形成多角体家蚕重组病毒通用转移载体构建

从家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）通用转称载体ｐＢＫ２８３和粉纹夜蛾核型多角体病毒（ＴｎＮＰＶ）转移载体ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３系列出发，构建了一个７．２ｋｂ能形成多角体且可以用于克隆含不同读码框外源基因的ＢｍＮＰＶ通用转移载体系列ｐＢＭＸ３．ｐＢＭＸ３系列以ＢｍＮＰＶ多角体结构基因上游的１．９ｋｂ和下游１．３ｋｂ的片段作为与ＢｍＮＰＶ基因组进行体内同源重组的同源序列；ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３系列的ＳＸＩＶ双启动子用于外源基因的表达；ＡｃＮＰＶ的多角体基因作为重组病毒形成多角体的基因．以ＢｍＮＰＶ－ＬａｃＺ（ｏｃｃ－ｇａｌ＋）为出发株病毒，ｐＢＭＸ３系列的重组病毒筛选有ｏｃｃ＋和ｇａｌ－两个遗传标记     

在大肠杆菌中利用反义RNA抑制乙肝病毒（HBV）X基因的表达

将乙肝病毒（ＨＢＶ）ａｙｗ株完整的Ｘ基因正向重组到原核表达质粒ｐＢＶ－２２１的ＰＬ启动子下游，得到能表达Ｘ蛋白的重组质粒ｐＢＶ－ＨＢＶ（＋）；同时将Ｘ基因反向重组到原核表达质粒ｐＢＶ－２２０的ＰＬ启动子下游，得到能转录Ｘ基因反义ＲＮＡ的重组质粒ｐＢＶ－ＨＢＸ（－）。利用这两个质粒，构建出能同时转录Ｘ基因ｍＲＮＡ和反义ＲＮＡ的重组质粒ｐＥＸ。ＡＮ－ＨＢＸ，并在原核水平上，证实了反义ＲＮＡ对Ｘ基因的表     

抗牛免疫缺陷病毒（BIV）穿膜蛋白gp45杂交瘤细胞株的建立

编码牛免疫缺陷病毒（ＢＩＶ）穿膜蛋白的一个４００ｂｐ的基因片断被克隆到ｐＡＴＨ表达载体上，此 重组的融合蛋白ＴｒｐＥ－Ｅｎｖ８在大肠杆菌中得到高效表达，而且包含有与ＢＩＶ抗体特异性反应的抗原决定簇。我们用此融合蛋白免疫ｂａｌｂ／ｃ小鼠得到与ＢＩＶ穿膜蛋白特异性反应的杂交瘤。此单克隆抗体在蛋白印迹法分析中与重组的ＴｒｐＥ－Ｅｎｖ８有特异性反应，用免疫酶染色法可检测ＢＩＶ在体外的复制。     

人胰岛素样生长因子—Ⅰ的基因克隆,融合表达及产物纯化

利用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）方法,以ＩＧＦ－ＩｃＤＮＡ为模板,扩增ＩＧＦ－Ｉ的基因。在序列测定确证后,将其定向克隆到载体ｐＥｘＳｅｃＩ上,构建了ＩＧＦ－Ｉ融合表达载体ｐＥｘＩＧＦ,经ＩＰＴＧ诱导表达后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明：含有重组表达质粒的菌株可表达出约３２．５８％的２６ＫＤ融合蛋白,且主要以可溶性形式存在。经ＩｇＧ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析一步纯化后,可获得纯度约９０％的融合蛋白,经Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ分析,免疫学活性呈阳性反应。     

BIV－LTR中存在负调控区

为研究ＢＩＶ－ＬＴＲ调控序列的功能，将ＬＴＲ部分ＤＮＡ序列缺失，与荧光素酶基因相连构建质粒ｐＤ－３１９－Ｌｕｃ，ｐＤ－２６１－Ｌｕｃ，ｐＤ－１８１－Ｌｕｃ，ｐＤ－２－Ｌｕｃ，ｐＤ＋３２－Ｌｕｃ，ｐＤ－３１９－２６１－Ｌｕｃ，ｐＤ－１８１＋３２－Ｌｕｃ．通过磷酸钙共沉淀法将上述质粒及ｐＢＬＴＲ－Ｌｕｃ分别转染小牛肺细胞（ＦＢＬ），检测转染细胞裂解物荧光素酶活性，比较各质粒所克隆的ＢＩＶ－ＬＴＲ表达水平，发现－２６１位上游区存在负调控区，Ｒ区存在抑制ＬＴＲ表达的序列．     

具全期启动子盒的杆状病毒高效表达载体的组建与应用

通过ＰＣＲ扩增，得到苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａＮｕｃｌｅａｒＰｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓＶｉｒｕｓ，ＡｃＮＰＶ）具早晚期启动子元件的ｐ３５基因启动子，将其插入到杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３多克隆位点上游，使之与ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３质粒中的人工合成后期启动子（ＰＳｙｎ）、多角体ＸＩＶ启动子（ＰＸＩＶ）串联构成早期、晚期、极晚期能持续启动外源基因表达的转移载体质粒ｐＳＸ３５．将ｐＳＸ３５用于组建含ＨＢｓＡｇ基因并形成多角体的重组ＴｎＮＰＶ，ＨＢ－ｓＡｇ基因的表达量显著提高，表达时间亦明显提前，从而实现了外源基因在杆状病毒表达系统的全期、高效表达．ｍＲＮＡ引物延伸试验结果显示，Ｐｐ３５在重组病毒中可产生２套转录本，分别于病毒感染的早期和晚期起始ＨＢｓＡｇ基因的表达．     

BIV—LTR中存在负调控区

为研究ＢＩＶ－ＬＴＲ调控序列的功能，将ＬＴＲ部分ＤＮＡ序列缺失，与荧光素酶基因相连构建质粒ｐＤ－３１９－Ｌｕｃ，ｐＤ－２６１－Ｌｕｃ，ｐＤ－１８１－Ｌｕｃ，Ｐｄ－２－Ｌｕｃ，ｐＤ＋３２－Ｌｕｃ，ｐＤ－３１９－２６１－Ｌｕｃ，ｐＤ－１８１＋３２－Ｌｕｃ。通过磷酸钙共沉淀法将上述质粒及ｐＢＬＴＲ－Ｌｕｃ分别转染小牛肺细胞，检测转染细胞裂解物荧光素酶活性，比较各质粒所克隆的ＢＩＶ－ＬＴＲ表达水平，发现－     

重组PAI—1在大肠杆菌中表达条件的研究及其对t—PA,u—PA…

带有表达质粒ｐＢＶ２２０／ＰＡＩ－１的大肠杆菌中，在菌体密度为Ａ６００ｎｍ＝０．３＝０．４时诱导，表达重组ＰＡＩ－１的效率最高。在诱导后的６ｈ以内，ｒＰＡＩ－１的百分含量持续升高。ｒ－ＰＡＩ－１经分离纯化并用盐酸胍激活后，能够与ｔ－ＰＡ及ｕ－ＰＡ反应，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和纤维蛋白自显影方法可以检测出它们所形成的复合物。     

t-PA在昆虫细胞中的表达

将含完整阅读框架的人ｔ－ＰＡ（ｔｉｓｓｕｅ－ｙｔｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ,ｔ－ＰＡ）ｃＤＮＡ克隆至昆虫细胞表达转移载体ｐＢａｃＰＡＫ８中,获得重组质粒ｐＢａｃ－ｔＰＡ。应用脂质体共转染法,将ｐＢａｃ－ｔＰＡ和线性化杆状病毒ＢａｃＰＡＫ６ ＤＮＡ共转染Ｔｎ－５Ｂ－１昆虫细胞。经空斑筛选获得１１株重组病毒。经ＰＣＲ鉴定与生物活性测定,获得一株高效表达ｔ－ＰＡ的重且病毒ＢａｃｔＰ     

温控表达载体的构建及HIV—1 p24的表达与纯化

通过改造原核表达载体ｐＢＶ２２０和ｐＥＴ２８，构建出了一种新的通用型温控原核表达载体ｐＶＶ５，记载体携带ＰｒＰｌ串联温控启动子以及Ｈｉｓ－Ｔａｇ的纯化标签、利于目的蛋白的表达与纯化。将ＨＩＶ－ ｌｇａｇ基因的１１４８－１８５７编码序列分别插入到ｐＶＶ５ｂ，ｐＥＴ２８ｂ的相应位点，构建了重组表达质粒ｐＥＧ１ｂ，ｐＢＧ７ｂ，二者在不同受体菌中，表达重组蛋白的量分别占全菌体蛋白总量的４２％和２８％。     

人红细胞生成素受体膜外结构域在大肠杆菌中的融合表达及其纯化

将插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ的人红细胞生成素受体ｃＤＮＡ,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶解,分离得到的基因片段,插入到经ＥｃｏＲＩ和ＲａｍＨＩ消解的表达载体ｐＧＥＸ－３Ｘ中,得到重组表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ。重组质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ含有ｔａｃ启动子,ＥＰＯＲ膜外结构域基因５端与谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）编码基因融合,阳性重组子在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ｈＥＰＯＲ,重组表达菌裂解上清液经ＧＳＨ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和柱一步纯化,能除去绝大部分杂蛋白,基本达到纯化的效果。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和免疫杂交分析显示,重组表达产物确系人红细胞生成素受体     

人红细胞生成素受体膜外结构域在大肠杆菌中的融合表达及其纯化

将插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ的人红细胞生成素受体ｃＤＮＡ,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶解,分离得到的基因片段,插入到经ＥｃｏＲＩ和ＲａｍＨＩ消解的表达载体ｐＧＥＸ－３Ｘ中,得到了重组表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ＨＥＰＯＲ。生组质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ含有ｔｑｃ启动子,ＥＰＯＲ膜外结构域基因５’端与谷胱甘肽转移酶编码基因融合,阳性重组子在大肠村菌中经ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ｈＥＰＯＲ,重组表达菌裂解     

小白菜苏云金牙孢杆菌CryIB基因的遗传转化

用限制ＳｐｈＩ和ＥｃｏＲＩ消化质粒ｐＢＹＴＥＳｐ１０１－１和ｐＢＱＸ,将ｐＢＱＸ上的经发行过的苏云金芽直菌杀虫晶体蛋白基因ＣｒｙＩＢ取代ｐＢＹＴＥＳｐ１０１－１上的ＧＵＳ基因,得到一个中间克隆ｐＢＩＷＩＱ－１。用限制酶ＨｉｎｄⅢ消化质粒ｐＢＩＷＩＱ－１,回收含ＣｒｙＩＢ基因的５．１ｋｂＤＮＡ乍段,插入质粒ｐＢＩＮ１９的Ｈｉｎｄ０２８３位点,构建成具卡那霉素抗性的植物表达载体ｐＢＩＷＩＱ－５．ＥＴ     

AcNPV增强子hr5增强HBsAg基因表达的研究

用形成包涵体（ＯＯＣ＋）并能利用人工合成启动序列和多角体ＸＩＶ启动子表达外源基因的转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３将多角体基因、乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢＳＡｇ）基因和苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）的增强子ｈｒ５部分序列同时插入无包涵体的粉纹夜蛾核型多角体病毒ＴｎＮＰＶ－ＳＶＩ－Ｇ基因组中，得到两株高效表达ＨＢｓＡｇ基因又形成包涵体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ３５－ＯＣＣ＋和ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ２６－ＯＣＣ＋．对重组病毒的酶切鉴定、ＤＮＡ斑点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析证实，外源基因及其相应的启动子和增强子序列已正确插入病毒基因组中．插入顺序中，ｈｒ５增强子是插入ＨＢｓＡｇ基因下游，多角体基因与ＨＢｓＡｇ基因方向相反．１２５Ⅰ－固相放射免疫检测和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果表明，ＨＢｓＡｇ基因在昆虫离体细胞中得到高效表达并保留了抗原活性．ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ２６－ＯＣＣ＋和ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ３５－ＯＣＣ＋表达的ＨＢｓＡ吕蛋白与没有插入增强子序列的重组病毒ＴｎＮＰＶ—ＨＢｓ８５－ＯＣＣ＋的比较，分别提高了４０％和４６％．     

卡介苗中具启动子活性片段克隆及分析

利用启动子探针型质粒ｐＫＫ２３２－８从卡介苗染色体ＤＡＮ的ＢａｍＨＩ酶切片段中克隆到４个具启动功能的ＤＮＡ片段,测定各重组子对氯霉素（Ｃｍ）的抗性,其中含３．３Ｋｂ外源片段的重组质粒ｐＢＣＧ２大肠杆菌转化子在ＬＭ培养基上对Ｃｍ抗性可达１７０×１０－６ｇ／ｍＬ,作了该片段的限制性酶切图谱．对ｐＢＣＧ２利用ＳａｌⅠ位点,亚克隆出４种部分重叠的具启动功能的ＤＮＡ片段,这４种重组质粒分别命名为ｐＢＣＧ２－１,ｐＢＣＧ２－２,ｐＢＣＧ２－６和ｐＢＣＧ２－８,并分析了其中插入片段的大小及其转化子对Ｃｍ的抗性．将ｐＢＣＧ２－２的ＳａｌⅠ外源片段插入到分枝杆菌启动子探针型穿梭质粒ｐＥＱ３,获得一个可在卡介苗中表达ｌａｃＺ基因的重组子ｐＥＢ２２．斑点杂交实验证明,具有启动功能的ＤＮＡ片段来源于卡介苗的染色体ＤＮＡ．结果表明克隆到一个对大肠杆菌和卡介苗均具启动子活性的ＤＮＡ片段     

人胰岛素样生长因子—I的基因克隆融合表达及产物纯化

利用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）方法,以ＩＧＦ－ＩｃＤＮＡ为模板,扩增ＩＧＦ－Ｉ的基因,在序更测定确证后,将其定向克隆到载体ｐＥｘＳｅｃｌ上,构建了ＩＧＦ－Ｉ融合表达载体ｐＥｘＩＧＦ,经ＩＰＴＧ诱导表达后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明：含有重组表达质粒的菌株可表达出约３２．５８％的６ＫＤ融合蛋白,且主要以可溶性形式存在。经ＩｇＧ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析一步纯化后,可获得纯度的９０％的融合蛋白,经Ｗｅｓ     

人胎盘催乳素在大肠杆菌中的表达

用ＰＣＲ方法扩增人胎内乳素（ｈＰＬ）ｃＤＮＡ得到５９７ｂｐ的片段,在其两端加上了合适的酶切位点及起始、终止密码子,钭其与高效表达载体ｐＢＶ２２０重组连接,转入大肠杆菌ＤＨ５α,得到稳定遗传的重组质粒转化子ｐＢＶ－ｈＰＬ。ｐＢＶ－ｈＰＬ菌株经热诱导后,有２２ｋＤ的蛋白表达,表达量占菌体总蛋白的１２．９４％,ｈＰＬ表达蛋白以包涵体形式存在,复性处理后,得到有生物活性的成熟蛋白。     

电击法转移含人凝血因子IX基因重组质粒的影响因素

反转录病毒载体在基因治疗中可能会产生野生型病毒颗粒而引起安全性问题，本文研究含ＦＩＸｃＤＮＡ重组质粒基因治疗血友病Ｂ的可能，构建了不具反转录病毒载体结构的两重组质粒ｐＳＣＩＸＴＮ和ｐＣＩＸＴＮ，前者合ＳＶ４０早期启动子和ｈＣＭＶ启动子共同控制的ＦＩＸｃＤＮＡ，后者仅含ｈＣＭＶ启动于控制的ＦＩＸｃＤＮＡ，它们都含有ＴＫ启动于驱动的ｎｅｏ基因，通过电击法将基因转移到ＰＡ３１７和ＨＴ１０８０细胞，在ＨＴ１０８０细胞中的ＦＩＸ表达量分别为２２０、２１２ｎｇ／（１０６细胞·２４ｈ）通过与ｐＣＭＶＩＸ共转染靶细胞，可以增加人ＩＸ因子表达１．５～３．５倍，显示了用质粒载体转染靶细胞在血友病Ｂ基因治疗中是一条潜在可行的途径．本项研究用自制的电击仪转移ＰＡ３１７和ＨＴ１０８０等细胞，最高的转移效率达１０－３，并探讨了细胞种类，ＤＮＡ量，ＤＮＡ结构，电压，脉冲时间与转移效率及表达量的关系．     

用LBA4404／pcAMBIA系列转化水稻的最佳条件

用带有ｇｕｓ报告基因的农杆菌ＬＢＡ４４０４／ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１转化水稻品种鄂宜１０５成熟胚诱导的愈伤组织,以ｇｕｓ基因瞬间表达活性为指标测定转化率频率,对于利用ｐＣＡＭＢＩＡ表达载体系列进行水稻遗传转化的最佳条件进行了初步的研究。结果表明：最适菌液浓度值为Ｄ（６００）＝１．０,最适共培养温度为２２－２８℃;共培养培养基的ｐＨ值为５．２－６．２这一较宽的范围内均可。     

人血管生成抑制素基因在大肠杆菌中的融合表达

将人血管生成抑制素基因定向插入表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的ＢａｍＨⅠ位点,构建重组质粒ｐＥＴＡ２,转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）．在ＩＰＴＧ诱导下,血管生成抑制素基因在重组转化株Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３,ｐＥＴＡ２）中获得高效表达．表达产物以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的３７．２％．利用羊抗人纤溶酶原抗血清作为第一抗体,免疫印迹分析证明表达产物具有特异的免疫原性