利用质谱技术鉴定寨卡病毒非结构蛋白NS1的细胞内相互作用蛋白

寨卡病毒(Zika Virus)属于黄病毒科中的黄病毒属,虽然很早就已经被人类所发现,但是一直到2015年在南美巴西的大规模爆发,才引起了广泛的关注.寨卡病毒对人类的感染往往引起包括小头畸形和格林-巴利综合征在内的多种症状.寨卡病毒的基因组为单链正链RNA,其基因组可以编码翻译并剪切加工出3个结构蛋白,分别为膜蛋白,囊膜蛋白和核衣壳蛋白,以及7个非结构蛋白(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5).相关研究已经证明,NS1蛋白与同属黄病毒属的登革病毒的发病有紧密的联系,而且根据其蛋白结构推测其可能与寨卡病毒穿越血脑屏障有关.因此鉴别NS1与细胞内的相互作用蛋白对于发现寨卡病毒在细胞内的转运,转录,以及装配都有重大的意义.在此,该课题构建并在HEK293细胞中表达包含Flag和Strep两种标签的NS1融合蛋白,通过免疫沉淀的方法将与NS1结合的蛋白利用标签蛋白进行分离,利用高分辨生物质谱技术,对蛋白进行分析鉴定.通过分别带有Flag与Strep标签的相互作用蛋白分析,发现了16个两种标签共同的结合蛋白,其进一步的通路分析证明这些蛋白于与病毒转录、病毒复制和免疫反应多个通路有关,相关的研究结果为今后进一步研究寨卡病毒的复制机制以及开发抗病毒药物提供了重要的参考价值.     

以寨卡病毒NS3解旋酶为靶点的海洋天然产物库的虚拟筛选与成药性评价

寨卡病毒病自2015年在巴西等南美洲国家爆发后,已成为影响全球公共卫生的重大问题,但至今仍无可用于治疗该病的获批特效药.运用基于结构的药物虚拟筛选技术,以寨卡病毒NS3解旋酶的2个最新报道的结合位点为口袋,通过海洋天然产物库进行分子对接,初步得到divanchrobactin、bromophenol、2-hydroxy-1′-methylzeatin、garveatin E、aromatic polyketides、dimeric terrestrols等10个化合物,它们能很好地靶向寨卡病毒NS3解旋酶,从而可能成为对寨卡病毒病具有潜在治疗作用的海洋天然产物.同时,利用薛定谔软件套装中的ADMET预测模块对结合较好的化合物展开初步的成药性评价,发现除Divanchrobactin有较严重的成药性问题外,其他化合物均满足药物开发的基本要求,这为后期的实验研究提供了理论基础.     

寨卡病毒可能与出生缺陷高度相关

正据报道,巴西新生儿缺陷的数量正在显著增加。寨卡病毒(Zika)被初步认为与新生儿脑损伤的发生有关,该病毒在世界范围内的传播引发了越来越多的关注。2016年1月底,世界卫生组织(WHO)发出警告称:2016年末寨卡病毒很可能蔓延至美国大部分地区。WHO此项公告一经发布,立即引起媒体广泛关注和热议:美国是否应该对来自巴西以及其他拉丁美洲国家疫区的寨卡病毒疑似感染者进行保护性隔离措施?     

寨卡正在蔓延

正非洲的埃博拉疫情还没有完全结束,美洲就出现了一种虫媒病毒的暴发流行,这种虫媒病毒为寨卡病毒(Zika Virus)。2014年2月,智利在复活节岛发现了寨卡病毒感染的首位本土病例。2015年5月,巴西开始出现寨卡病毒感染疫情。截至2016年1月26日,有24个国家和地区有疫情报道,其中22个在美洲,目前欧洲多国也有报道,有蔓延全球之势。什么是寨卡病毒?寨卡病毒是一种通过蚊虫进行传播的虫媒病毒,宿主不明确,主要在野生灵长类动物和栖息在树上的蚊子,如非洲伊蚊中循环。     

美国启动寨卡疫苗临床试验

正自2015年中以来,寨卡病毒感染在巴西等美洲国家持续肆虐。尽管大多数感染者症状温和,但寨卡病毒导致的新生儿小头畸形和其他出生缺陷等问题也使公众人心惶惶(参见本刊2016年第7期"科学触角"中的"阻击寨卡病毒!"一文)。2016年8月3日,美国宣布启动一种试验性     

美洲等多地区暴发寨卡疫情

正非洲的埃博拉疫情还未结束,美洲地区又出现了寨卡病毒(Zika virus)的暴发流行。2015年5月,巴西发现首例本地感染病例,至2015年11月,巴西的寨卡病毒疑似感染病例已达约44万~130万。截至2016年1月20日,美洲地区已有20个国家和地区向泛美卫生组织(PAHO)报告了本国发生的本土传播病例,其余各国也均在密切监视着疫情的传播。截至2016年2月9日,我国也已出现3例寨卡病毒输入病例,均由广东口岸入境,我国台湾也出现了输入病例。     

文化播报

正里约奥运会可能会受到"寨卡"病毒的影响世界卫生组织日前发布一则消息称,由埃及伊蚊为主要传播媒介的"寨卡"病毒有可能席卷整个美洲大陆,只有极少数国家能幸免。有分析说,即将在巴西里约热内卢举行的2016年夏季奥运会恐怕将受到影响。据报道,"寨卡"病毒1947年出现在非洲大陆,非洲、东南亚地区和太平洋一些岛屿曾出现过"寨卡"疫情。"寨卡"病毒通过蚊虫叮咬在人和动物间传播,属于人畜共患疾病,引起的人类疾病被称为"寨卡热",     

“寨卡”成全球紧急公共卫生事件

 西非埃博拉疫情蔓延的阴云还未完全散去,寨卡病毒又如暴风骤雨般袭击了美洲大陆。2016年2月1日,世界卫生组织召开紧急会议,宣布寨卡病毒的暴发和传播已经构成全球突发公共卫生事件。此时,距该组织宣布埃博拉疫情为国际卫生紧急事态仅仅过去一年半的时间。与前者相比,寨卡病毒似乎更为温和,鲜有致死病例,但它与新生儿小头症和其他神经系统并发症"非同寻常"的联系,更加引人忧心。     

阿奇霉素有助抑制胎儿脑细胞感染寨卡

正美国研究人员11月29日发表最新报告说,寨卡病毒倾向于感染细胞膜表面带有一种特定蛋白的脑细胞,并发现阿奇霉素这种常用抗生素能抑制实验室培养的脑细胞感染寨卡病毒。加利福尼亚大学旧金山分校研究人员在美国《国家科学院院刊》网络版报告说,发育4到6个月的胎儿大脑中,寨卡病毒会优先感染含大量AXL蛋白的脑细胞。AXL蛋白位于细胞膜上,是寨卡病毒入侵细胞的突破口。研究发     

传统抗原、重组抗原检测啮齿类动物病毒的ELISA法敏感性和特异性

酶联免疫吸附试验 (ELISA)是一种常用的检测啮齿动物血清病毒抗体的方法。用于检测血清抗体的抗原可是用常规方法制备的全病毒或是在原核或真核系统中表达的重组抗原蛋白。利用杆状病毒表达系统已获得细小病毒、沙粒样病毒和冠状病毒的带有His标记的重组病毒抗原。重组抗原在昆虫细胞中表达裂解后 ,可用色谱法提纯。提纯的抗原用来包被 96孔ELISA板。用细小病毒非结构蛋白 (NS 1) ELISA法检测啮齿动物血清 ,在检测的 345 7份样本中有 88份 (2 5 % )NS 1抗体阳性 ,9份 (0 3% )为非特异性反应。虽然NS 1ELISA检测NS 1抗体具有…     

寨卡病毒“很可能”在美国本土传播

正经过近两周的调查,美国卫生部门近日宣布,在美国佛罗里达州发现的四个"可能与旅行无关"的寨卡病例可能是本土蚊虫叮咬所致。这意味着寨卡病毒"很可能"已在美国本土传播。佛罗里达州卫生部门表示,从已获得的信息中可以得出结论,在该州迈阿密—戴德县及毗邻的布劳沃德县发现的四个寨卡病例"很可能是本土传播的结果"。尽管尚未发现携带寨卡病毒的蚊虫,但相信寨卡病毒的活跃传播暂时只是在迈阿密—戴德县     

文化播报

正孕妇感染寨卡病毒有可能诞下小头症婴儿据外媒报道,医学期刊《柳叶刀》近期刊登的一项研究表明,孕期前三个月感染寨卡病毒的孕妇有诞下小头症婴儿的风险。据报道,该项研究分析了法属波利尼西亚2013年至2014年爆发的寨卡疫情。研究人员经过比对和建模,估算出孕期前三个月     

资讯

正世卫组织:寨卡疫苗临床试验至少还需18个月世界卫生组织2月12日通报说,寨卡病毒与小头症之间的关系有望于数周内得以确认,目前美国和印度研制的两种寨卡疫苗进展最为理想,但开启大规模临床试验至少还需18个月。关于寨卡病毒与新生儿小头症之间的关联,世卫组织助理总干事玛丽-波勒·基尼说,越来越多的证据显示,这种联系的可能性越来越高,不过还需要数周时间和更多研究来确认这一关联。据介绍,     

阻击寨卡病毒!

正2015年中以来,寨卡病毒感染在南美洲爆发,并在全球范围蔓延。与之前比较温和的病情相比,2015~2016年的美洲疫情爆发尤为值得警惕。鉴于该病毒在全球流行的严重性,而奥运会即将在巴西举行,WHO将寨卡病毒感染宣布为"国际关注的突发公共卫生事件"。2016年4月,美国疾病控制与预防中心首次声称寨卡病毒感染很可能是导致小头畸形和其他出生缺陷的主要原因。全世界众多研究机构都在加倍努力,以确认婴儿出生缺陷与孕妇感染寨卡病毒的关联性。2016年5月     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3/4A的研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3共有631个氨基酸组成,具有丝氨酸蛋白酶、三磷酸核苷酶(NTpase)和螺旋酶(Helicase)的功能,在HCV多聚蛋白的成熟和病毒复制过程中发挥着重要作用.非结构蛋白NS4A,其主要功能就是作为NS3丝氨酸蛋白酶的辅助因子,在HCV多氨酸成熟过程中发挥着不可替代的调节作用.此外,NS3/4A还参与NS5A的超磷酸化修饰过程.     

贫穷是病毒肆虐的根源 寨卡揭开拉美社会痼疾

正有专家指出,铺展拉美各地的贫民窟同样是病毒传播的温床,政府若没有逐步改善底层民众恶劣的居住环境的远略,就很难从根本上堵住寨卡或类似传染病的传播渠道。近来一项调查显示:很多拉美人都怀疑他们国家的公共健康体系没有能力遏止寨卡病毒,可他们仍旧愿意信从政府的建议,近期减少怀孕的几率。越严重,越低迷在美洲肆虐的寨卡病毒与近来巴西小头症病例的     

应用定点突变技术进行流感病毒NS1蛋白功能的研究

目的流感病毒NS1基因敲除毒株(delNS1毒株)的获得可以使我们建立更有效的生物学关系,主要表现在流感病毒繁殖周期和致病的过程中,流感病毒NS1蛋白和双链RNA活性蛋白激酶(PKR)之间的生物学关系.资料表明,缺少功能性的PKR可以使delNS1毒株在其他非允许宿主中繁殖,这表明流感病毒NS1蛋白的主要功能是对抗或阻止PKR调解抗病毒效应.因此,本实验为了证明流感病毒NS1蛋白对其复制和毒力的影响.方法应用定点突变技术进行流感病毒NS1基因的第38位和第41位氨基酸残基位点的定点突变;然后进行细胞转染包装成新的缺陷病毒;再对其进行转染后产量的测定,如TCID50和PFU.结果包装成的缺陷病毒与包装成的非缺陷病毒相比,缺陷病毒的TCID50和PFU明显下降.结论本实验证明了流感病毒NS1蛋白在流感病毒复制过程中,使其产量和毒力下降.     

致病性不同的两种流感病毒NS1蛋白对人源细胞IFN-β转录抑制的比较

A型流感病毒编码的NS1蛋白是病毒关键的致病因子,可以通过多种机制拮抗宿主抗病毒反应.病毒感染过程中,NS1通过抑制NF-κB和IRF3两种转录因子的活性,下调IFN-β转录水平以阻断其诱导的信号通路.实验选取病毒母本致病性不同的两种NS1蛋白(NS1-a,NS1-h),通过RT-PCR、报告基因和VSV病毒滴度等实验证明高致病性禽流感病毒NS1-a与普通人流感病毒NS1-h相比,表现出较强的抑制IFN-β转录能力,并有效帮助VSV病毒复制.此差异源于NS1-a更加有效抑制NF-κB活性以及IRF3激活后的入核行为,与IFN诱导的ISG转录无关.所得结果为阐释流感病毒致病性与NS1的密切关系提供线索.     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及原核表达

克隆、表达和纯化禽流感病毒H5N1 NS1基因序列,为筛选与NS1相互作用的宿主蛋白以及深入研究NS1蛋白的功能打下基础.根据GenBank中收录的H5N1亚型禽流感病毒NS1基因序列,设计并合成一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增AIV NS1基因,将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体pET-28a载体上,经酶切分析及序列测定正确后,鉴定出NS1基因的阳性重组子.阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用1 mmol/L IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE检测,获得预期蛋白的表达,通过Ni-NTA树脂蛋白纯化系统对NS1蛋白进行纯化.结果成功克隆H5N1亚型AIV的NSl基因,其核苷酸序列长度为678 bp,重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,表达产物在上清及包涵体中均有表达.经纯化,目的蛋白纯度高达90%,成功表达纯化出28KD的NS1融合蛋白并鉴定其免疫学活性.成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 NS1基因序列,为进一步研究NS1蛋白的生物学功能奠定了坚实基础.     

“病毒终结者”侯云德

正1.SARS、甲流、寨卡……我们对病毒"谈虎色变"。为了不让"猛虎"伤人,中国工程院院士侯云德与病毒斗了一辈子,织出一张结实的病毒防御网,被誉为"病毒终结者"。2.1929年7月,侯云德出生于江苏。幼年时,传染病无情地夺去了哥哥的生命,侯云德很伤心,立志要学医。因家境贫困,他10岁就半工半读,摆过摊、捕过鱼、养过鸡……