域. 本研究采用PCR方法, 构建NhaH蛋白的C末端亲水域缺失突变体nhaHΔC. 耐盐性实验表明, C末端亲水域的缺失显著地抑制大肠杆菌缺陷株KNabc的互补能力. 基于荧光强度的翻转膜活性测定结果显示, NhaHΔC的Na⁺/H⁺和Li⁺/H⁺逆向转运蛋白活性显著低于NhaH, 而且前者的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白活性向酸端偏移, 表明Na⁺/H⁺逆向转运蛋白NhaH短的C末端亲水域在阳离子结合、转运和pH感应上起重要作用.     

海岛棉GbKTN1对酵母细胞伸长的影响

用5′RACE/3′RACE从海岛棉(Gossypium barbadense)开花后10 d的纤维细胞中分离获得了GbKTN1 cDNA序列, 全长2006 bp, 包括113 bp的5′非翻译区、1563 bp的可读框及327 bp的3′非翻译区(不包括终止密码子TAA). 可读框编码521个氨基酸, 蛋白质分子量约为55 kD, 靠近GbKTN1 C末端的233~414 氨基酸残基间包含一个ATP结合功能区. Southern杂交证明, GbKTN1在海岛棉基因组中以单拷贝形式存在. 半定量RT-PCR结合Southern杂交分析表明, GbKTN1在海岛棉根、茎、叶及纤维细胞中均有表达, 以纤维细胞中的表达最高, 叶中最低. 利用裂殖酵母系统, 初步分析了GbKTN1对细胞伸长的功能, 发现该基因在酵母细胞中诱导表达后使细胞显著伸长, 平均为诱导前的2.18倍, 部分细胞呈不规则形状, 这是首次在活体(in vivo)中证明KTN1与细胞的伸长有关.     

荧光假单胞菌G2-EPSP合酶的拆分和intein介导的活性恢复

利用GPS-LS接点扫描系统, 在荧光假单胞菌G2的5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶编码基因aroA中随机插入15 bp (即编码5个氨基酸短肽)的外源片段, 建立含一系列不同插入位点的aroA突变体库. 利用内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER2799对突变体库进行功能互补筛选, 测序后确定了12个可以忍受5个氨基酸插入的位点, 其中位点F295/T296经Ssp DnaE内含肽(intein)介导的蛋白互补技术鉴定为可拆分和蛋白重建的位点. 从位点F295/T296将G2-EPSPS基因一分而二, N-端和C-端片段分别连接在携带Ssp DnaE 内含子元件的原核表达双质粒上, 获得共转化质粒pMEPSN295IN和pKEPSC296IC. 将质粒pMEPSN295IN和pKEPSC296IC分别或共转化内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER2799中, 携带共转化质粒的重组子能够在M9限制性培养基生长, 而携带单一质粒的不能生长, 表明从位点F295/T296拆分的aroA基因在内含肽介导下实现了蛋白重建, 在突变株ER2799中恢复了5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶活性, 酶活水平达到野生型的62.92%,为4.48 U/mg.     

拟南芥QRAP2基因的克隆、表达、DNA结合能力及体外转录活性分析

通过对拟南芥ATH1基因芯片数据的分析, 从拟南芥中鉴定到一个受干旱胁迫高水平诱导的cDNA片段, 并用RACE方法获得了其全长cDNA. PCR及定量实时PCR分析表明, 该基因在经干旱、紫外线照射、脱落酸、高盐以及水杨酸等胁迫条件处理后表达量均有显著提高, 特别是干旱处理后短时间内表达量迅速提高, 3 h后即提高到对照样品的430多倍. 通过多序列比对和系统进化分析, 我们将该基因归于DREB亚家族. 由于该基因编码蛋白含有典型的AP2/EREBP DNA结合结构域, 并在N端有一段富含谷氨酰氨残基的区域, 所以将它命名为QRAP2 (Glutamine-rich AP2). 凝胶阻滞实验结果显示, QRAP2蛋白能够特异结合DRE顺式元件序列但不能与mDRE和GCC等非相关元件结合. 酵母单杂交实验表明, QRAP2蛋白全长序列或其N端112个氨基酸与GAL4 DNA结合结构域形成的融合蛋白表现出转录激活功能, 而其C端135个氨基酸与GAL4 DNA结合结构域的融合蛋白则没有表现出转录激活活性. 现有资料的分析表明, QRAP2是AP2/EREBP转录因子家族的新成员, 可能在干旱胁迫条件下参与激活相关下游基因的表达.     

C_4H_4Y(Y=O,S)与LiCH_3分子间锂键相互作用的密度泛函理论及二级微扰理论研究

在DFT-B3LYP/6-311 G**水平上求得C4H4Y---LiCH3锂键复合物势能面上的3个稳定构型,频率分析表明,复合物中C10-Li14在键长增大的情况下发生了反常的伸缩振动频率蓝移.经MP2/6-311 G**水平计算,在3个复合物中,含基组重叠误差(BSSE)及零点振动能(ZEP)校正的单体间相互作用能分别为?45.75,?35.70和?39.10kJ.mol?1.自然键轨道理论(NBO)分析表明,C4H4O和LiCH3间可以分别形成n-σ和π-s型两种锂键复合物(复合物Ⅰ和复合物Ⅱ),而C4H4S和LiCH3间形成的复合物Ⅲ中同时具有π-s和n-s型的锂键相互作用.另外,分子中原子理论(AIM)分析也表明,3种复合物中均存在分子间锂键弱相互作用.     

拟南芥液泡膜水孔蛋白的互作蛋白AtSM34 参与种子萌发的渗透胁迫响应

水孔蛋白(aquaporin, AQP)广泛参与植物的各种生理活动, 但还有许多调控机制未被发现. 为进一步对其调控因子进行研究, 运用酵母双杂交筛选拟南芥液泡膜水孔蛋白TIP1;1(tonoplast intrinsic protein, TIP)的互作子, 这是拟南芥中第一个被发现的液泡膜上具有高度水转运活性的蛋白. 以AtTIP1;1 为诱饵, 筛选得到一个新的TIPs 结合蛋白, 并在酵母和植物细胞中验证了这种结合. 该蛋白被命名为AtSM34, 编码一个含309 个氨基酸的多肽, 预测分子量为34 kD, 具有1 个单独的MYB/SANT 样结构域. AtSM34 启动子融合GUS 组织化学染色分析显示, 其表达主要位于花、茎和叶中, 尤其是维管束组织, 并且响应渗透胁迫. AtSM34 定位于内质网, 截断分析显示其N 端(1~83 位氨基酸)对于其定位至关重要. 过表达AtSM34 导致转基因植物对外源甘露醇、山梨醇及脱落酸更加敏感, 表现为萌发延迟. 进一步研究发现,AtSM34 也可与AtTIP1;2 和AtTIP2;1 结合, 这2 个TIP 蛋白对液泡渗透调节发挥着重要作用,并在种子萌发阶段大量表达. 这暗示着AtSM34 可能通过影响水孔蛋白基因的表达, 参与种子萌发早期阶段的渗透胁迫响应.     

大豆疫霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因在病原物植物互作中诱导表达及其抗氧化作用在酵母遗传互补系统中的功能验证

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)是真核生物细胞中一类功能丰富的蛋白质. 采用抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)的方法, 筛选到一个在大豆疫霉侵染早期上调表达的、编码GAPDH的cDNA片段; 克隆了该基因的全长序列, 命名为PsGapdh. Southern杂交结果显示, PsGapdh在大豆疫霉基因组中含有3个拷贝. 该基因编码的氨基酸序列具有GAPDH的保守结构域. 在系统发育树中, PsGAPDH与两性绵霉(Achlya bisexualis)的GapC1同源性最高、与中华盒形藻(Odontella sinensis)和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的GapC2同源性较高, 三者聚类分布于GapC亚族的C-Ⅱ分支. RT-PCR分析表明, 该基因在大豆疫霉侵染早期转录水平提高. 该基因可以恢复酵母突变体Δtdh1对H₂O₂的耐受性. 上述结果提示, 大豆疫霉的甘油醛-3-磷酸脱氢酶具有与酵母tdh1相似的抗氧化作用, 且参与了大豆疫霉对寄主植物的侵染过程.